抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备与应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201711141870.0	申请日：	20171114
公开号：	CN107982533A	公开日：	20180504
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A61K41/00,A61K45/00,A61K47/58,A61K47/64,A61K47/61,A61P35/00	主分类号：	A61K41/00,A61K45/00,A61K47/58,A61K47/64,A61K47/61,A61P35/00
申请人：	中国药科大学
发明人：	霍美蓉,殷婷婕,梁金来
地址：	211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道639号
优先权：	CN201711141870A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明属于药物制剂领域，公开了一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备和药学应用。以阳离子聚合物为骨架，修饰两性离子甜菜碱单体以减弱聚合物对生物体内蛋白的吸附；进一步对该中间体修饰含缺氧应激偶氮苯结构的疏水连接臂和光敏剂，构建两亲性聚合物载体。该阳离子修饰物在水溶液中自组装形成纳米粒，可直接应用于光动力治疗，也可用于负载疏水性化药、或核酸类药物，应用于光动力和抗肿瘤药物联合治疗。本发明利用光敏剂光动力治疗构建高度乏氧肿瘤微环境激发纳米解组装，进而促进药物释放提高其利用率，并通过光动力活性氧的产生增敏抗肿瘤药物疗效，实现肿瘤高效协同治疗。

权利要求书

1.一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于该载体以阳离子聚合物为骨架首先引入两性离子甜菜碱单体，进一步偶联含有缺氧敏感偶氮苯结构的疏水分子以及光敏剂，该阳离子衍生物具有两亲性，在水中可自组装形成纳米粒，可有效负载药物；甜菜碱两性离子结构有效降低纳米粒的蛋白吸附率及细胞膜相互作用，能减少其网状内皮系统(RES，reticulo-endothelialsystem)吞噬率，延长纳米粒血循环时间，有益于纳米粒肿瘤被动靶向作用；纳米粒靶向蓄积肿瘤组织后，经激发光照射，纳米粒中光敏剂消耗微环境氧气产生单线态氧实现光动力学治疗；纳米粒偶氮苯结构响应高度乏氧微环境被还原断裂，纳米粒解组装促进其负载的药物释放，显著提高病灶区药物浓度和生物利用度，并且联合光动力治疗产生协同抗肿瘤效果；该阳离子衍生物结构通式如下：D-CLP-(AZO+PS)其中所述的CLP分子量600～100000D；接枝率为共价偶联到阳离子聚合物的分子与聚阳离子的总氨基摩尔百分比；D为甜菜碱结构单体；n为阳离子聚合物上甜菜碱单体的接枝率，所述的甜菜碱单体接枝率为5％-80％；AZO为含偶氮苯结构的连接臂分子，m为阳离子聚合物上AZO的接枝率，所述偶氮苯的接枝率为5％-80％；PS为光敏剂，r为阳离子聚合物上接枝PS的接枝率，所述光敏剂的接枝率为1％-15％。 2.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于聚阳离子选自聚氧乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖。 3.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于甜菜碱结构母核选自羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱。 4.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于含缺氧敏感偶氮苯结构的连接臂分子选自4-苯偶氮基苯酚、4-氨基-偶氮苯、4-氨基-2，3-二甲基偶氮苯，偶氮苯甲酸、偶氮苯乙酸、偶氮苯-4，4′-二羧酸、偶氮苯甲酰氯、偶氮苯乙酰氯、偶氮苯-4，4′-二羰酰氯。 5.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于光敏剂选自原卟啉、吲哚青绿、美叶绿酸a、紫红素18、二氢卟吩及其羟基、羧基衍生物。 6.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于制备方法包括下列步骤：(1)通过迈克尔加成或酰胺化反应将含甜菜碱结构的分子修饰聚阳离子得到衍生物D-CLP；(2)含缺氧敏感偶氮苯结构的连接臂分子经活化剂活化其羧基或直接用其酰氯基团与D-CLP聚合物的游离氨基通过酰胺化反应偶联得到D-CLP-AZO；(3)光敏剂分子的羧基经活化剂活化与D-CLP-AZO聚合物的游离氨基通过酰胺化反应偶联得到：D-CLP-(AZO+PS)。 7.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其可物理负载的药物包括喜树碱类、紫杉烷类、蒽醌类、蒽环类、长春碱类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、黄铜类抗肿瘤化药；质粒、siRNA、shRNA、Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA等核酸类药物。 8.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其具有两亲性，在水介质中自组装形成纳米粒，可负载化疗药物，并采用下列方法中任意方法制备得到：(1)将抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水中，得到聚合物纳米粒；将化药用药学可接受有机溶剂溶解，与前述聚合物纳米粒溶液混合得到预制备溶液；将预制溶液经超声或高压均质法处理后，采用透析、超滤或者蒸发除去有机溶剂，制得粒径为30-300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒；(2)抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体与药物溶于药学可接受有机溶剂，经减压蒸发于瓶壁形成薄膜后，以水搅拌复溶或分散，经过超声或高压均质处理，制得粒径为30-300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。 9.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于还可负载核酸类药物，相应载药纳米粒采用下列方法制备得到：取适量的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水性介质中，将该溶液与含核酸药物的溶液通过吹打或涡旋混合，然后室温孵育一定时间即制得载核酸药物的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子纳米粒。 10.如权利要求6和权利要求8所述抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮或其中任意两种溶剂的混合溶剂；药学可接受有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或者他们的混合溶剂。

说明书

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子聚合物作为药物递送载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。

背景技术

光动力学疗法(Photodynamic therapy，PDT)是一种重要的非入侵性治疗手段，已被应用于肿瘤治疗临床应用；是一种联合利用光敏剂、氧气分子、光，利用光敏剂吸收特定波长的光后为激发态分子，与氧气反应生成单线态氧，能有效杀死肿瘤细胞。PDT已逐渐成为继手术、放疗和化疗之外治疗肿瘤的第四种微创疗法。与其他传统抗肿瘤治疗法对比，PDT有很多优势如癌细胞特异性；光敏剂分子安全、不抑制人的免疫功能；不易产生耐药性。但多数光敏剂难溶于水，其本身疏水性以及π-π堆积，它在水溶液中容易聚集，导致荧光淬灭，单线态氧(1O2)产生效率降低，最终影响光动力治疗的效果；另外大部分光敏剂分子本身于体内分布无选择性，可能诱发正常组织的毒性，也不利于PDT治疗。纳米递送系统可以增强药物的靶向性、提高药物稳定性；减轻药物于正常组织的毒副作用；提高药物的生物利用度。因此利用纳米递送体系的优势，有望有效解决光敏剂体内稳定转运、靶向递送利用率低等难题，提高PDT疗效。目前纳米技术递送光敏剂到靶向组织主要有两种方式，一是纳米粒(如脂质体、胶束)物理包裹光敏剂，利用EPR效应纳米粒携带光敏剂被动靶向蓄积于肿瘤组织，提高PDT治疗效果；二是光敏剂化学偶联到载体后，纳米粒将其靶向递送至肿瘤部位。纳米粒物理负载光敏剂，虽然提高了光敏剂肿瘤靶向性，但可能存在光敏剂泄露问题；而光敏剂化学偶联到载体上，则能够提高光敏剂的稳定性并避免物理泄露，光稳定性更佳。

此外，目前为了提高肿瘤治疗效果，多种研究将PDT与药物治疗联合应用。[Yue et al. ROS-Responsive Mitochondria-Targeting Blend Nanoparticles：Chemo-and Photodynamic Synergistic Therapy for Lung Cancer with On-Demand Drug Release upon Irradiation with a Single Light Source.Theranostics.2016 Oct 1；6(13)：2352-2366]文献中设计线粒体靶向的活性氧 (ROS)敏感的纳米递送体系，该载体利用ROS敏感键缩硫酮为连接臂将化药喜树碱与聚乙二醇化学连接，再引入线粒体靶向物质三苯基膦，形成嵌段共聚物TL-CPT-PEG1K-TPP；该嵌段共聚物再与磷脂聚乙二醇(DSPE-PEG)混合形成的纳米递送体系，再物理包裹光敏剂酞菁锌。633nm激光照射，酞菁锌产生ROS，连接臂缩硫酮断裂，释放化药，与光敏剂实现化疗和光动力学治疗的联合治疗作用，提高抗肿瘤作用。[Wang et al.Combined Cancer Therapy with Hyaluronan-Decorated Fullerene-Silica Multifunctional Nanoparticles to Target Cancer Stem-Like Cells.Biomaterials.2016 Aug；97：62-73]文献中利用透明质酸修饰富勒烯二氧化硅纳米粒，再物理负载化疗药物阿霉素和光敏剂吲哚菁绿，靶向作用于乳腺癌干细胞，实现化疗、光动力、光热治疗的联合治疗，提高肿瘤治疗效果。

虽然PDT与化疗联合应用，能够提高治疗效果，但目标纳米递送载体将药物共递送到靶向部位后，还存在药物释放缓慢的问题。缺氧是多数实体肿瘤的特征之一；肿瘤缺氧微环境维持肿瘤的生长，致使肿瘤细胞对治疗的耐受性增强，易复发，因而不利于肿瘤治疗。相较于肿瘤组织，正常组织中很少存在缺氧区域，人们利用肿瘤组织与正常组织中氧含量的显著差别，设计缺氧敏感的纳米药物递送系统，期望在肿瘤组织释放药物实现靶向治疗，所以缺氧微环境也为肿瘤的靶向治疗提供了有利条件。偶氮苯结构在缺氧环境中可被还原，结构中的偶氮键断裂，利用疏水的偶氮苯结构修饰亲水高分子材料可设计缺氧触发释药功能的靶向自组装纳米粒。

阳离子聚合物，一直是有效基因转染载体的重点研究对象之一，因结构中含有大量游离氨基便于化学修饰，因此在药剂学中常被作为高分子骨架修饰成药物递送载体，其递送范围不仅包括化药，更包括阴离子核酸类药物。但阳离子聚合物普遍具有高表面正电、较高的细胞毒性，血循环时易吸附血内成分，稳定性差且易被RES系统识别清除。因此，大量研究致力于阳离子聚合物表面改性以期提高其生物相容性，降低其毒性，提高血循环稳定性和循环时间。常见表面修饰如聚乙二醇(PEG)化，能降低表面电荷并且增加空间位阻，减弱载体与蛋白的相互作用，提高生物相容性，延长材料在体稳定性和循环时间。然而，PEG多次应用后，会引起明显的体液免疫反应，通过B细胞分泌的中和抗体结合PEG后，经过PEG修饰的载体会被吞噬细胞识别和清除，其血液半衰期显著缩短，即PEG具有ABC(acceleratedblood clearance)效应。甜菜碱能调节体内渗透压，可作为甲基供体，并能促进脂肪代谢等。其化学名称为三甲基甘氨酸，属两性离子；具有超亲水特性能有效抑制载体与蛋白或细胞膜发生相互过强的作用，载体的蛋白吸附能力和溶血性均显著下降，能够避免RES的吞噬和肾脏的排泄，延长其修饰的纳米体系在体内的血循环时间，且不具有PEG类似的多次给药后对体液免疫反应的激发。因此，我们提出利用比PEG更为优异的具抗蛋白吸附能力的两性离子甜菜碱结构对阳离子聚合物进行表面修饰，以达到提高其抗蛋白吸附能力和降低细胞毒性的目的。

发明内容

本发明的目的是针对以上技术问题和启示，提供一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体。该载体是以阳离子聚合物为骨架，修饰两性离子甜菜碱单体以减弱聚合物对生物体内蛋白的吸附；进一步对该中间体修饰含缺氧应激偶氮苯结构的疏水连接臂和光敏剂，构建目标两亲性聚合物载体。该阳离子修饰物在水溶液中自组装形成纳米粒，可直接应用于光动力治疗，也可用于负载疏水性化药、或核酸类药物，应用于光动力和抗肿瘤药物联合治疗。该纳米粒通过静脉注射被动靶向肿瘤部位产生疗效：(1)甜菜碱改性的两亲性阳离子纳米粒其蛋白吸附率和被RES捕获的效率较无甜菜碱修饰的阳离子聚合物显著降低，血循环时间显著提高；(2)该纳米体系粒径分布于30-300nm，利用EPR靶向蓄积于肿瘤；(3)肿瘤组织在一定激发波长照射下，纳米粒光敏剂消耗微环境氧气激发光动力治疗；(4)偶氮苯链接臂响应高度乏氧微环境被还原断裂，纳米粒解组装促进其包载的疏水性化药或阴离子核酸药物释放。本发明利用光敏剂光动力治疗加重肿瘤乏氧微环境激发纳米解组装，进而促进药物释放提高其利用率，并通过光动力活性氧的产生增敏抗肿瘤药物疗效，实现肿瘤协同治疗。

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。

为达到上述目的，本发明提供一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其结构通式如下：

Dn-CLP-(AZOm+PSr)

其中所述的CLP为聚阳离子，分子量600～100,000D；接枝率为共价偶联到阳离子聚合物的分子与聚阳离子的总氨基摩尔百分比；D为甜菜碱结构单体，n为阳离子聚合物上甜菜碱单体的接枝率，所述的甜菜碱单体接枝率为5％-80％；AZO为含偶氮苯结构的连接臂分子， m为阳离子聚合物上AZO的接枝率，所述偶氮苯的接枝率为5％-80％；PS为光敏剂，r为阳离子聚合物上接枝PS的接枝率，所述光敏剂的接枝率为1％-15％。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于聚阳离子选自聚氧乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于甜菜碱结构母核选自羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于含缺氧敏感偶氮苯结构的连接臂分子选自4-苯偶氮基苯酚、4-氨基-偶氮苯、4-氨基-2，3-二甲基偶氮苯，偶氮苯甲酸、偶氮苯乙酸、偶氮苯-4，4′-二羧酸、偶氮苯甲酰氯、偶氮苯乙酰氯、偶氮苯-4，4′-二羰酰氯。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于光敏剂选自原卟啉、吲哚青绿、美叶绿酸a、紫红素18、二氢卟吩及其羟基、羧基衍生物。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于采用下列步骤制备得到：

(1)甜菜碱修饰聚阳离子衍生物(D-CLP)，采用下列方法中任意方法制备得到：

a.将聚阳离子溶于反应溶剂中，加入甜菜碱单体，进行迈克尔加成反应，室温反应2-3 天，透析，冻干，得到甜菜碱修饰聚阳离子衍生物。

b.将聚阳离子和甜菜碱单体溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1- 羟基苯并三唑(HOBt)或N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N， N-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行酰胺反应，透析，冻干制得甜菜碱修饰聚阳离子衍生物。

(2)偶氮苯修饰甜菜碱-CLP衍生物(D-CLP-AZO)，采用下列方法中任意方法制备得到：

a.将偶氮苯溶于反应溶剂，再以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt) 或N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N，N-二环己基碳二亚胺(DCC) 和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行酰胺反应；将D-CLP溶于反应溶剂中，加入偶氮苯溶液中，反应48-72h，旋蒸除去反应溶剂，用水稀释，透析48-72h，冻干得到D-CLP-AZO。

b.将D-CLP和偶氮苯酰氯溶于反应溶剂中，室温反应24-72h，透析，冻干制得偶氮苯修饰甜菜碱-CLP衍生物。

(3)光敏剂修饰D-CLP-AZO衍生物(D-CLP-(AZO+PS))的制备：

将光敏剂溶于反应溶剂中，再以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt) 或N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N，N-二环己基碳二亚胺(DCC) 和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行反应，D-CLP-AZO溶于反应溶剂后，加入光敏溶液中，反应24-72h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的光敏剂修饰Dn-CLP-AZOm衍生物 (Dn-CLP-(AZOm+PSr))

所述的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激聚阳离子载体，其特征在于具有两亲性，在水介质中自组装形成纳米粒，可物理负载化疗药物或吸附核酸类药物。物理负载的药物可选自喜树碱类、紫杉烷类、蒽醌类、蒽环类、长春碱类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、黄铜类抗肿瘤化药；吸附的核酸类药物可选自基因、siRNA、shRNA、Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其物理荷载化药的纳米粒采用下列方法中任意方法制备得到：

(1)将抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水中，得到聚合物纳米粒；将化药用药学可接受有机溶剂溶解，与前述聚合物纳米粒溶液混合得到预制备溶液；将预制溶液经超声或高压均质法处理后，采用透析、超滤或者蒸发除去有机溶剂，制得粒径为30-300nm 的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。

(2)抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体与药物溶于药学可接受有机溶剂，经减压蒸发于瓶壁形成薄膜后，以水搅拌复溶或分散，经过超声或高压均质处理，制得粒径为 30-300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。

所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于还可负载核酸类药物，相应载药纳米粒采用下列方法制备得到：

取适量的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水性介质中，将该溶液与含核酸药物的溶液通过吹打或涡旋混合，然后室温孵育一定时间即制得载核酸药物的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子纳米粒。

所述抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮或其中任意两种溶剂的混合溶剂；药学可接受有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或者他们的混合溶剂。

本发明提供的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒具有下列优点：

通过简单的化学反应在阳离子聚合物上接枝了三个功能性小分子；其中小分子甜菜碱单体具有抗蛋白吸附作用的两性离子，降低减弱阳离子聚合物对蛋白的吸附能力和溶血能力，延长体系血液循环时间，促进纳米体系在肿瘤蓄积，从而提高抗肿瘤作用；小分子光敏剂的引入可使得载体应用于光动力学治疗，并可以加重病灶微环境乏氧；含偶氮苯结构的连接臂可赋予载体疏水载药微区以及缺氧敏感性。本发明提供的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒结合偶氮苯结构缺氧条件下还原断裂以及光敏剂发挥光动力学治疗时的耗氧本质，利用光激发PDT的同时促发纳米解组装，加速药物释放，增强协同抗肿瘤效果。

附图说明

图1为实施例7D14％-PEI和D14％-PEI-AZO20％聚合物结构鉴定氢谱图

图2为实施例15抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的巨噬细胞RAW 264.7摄取实验结果图

图3为实施例16光动力治疗后乳腺癌4T1细胞存活率的图片

图4为实施例16光动力治疗后乳腺癌4T1细胞存活率的图片

具体实施方式

实施例1磺基甜菜碱修饰的PEI衍生物的制备

将0.4g PEI(MW 1800)溶于甲醇溶液，加入0.27g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝ 1kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-PEI衍生物(D14％-PEI)。

实施例2羧基甜菜碱修饰的聚赖氨酸衍生物的制备

将0.5g聚赖氨酸(MW 10000)溶于N，N-二甲基甲酰胺和甲醇(v/v＝1∶1)的混合溶液中，加入0.34g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝3.5kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-聚赖氨酸衍生物(D20％-PLL)。

实施例3磺基甜菜碱修饰羟乙基壳聚糖衍生物的制备

将0.1g羟乙基壳聚糖溶于二甲亚砜和甲醇(v/v＝1∶3)的混合溶液中，加入0.59g磺基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO＝14kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖衍生物(D30％-HECS)。

实施例4磺基甜菜碱-PEI-4，4′-二羧酸偶氮苯中间体的制备。

将0.1g 4，4′-二羧酸偶氮苯溶于水和甲醇(v/v＝1∶3)的混合溶液中，再加入6倍当量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)；将0.1g D-PEI衍生物溶于水中，加入4，4-二羧酸偶氮苯溶液中，反应48h，旋蒸除去吡啶，用水稀释，透析 (MWCO＝1kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的羧基甜菜碱-PEI-4，4′-二羧酸偶氮苯中间体 (D14％-PEI-AZO20％)。

实施例5羧基甜菜碱-聚赖氨酸-偶氮苯甲酸中间体的制备

将0.1g偶氮苯甲酸溶于水和DMF(v/v＝1∶3)的混合溶液中，再加入5倍当量的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)；将0.1g D-PLL溶于水中，加入偶氮苯甲酸溶液中，反应48h，透析(MWCO＝3.5kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的羧基甜菜碱-聚赖氨酸-偶氮苯甲酸中间体(D20％-PLL-AZO25％)。

实施例6磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯-4，4′-二羰酰氯中间体的制备

将0.1g偶氮苯-4，4′-二羰酰氯溶于水和DMSO(v/v＝1∶2)的混合溶液中；将0.1g甜菜碱-羟乙基壳聚糖衍生物溶于水中，加入偶氮苯-4，4′-二羰酰氯溶液中，反应12h，用N，N-二甲基甲酰胺沉淀，抽滤，收集滤饼，用水复溶，透析(MWCO＝14kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯-4，4′-二羰酰氯中间体(D30％-HECS-AZO16％)。

实施例7D14％-PEI和D14％-PEI-AZO20％聚合物结构鉴定

按照实施例1和4分别制备的D14％-PEI和D14％-PEI-AZO20％聚合物通过核磁氢谱来鉴定结构。图1(A)为磺基甜菜碱单体的氢谱图，化学位移2.0ppm附近为磺基甜菜碱单体亚甲基的质子特征峰，图1(B)为D14％-PEI聚合物的氢谱图，化学位移2.3-3.5ppm为PEI亚甲基的质子特征峰，与A谱图对比，B谱图上存在磺基甜菜碱单体2.0ppm附近处的特征峰，说明 D14％-PEI聚合物合成成功。图1(C)为D14％-PEI-AZO20％聚合物的氢谱图，化学位移7.0-8.0ppm 为偶氮苯结构中苯环上氢的特征峰，与B谱图对比，C谱图存在PEI、磺基甜菜碱单体以及偶氮苯结构的特征峰，说明D14％-PEI-AZO20％聚合物合成成功。

实施例8磺基甜菜碱-PEI-(4，4′-二羧酸偶氮苯+原卟啉)的制备

将6mg原卟啉溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入10倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.5～1h后，加入磺基甜菜碱-PEI-(4，4- 二羧酸偶氮苯的甲酰胺溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱-PEI-(4，4-二羧酸偶氮苯+原卟啉)(D14％-PEI-(AZO20％+PS10％))。

实施例9磺基甜菜碱-聚赖氨酸-(偶氮苯甲酸+焦脱美叶绿酸a)的制备

将5mg焦脱美叶绿酸a溶于二甲亚砜中，加入6倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，活化0.5～1h后，加入磺基甜菜碱-聚赖氨酸- 偶氮苯甲酸的水溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱- 聚赖氨酸-(偶氮苯甲酸+焦脱美叶绿酸a)(D20％-PLL-(AZO25％+PS7％))。

实施例10磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-(偶氮苯-4，4′-二羰酰氯+二氢卟酚e6)的制备

将5mg二氢卟酚e6溶于二甲亚砜中，加入3-6倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，活化0.5～1h后，加入磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯的甲酰胺溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-(偶氮苯-4，4′-二羰酰氯+二氢卟酚e6)(D30％-HECS-(AZO16％+PS8％))。

实施例11(D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)/紫杉醇纳米粒的制备

将4mg两亲性的(D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)载体溶于水中，两亲性载体会自组装形成纳米粒，用乙醇溶解紫杉醇，该乙醇溶液逐滴滴加到聚合物纳米粒溶液中，避光剧烈搅拌15min。 120w功率冰浴条件下探头超声半小时。纳米粒溶液置于透析袋中(MWCO＝3500D)透析 12h，过0.8μm滤膜，即得载紫杉醇的纳米粒溶液。该纳米粒平均粒径为119.3nm。紫杉醇的载药量为22.7％。将纳米粒水溶液加入1％的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用 0.9％的生理盐水或5％的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静脉注射。

实施例12 D20％-PLL-(AZO25％+PS7％)/藤黄酸纳米粒的制备

精密称取藤黄酸4mg和D20％-PLL-(AZO25％+PS7％)6mg，置于50ml茄形瓶中，加入10ml 乙醇溶解，在40℃下旋转蒸发0.5h，除去有机溶剂使聚合物成膜。残余溶剂于真空条件下室温干燥24h除去。然后加入10mL蒸馏水，在37℃下水化10min。水化结束后，将所得混悬液于15000r/min离心20min，经微孔滤膜(0.8μm)过滤，得到载藤黄酸的纳米粒溶液该纳米粒平均粒径为133.9nm。藤黄酸的载药量为41.4％。将纳米粒水溶液加入1％的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用0.9％的生理盐水或5％的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静脉注射。

实施例13 D30％-HECS-(AZO16％+PS8％)/甲氨蝶呤纳米粒的制备

将4mg两亲性的D30％-HECS-(AZO16％+PS8％)载体溶于水中，两亲性载体会自组装形成纳米粒，用N，N-二甲基甲酰胺溶解甲氨蝶呤，将甲氨蝶呤溶液逐滴滴加到聚合物纳米粒溶液中，在室温下，高压乳匀5次，迅速冷至室温。纳米粒溶液置于透析袋中(MWCO＝14kD)透析 12h，过0.8μm滤膜，即得载甲氨蝶呤的纳米粒溶液。该纳米粒平均粒径为120.1nm。甲氨蝶呤的载药量为33.5％。将纳米粒水溶液加入1％的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用0.9％的生理盐水或5％的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静脉注射。

实施例14 D30％-HECS-(AZO16％+PS8％)/siRNA基因复合物的制备

首先将D30％-HECS-(AZO16％+PS8％)载体溶于适量150mM NaCl溶液中，使聚合物质量浓度为1.0mg/mL；然后根据N/P＝3，将预先计算得出的适当体积的聚合物NaCl溶液与siRNA 的超纯水溶液混合，并涡旋30s，随后在常温下静置30min，得到载体与siRNA充分结合形成的基因复合物。该基因复合物的粒径为126.6nm。

实施例15抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的巨噬细胞RAW264.7摄取实验

取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7，1×105个/孔接种于24孔板，培养24h后，吸走旧培养基，按照实施例7方法分别制备得到的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体、无甜菜碱修饰的光增敏型缺氧应激PEI衍生物载体(D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)、PEI- (AZO20％+PS10％)，用培养基稀释至各组样品光敏剂浓度为5ug/ml，分别取500ul加入每孔。继续孵育1-4h，吸走旧培养基，PBS洗，胰酶消化，培养基终止消化，PBS重悬细胞，过尼龙膜，进行流式定量摄取分析。

结果如图2所示巨噬细胞RAW264.7对抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体、无甜菜碱修饰的光增敏型缺氧应激PEI衍生物载体摄取能力大小为：PEI-(AZO20％+PS10％)＞D14％-PEI- (AZO20％+PS10％）＞生理盐水组，表明由于甜菜碱两性离子的抗蛋白吸附能力，载体越不易被巨噬细胞RAW264.7，从而可能延长体系的血液循环时间，促进纳米体系在肿瘤蓄积，提高抗肿瘤作用。

实施例16光激活的体外细胞毒评价

按照实施例8和11方法分别制备得到的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体 D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)以及其载药纳米粒D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)/PTX)，再分别与细胞共同培养。取处于对数生长期的4T1细胞以5×103cell/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入RPMI 1640培养基稀释的不同浓度的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)，37℃继续孵育24h后，红光激光器以200mW/cm2 照射3分钟。照射结束，细胞继续培养4h，培育结束后，用MTT法检测细胞的存活率。不同浓度D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)和D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)/PTX在光照以及无光照条件下4T1细胞的存活率如图3、4所示。

图3结果显示，无光照条件下，D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)没有明显的细胞毒性，证明抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体具有安全性；在光照条件下D14％-PEI-(AZO20％+PS10％) 毒性比相应的无光照组毒性增大，表明在光照条件下，载体上的光敏剂发挥PDT作用，产生单线态氧，对肿瘤细胞生长有抑制作用。图4结果显示，无光照条件下，D14％-PEI- (AZO20％+PS10％)/PTX对肿瘤细胞有抑制作用，说明纳米粒(Dn-PEI-(AZOm+PSr)物理负载的PTX发挥抗肿瘤作用。在光照条件下，D14％-PEI-(AZO20％+PS10％)/PTX的细胞毒性明显增大，并且毒性较不含药物的载体光照时显著增强，表明光照条件下，载体上的光敏剂发挥PDT作用，与内核物理负载的化药PTX协同治疗作用，显著抑制肿瘤细胞的生长。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711141870.0 (22)申请日 2017.11.14 (71)申请人中国药科大学地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道639号 (72)发明人霍美蓉殷婷婕梁金来 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 47/58(2017.01) A61K 47/64(2017.01) A61K 47/61(2017.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称抗蛋白。

2、吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备与应用 (57)摘要本发明属于药物制剂领域，公开了一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备和药学应用。以阳离子聚合物为骨架，修饰两性离子甜菜碱单体以减弱聚合物对生物体内蛋白的吸附；进一步对该中间体修饰含缺氧应激偶氮苯结构的疏水连接臂和光敏剂，构建两亲性聚合物载体。该阳离子修饰物在水溶液中自组装形成纳米粒，可直接应用于光动力治疗，也可用于负载疏水性化药、或核酸类药物，应用于光动力和抗肿瘤药物联合治疗。本发明利用光敏剂光动力治疗构建高度乏氧肿瘤微环境激发纳米解组装，进而促进药物释放提高其利用率，并通过光。

3、动力活性氧的产生增敏抗肿瘤药物疗效，实现肿瘤高效协同治疗。权利要求书2页说明书7页附图2页 CN 107982533 A 2018.05.04 CN 107982533 A 1.一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于该载体以阳离子聚合物为骨架首先引入两性离子甜菜碱单体，进一步偶联含有缺氧敏感偶氮苯结构的疏水分子以及光敏剂，该阳离子衍生物具有两亲性，在水中可自组装形成纳米粒，可有效负载药物；甜菜碱两性离子结构有效降低纳米粒的蛋白吸附率及细胞膜相互作用，能减少其网状内皮系统(RES， reticulo-endothelial system)吞噬率，。

4、延长纳米粒血循环时间，有益于纳米粒肿瘤被动靶向作用；纳米粒靶向蓄积肿瘤组织后，经激发光照射，纳米粒中光敏剂消耗微环境氧气产生单线态氧实现光动力学治疗；纳米粒偶氮苯结构响应高度乏氧微环境被还原断裂，纳米粒解组装促进其负载的药物释放，显著提高病灶区药物浓度和生物利用度，并且联合光动力治疗产生协同抗肿瘤效果；该阳离子衍生物结构通式如下： Dn-CLP-(AZOm+PSr) 其中所述的CLP分子量600100000D；接枝率为共价偶联到阳离子聚合物的分子与聚阳离子的总氨基摩尔百分比； D为甜菜碱结构单体； n为阳离子聚合物上甜菜碱单体的接枝率，所述的甜菜碱单体接枝率为。

5、5-80； AZO为含偶氮苯结构的连接臂分子， m为阳离子聚合物上AZO的接枝率，所述偶氮苯的接枝率为5-80； PS为光敏剂， r为阳离子聚合物上接枝PS的接枝率，所述光敏剂的接枝率为1-15。 2.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于聚阳离子选自聚氧乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖。 3.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于甜菜碱结构母核选自羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱。 4.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于含缺氧敏感偶氮苯结构的连接臂分。

6、子选自4-苯偶氮基苯酚、 4-氨基-偶氮苯、 4-氨基-2， 3- 二甲基偶氮苯，偶氮苯甲酸、偶氮苯乙酸、偶氮苯-4， 4 -二羧酸、偶氮苯甲酰氯、偶氮苯乙酰氯、偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯。 5.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于光敏剂选自原卟啉、吲哚青绿、美叶绿酸a、紫红素18、二氢卟吩及其羟基、羧基衍生物。 6.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于制备方法包括下列步骤： (1)通过迈克尔加成或酰胺化反应将含甜菜碱结构的分子修饰聚阳离子得到衍生物Dn- CLP； (2)含缺氧敏感偶氮苯。

7、结构的连接臂分子经活化剂活化其羧基或直接用其酰氯基团与 Dn-CLP聚合物的游离氨基通过酰胺化反应偶联得到Dn-CLP-AZOm； (3)光敏剂分子的羧基经活化剂活化与Dn-CLP-AZOm聚合物的游离氨基通过酰胺化反应偶联得到： Dn-CLP-(AZOm+PSr)。 7.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其可物理负载的药物包括喜树碱类、紫杉烷类、蒽醌类、蒽环类、长春碱类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、黄铜类抗肿瘤化药；质粒、 siRNA、 shRNA、 Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA等核酸类药物。 8。

8、.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其具有两亲性，在水介质中自组装形成纳米粒，可负载化疗药物，并采用下列方法中任意方权利要求书 1/2 页 2 CN 107982533 A 2 法制备得到： (1)将抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水中，得到聚合物纳米粒；将化药用药学可接受有机溶剂溶解，与前述聚合物纳米粒溶液混合得到预制备溶液；将预制溶液经超声或高压均质法处理后，采用透析、超滤或者蒸发除去有机溶剂，制得粒径为30- 300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒； (2)抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应。

9、激阳离子载体与药物溶于药学可接受有机溶剂，经减压蒸发于瓶壁形成薄膜后，以水搅拌复溶或分散，经过超声或高压均质处理，制得粒径为 30-300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。 9.如权利要求1所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于还可负载核酸类药物，相应载药纳米粒采用下列方法制备得到：取适量的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水性介质中，将该溶液与含核酸药物的溶液通过吹打或涡旋混合，然后室温孵育一定时间即制得载核酸药物的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子纳米粒。 10.如权利要求6和权利要求8所述抗蛋白吸附的光增敏型缺氧。

10、应激阳离子载体，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、甲酰胺、 N， N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮或其中任意两种溶剂的混合溶剂；药学可接受有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、 N， N- 二甲基甲酰胺、二甲亚砜或者他们的混合溶剂。权利要求书 2/2 页 3 CN 107982533 A 3 抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的制备与应用技术领域 0001 本发明属于药物制剂领域，涉及一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子聚合物作为药物递送载体，本发明还涉及该载体的制备方法及其应用。背景技术 0002 光动力学疗法(Photody。

11、namic therapy， PDT)是一种重要的非入侵性治疗手段，已被应用于肿瘤治疗临床应用；是一种联合利用光敏剂、氧气分子、光，利用光敏剂吸收特定波长的光后为激发态分子，与氧气反应生成单线态氧，能有效杀死肿瘤细胞。 PDT已逐渐成为继手术、放疗和化疗之外治疗肿瘤的第四种微创疗法。与其他传统抗肿瘤治疗法对比， PDT有很多优势如癌细胞特异性；光敏剂分子安全、不抑制人的免疫功能；不易产生耐药性。但多数光敏剂难溶于水，其本身疏水性以及 - 堆积，它在水溶液中容易聚集，导致荧光淬灭，单线态氧(1O2)产生效率降低，最终影响光动力治疗的效果；另外大部分光。

12、敏剂分子本身于体内分布无选择性，可能诱发正常组织的毒性，也不利于PDT治疗。纳米递送系统可以增强药物的靶向性、提高药物稳定性；减轻药物于正常组织的毒副作用；提高药物的生物利用度。因此利用纳米递送体系的优势，有望有效解决光敏剂体内稳定转运、靶向递送利用率低等难题，提高PDT疗效。目前纳米技术递送光敏剂到靶向组织主要有两种方式，一是纳米粒 (如脂质体、胶束)物理包裹光敏剂，利用EPR效应纳米粒携带光敏剂被动靶向蓄积于肿瘤组织，提高PDT治疗效果；二是光敏剂化学偶联到载体后，纳米粒将其靶向递送至肿瘤部位。纳米粒物理负载光敏剂，虽然提高了光敏剂肿瘤靶向。

13、性，但可能存在光敏剂泄露问题；而光敏剂化学偶联到载体上，则能够提高光敏剂的稳定性并避免物理泄露，光稳定性更佳。 0003 此外，目前为了提高肿瘤治疗效果，多种研究将PDT与药物治疗联合应用。 Yue et al. ROS-Responsive Mitochondria-Targeting Blend Nanoparticles： Chemo-and Photodynamic Synergistic Therapy for Lung Cancer with On-Demand Drug Release upon Irradiation with a Single Light Sou。

14、rce.Theranostics.2016 Oct 1； 6(13)： 2352-2366文献中设计线粒体靶向的活性氧 (ROS)敏感的纳米递送体系，该载体利用ROS 敏感键缩硫酮为连接臂将化药喜树碱与聚乙二醇化学连接，再引入线粒体靶向物质三苯基膦，形成嵌段共聚物TL-CPT-PEG1K-TPP；该嵌段共聚物再与磷脂聚乙二醇(DSPE-PEG)混合形成的纳米递送体系，再物理包裹光敏剂酞菁锌。 633nm激光照射，酞菁锌产生ROS，连接臂缩硫酮断裂，释放化药，与光敏剂实现化疗和光动力学治疗的联合治疗作用，提高抗肿瘤作用。 Wang et al.Combined Can。

15、cer Therapy with Hyaluronan-Decorated Fullerene- Silica Multifunctional Nanoparticles to Target Cancer Stem-Like Cells.Biomaterials.2016 Aug； 97： 62-73文献中利用透明质酸修饰富勒烯二氧化硅纳米粒，再物理负载化疗药物阿霉素和光敏剂吲哚菁绿，靶向作用于乳腺癌干细胞，实现化疗、光动力、光热治疗的联合治疗，提高肿瘤治疗效果。 0004 虽然PDT与化疗联合应用，能够提高治疗效果，但目标纳米递送载体将药物共递送到靶向部位后，还存在药物。

16、释放缓慢的问题。缺氧是多数实体肿瘤的特征之一；肿瘤缺氧微说明书 1/7 页 4 CN 107982533 A 4 环境维持肿瘤的生长，致使肿瘤细胞对治疗的耐受性增强，易复发，因而不利于肿瘤治疗。相较于肿瘤组织，正常组织中很少存在缺氧区域，人们利用肿瘤组织与正常组织中氧含量的显著差别，设计缺氧敏感的纳米药物递送系统，期望在肿瘤组织释放药物实现靶向治疗，所以缺氧微环境也为肿瘤的靶向治疗提供了有利条件。偶氮苯结构在缺氧环境中可被还原，结构中的偶氮键断裂，利用疏水的偶氮苯结构修饰亲水高分子材料可设计缺氧触发释药功能的靶向自组装纳米粒。 0005 阳离子聚合物，。

17、一直是有效基因转染载体的重点研究对象之一，因结构中含有大量游离氨基便于化学修饰，因此在药剂学中常被作为高分子骨架修饰成药物递送载体，其递送范围不仅包括化药，更包括阴离子核酸类药物。但阳离子聚合物普遍具有高表面正电、较高的细胞毒性，血循环时易吸附血内成分，稳定性差且易被RES系统识别清除。因此，大量研究致力于阳离子聚合物表面改性以期提高其生物相容性，降低其毒性，提高血循环稳定性和循环时间。常见表面修饰如聚乙二醇(PEG)化，能降低表面电荷并且增加空间位阻，减弱载体与蛋白的相互作用，提高生物相容性，延长材料在体稳定性和循环时间。然而， PEG多次应用。

18、后，会引起明显的体液免疫反应，通过B细胞分泌的中和抗体结合PEG后，经过PEG修饰的载体会被吞噬细胞识别和清除，其血液半衰期显著缩短，即 PEG具有ABC (acceleratedblood clearance)效应。甜菜碱能调节体内渗透压，可作为甲基供体，并能促进脂肪代谢等。其化学名称为三甲基甘氨酸，属两性离子；具有超亲水特性能有效抑制载体与蛋白或细胞膜发生相互过强的作用，载体的蛋白吸附能力和溶血性均显著下降，能够避免RES的吞噬和肾脏的排泄，延长其修饰的纳米体系在体内的血循环时间，且不具有PEG类似的多次给药后对体液免疫反应的激发。因此，。

19、我们提出利用比PEG更为优异的具抗蛋白吸附能力的两性离子甜菜碱结构对阳离子聚合物进行表面修饰，以达到提高其抗蛋白吸附能力和降低细胞毒性的目的。发明内容 0006 本发明的目的是针对以上技术问题和启示，提供一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体。该载体是以阳离子聚合物为骨架，修饰两性离子甜菜碱单体以减弱聚合物对生物体内蛋白的吸附；进一步对该中间体修饰含缺氧应激偶氮苯结构的疏水连接臂和光敏剂，构建目标两亲性聚合物载体。该阳离子修饰物在水溶液中自组装形成纳米粒，可直接应用于光动力治疗，也可用于负载疏水性化药、或核酸类药物，应用于光动力和抗肿瘤药物联合治疗。。

20、该纳米粒通过静脉注射被动靶向肿瘤部位产生疗效： (1)甜菜碱改性的两亲性阳离子纳米粒其蛋白吸附率和被RES捕获的效率较无甜菜碱修饰的阳离子聚合物显著降低，血循环时间显著提高； (2)该纳米体系粒径分布于30-300nm，利用EPR靶向蓄积于肿瘤； (3)肿瘤组织在一定激发波长照射下，纳米粒光敏剂消耗微环境氧气激发光动力治疗； (4) 偶氮苯链接臂响应高度乏氧微环境被还原断裂，纳米粒解组装促进其包载的疏水性化药或阴离子核酸药物释放。本发明利用光敏剂光动力治疗加重肿瘤乏氧微环境激发纳米解组装，进而促进药物释放提高其利用率，并通过光动力活性氧的产生增敏抗肿瘤药物疗效，实现。

21、肿瘤协同治疗。 0007 本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。 0008 本发明还有一个目的是提供上述载体在制药中的应用。说明书 2/7 页 5 CN 107982533 A 5 0009 为达到上述目的，本发明提供一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其结构通式如下： 0010 Dn-CLP-(AZOm+PSr) 0011 其中所述的CLP为聚阳离子，分子量600100,000D；接枝率为共价偶联到阳离子聚合物的分子与聚阳离子的总氨基摩尔百分比； D为甜菜碱结构单体， n为阳离子聚合物上甜菜碱单体的接枝率，所述的甜菜碱单体接枝率为5-80； AZO为含偶氮苯。

22、结构的连接臂分子， m为阳离子聚合物上AZO的接枝率，所述偶氮苯的接枝率为5-80； PS为光敏剂， r 为阳离子聚合物上接枝PS的接枝率，所述光敏剂的接枝率为1-15。 0012 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于聚阳离子选自聚氧乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚酰胺基胺、聚丙烯亚胺、聚氨基酯、聚脒、壳聚糖。 0013 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于甜菜碱结构母核选自羧酸基甜菜碱和磺基甜菜碱。 0014 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于含缺氧敏感偶氮苯结构的连接臂分子选自4-苯偶氮基苯酚、。

23、4-氨基-偶氮苯、 4-氨基-2， 3-二甲基偶氮苯，偶氮苯甲酸、偶氮苯乙酸、偶氮苯-4， 4 -二羧酸、偶氮苯甲酰氯、偶氮苯乙酰氯、偶氮苯- 4， 4 -二羰酰氯。 0015 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于光敏剂选自原卟啉、吲哚青绿、美叶绿酸a、紫红素18、二氢卟吩及其羟基、羧基衍生物。 0016 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于采用下列步骤制备得到： 0017 (1)甜菜碱修饰聚阳离子衍生物(D-CLP)，采用下列方法中任意方法制备得到： 0018 a.将聚阳离子溶于反应溶剂中，加入甜菜碱单体，。

24、进行迈克尔加成反应，室温反应 2-3 天，透析，冻干，得到甜菜碱修饰聚阳离子衍生物。 0019 b.将聚阳离子和甜菜碱单体溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1- 羟基苯并三唑(HOBt)或N， N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N， N-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行酰胺反应，透析，冻干制得甜菜碱修饰聚阳离子衍生物。 0020 (2)偶氮苯修饰甜菜碱-CLP衍生物(D-CLP-AZO)，采用下列方。

25、法中任意方法制备得到： 0021 a.将偶氮苯溶于反应溶剂，再以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑 (HOBt) 或N， N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N， N-二环己基碳二亚胺 (DCC) 和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行酰胺反应；将D-CLP溶于反应溶剂中，加入偶氮苯溶液中，反应48-72h，旋蒸除去反应溶剂，用水稀释，透析48-72h，冻干得到D-CLP-AZO。 0022 b.将D-CLP和偶氮苯酰氯溶于反应溶剂中，。

26、室温反应24-72h，透析，冻干制得偶氮苯修饰甜菜碱-CLP衍生物。 0023 (3)光敏剂修饰D-CLP-AZO衍生物(D-CLP-(AZO+PS)的制备： 0024 将光敏剂溶于反应溶剂中，再以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟说明书 3/7 页 6 CN 107982533 A 6 基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑 (HOBt) 或N， N-二环己基碳二亚胺(DCC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N， N-二环己基碳二亚胺 (DCC) 和1-羟基苯并三唑(HOBt)为活化剂进行反应， D-CLP。

27、-AZO溶于反应溶剂后，加入光敏溶液中，反应24-72h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的光敏剂修饰Dn-CLP-AZOm衍生物 (Dn-CLP-(AZOm+PSr) 0025 所述的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激聚阳离子载体，其特征在于具有两亲性，在水介质中自组装形成纳米粒，可物理负载化疗药物或吸附核酸类药物。物理负载的药物可选自喜树碱类、紫杉烷类、蒽醌类、蒽环类、长春碱类、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、叶酸拮抗剂、黄铜类抗肿瘤化药；吸附的核酸类药物可选自基因、 siRNA、 shRNA、 Aptamer、肽核酸、反义RNA、反义DNA。 0026 。

28、所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于其物理荷载化药的纳米粒采用下列方法中任意方法制备得到： 0027 (1)将抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水中，得到聚合物纳米粒；将化药用药学可接受有机溶剂溶解，与前述聚合物纳米粒溶液混合得到预制备溶液；将预制溶液经超声或高压均质法处理后，采用透析、超滤或者蒸发除去有机溶剂，制得粒径为 30-300nm 的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。 0028 (2)抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体与药物溶于药学可接受有机溶剂，经减压蒸发于瓶壁形成薄膜后，以水搅拌复溶或分散，经过超声或。

29、高压均质处理，制得粒径为 30-300nm的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒。 0029 所述的一种抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于还可负载核酸类药物，相应载药纳米粒采用下列方法制备得到： 0030 取适量的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体分散于水性介质中，将该溶液与含核酸药物的溶液通过吹打或涡旋混合，然后室温孵育一定时间即制得载核酸药物的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子纳米粒。 0031 所述抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体，其特征在于所述反应溶剂为水、甲醇、甲酰胺、 N， N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲亚砜、丙酮。

30、或其中任意两种溶剂的混合溶剂；药学可接受有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、 N， N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或者他们的混合溶剂。 0032 本发明提供的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒具有下列优点： 0033 通过简单的化学反应在阳离子聚合物上接枝了三个功能性小分子；其中小分子甜菜碱单体具有抗蛋白吸附作用的两性离子，降低减弱阳离子聚合物对蛋白的吸附能力和溶血能力，延长体系血液循环时间，促进纳米体系在肿瘤蓄积，从而提高抗肿瘤作用；小分子光敏剂的引入可使得载体应用于光动力学治疗，并可以加重病灶微环境乏氧；含偶氮苯结构的连接臂可赋予载体疏水载。

31、药微区以及缺氧敏感性。本发明提供的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载药纳米粒结合偶氮苯结构缺氧条件下还原断裂以及光敏剂发挥光动力学治疗时的耗氧本质，利用光激发PDT的同时促发纳米解组装，加速药物释放，增强协同抗肿瘤效果。附图说明说明书 4/7 页 7 CN 107982533 A 7 0034 图1为实施例7D14-PEI和D14-PEI-AZO20聚合物结构鉴定氢谱图 0035 图2为实施例15抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的巨噬细胞RAW 264.7摄取实验结果图 0036 图3为实施例16光动力治疗后乳腺癌4T1细胞存活率的图片 0037 图4为实施例16。

32、光动力治疗后乳腺癌4T1细胞存活率的图片具体实施方式 0038 实施例1磺基甜菜碱修饰的PEI衍生物的制备 0039 将0.4g PEI(MW 1800)溶于甲醇溶液，加入0.27g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO 1kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-PEI衍生物(D14-PEI)。 0040 实施例2羧基甜菜碱修饰的聚赖氨酸衍生物的制备 0041 将0.5g聚赖氨酸(MW 10000)溶于N， N-二甲基甲酰胺和甲醇(v/v1 1)的混合溶液中，加入0.34g羧基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO3.5kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-聚。

33、赖氨酸衍生物(D20-PLL)。 0042 实施例3磺基甜菜碱修饰羟乙基壳聚糖衍生物的制备 0043 将0.1g羟乙基壳聚糖溶于二甲亚砜和甲醇(v/v1 3)的混合溶液中，加入0.59g 磺基甜菜碱单体，反应1-3天，透析(MWCO14kD)48-72h，冻干得到磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖衍生物(D30-HECS)。 0044 实施例4磺基甜菜碱-PEI-4， 4 -二羧酸偶氮苯中间体的制备。 0045 将0.1g 4， 4 -二羧酸偶氮苯溶于水和甲醇(v/v1 3)的混合溶液中，再加入6倍当量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)；将0.。

34、1g D- PEI衍生物溶于水中，加入4， 4-二羧酸偶氮苯溶液中，反应48h，旋蒸除去吡啶，用水稀释，透析 (MWCO1kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的羧基甜菜碱-PEI-4， 4 -二羧酸偶氮苯中间体 (D14-PEI-AZO20)。 0046 实施例5羧基甜菜碱-聚赖氨酸-偶氮苯甲酸中间体的制备 0047 将0.1g偶氮苯甲酸溶于水和DMF(v/v1 3)的混合溶液中，再加入5倍当量的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)；将0.1g D-PLL溶于水中，加入偶氮苯甲酸溶液中，反应48h，透析(MWCO3.。

35、5kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的羧基甜菜碱-聚赖氨酸-偶氮苯甲酸中间体(D20-PLL-AZO25)。 0048 实施例6磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯中间体的制备 0049 将0.1g偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯溶于水和DMSO(v/v1 2)的混合溶液中；将0.1g甜菜碱-羟乙基壳聚糖衍生物溶于水中，加入偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯溶液中，反应12h，用N， N- 二甲基甲酰胺沉淀，抽滤，收集滤饼，用水复溶，透析(MWCO14kD)48-72h，冻干得到含有偶氮键的磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯中间体(D3。

36、0-HECS-AZO16)。 0050 实施例7D14-PEI和D14-PEI-AZO20聚合物结构鉴定 0051 按照实施例1和4分别制备的D14-PEI和D14-PEI-AZO20聚合物通过核磁氢谱来鉴定结构。图1(A)为磺基甜菜碱单体的氢谱图，化学位移2.0ppm附近为磺基甜菜碱单体亚甲基的质子特征峰，图1(B)为D14-PEI聚合物的氢谱图，化学位移2.3-3.5ppm为PEI亚甲基的质子特征峰，与A谱图对比， B谱图上存在磺基甜菜碱单体2.0ppm附近处的特征峰，说明说明书 5/7 页 8 CN 107982533 A 8 D14-PEI聚合物合成成功。图1。

37、(C)为D14-PEI-AZO20聚合物的氢谱图，化学位移7.0-8.0ppm 为偶氮苯结构中苯环上氢的特征峰，与B谱图对比， C谱图存在PEI、磺基甜菜碱单体以及偶氮苯结构的特征峰，说明D14-PEI-AZO20聚合物合成成功。 0052 实施例8磺基甜菜碱-PEI-(4， 4 -二羧酸偶氮苯+原卟啉)的制备 0053 将6mg原卟啉溶于N， N-二甲基甲酰胺中，加入10倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)，活化0.51h后，加入磺基甜菜碱-PEI-(4， 4- 二羧酸偶氮苯的甲酰胺溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-。

38、3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱-PEI-(4， 4-二羧酸偶氮苯+原卟啉)(D14-PEI-(AZO20+PS10)。 0054 实施例9磺基甜菜碱-聚赖氨酸-(偶氮苯甲酸+焦脱美叶绿酸a)的制备 0055 将5mg焦脱美叶绿酸a溶于二甲亚砜中，加入6倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，活化0.51h后，加入磺基甜菜碱-聚赖氨酸- 偶氮苯甲酸的水溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱- 聚赖氨酸-(偶氮苯甲酸+焦脱美叶绿酸a)(D20-PLL-(AZO25+PS7)。 0056 实施例。

39、10磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-(偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯+二氢卟酚e6)的制备 0057 将5mg二氢卟酚e6溶于二甲亚砜中，加入3-6倍量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，活化0.51h后，加入磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-偶氮苯的甲酰胺溶液中，室温反应24-48h，纯水透析2-3d，冻干得到两亲性的磺基甜菜碱-羟乙基壳聚糖-(偶氮苯-4， 4 -二羰酰氯+二氢卟酚e6)(D30-HECS-(AZO16+PS8)。 0058 实施例11(D14-PEI-(AZO20+PS10)/紫杉醇纳米粒的制备 0059 将4mg两亲性。

40、的(D14-PEI-(AZO20+PS10)载体溶于水中，两亲性载体会自组装形成纳米粒，用乙醇溶解紫杉醇，该乙醇溶液逐滴滴加到聚合物纳米粒溶液中，避光剧烈搅拌 15min。 120w功率冰浴条件下探头超声半小时。纳米粒溶液置于透析袋中(MWCO3500D)透析 12h，过0.8 m滤膜，即得载紫杉醇的纳米粒溶液。该纳米粒平均粒径为119.3nm。紫杉醇的载药量为22.7。将纳米粒水溶液加入1的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用 0.9的生理盐水或5的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静脉注射。 0060 实施例12 D20-PLL-(AZO25+PS7)/藤黄酸纳米。

41、粒的制备 0061 精密称取藤黄酸4mg和D20-PLL-(AZO25+PS7)6mg，置于50ml茄形瓶中，加入10ml 乙醇溶解，在40下旋转蒸发0.5h，除去有机溶剂使聚合物成膜。残余溶剂于真空条件下室温干燥24h除去。然后加入10mL蒸馏水，在37下水化10min。水化结束后，将所得混悬液于 15000r/min离心20min，经微孔滤膜(0.8 m)过滤，得到载藤黄酸的纳米粒溶液该纳米粒平均粒径为133.9nm。藤黄酸的载药量为41.4。将纳米粒水溶液加入1的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用0.9的生理盐水或5的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静。

42、脉注射。 0062 实施例13 D30-HECS-(AZO16+PS8)/甲氨蝶呤纳米粒的制备 0063 将4mg两亲性的D30-HECS-(AZO16+PS8)载体溶于水中，两亲性载体会自组装形成纳米粒，用N， N-二甲基甲酰胺溶解甲氨蝶呤，将甲氨蝶呤溶液逐滴滴加到聚合物纳米粒溶液中，在室温下，高压乳匀5次，迅速冷至室温。纳米粒溶液置于透析袋中(MWCO14kD)透析 12h，过0.8 m滤膜，即得载甲氨蝶呤的纳米粒溶液。该纳米粒平均粒径为120.1nm。甲氨蝶呤的载药量为33.5。将纳米粒水溶液加入1的甘露醇冻干，即得冻干固体粉末。使用前用说明书 6。

43、/7 页 9 CN 107982533 A 9 0.9的生理盐水或5的葡萄糖复溶，该纳米粒可用于静脉注射。 0064 实施例14 D30-HECS-(AZO16+PS8)/siRNA基因复合物的制备 0065 首先将D30-HECS-(AZO16+PS8)载体溶于适量150mM NaCl溶液中，使聚合物质量浓度为1.0mg/mL；然后根据N/P3，将预先计算得出的适当体积的聚合物NaCl溶液与siRNA 的超纯水溶液混合，并涡旋30s，随后在常温下静置30min，得到载体与siRNA充分结合形成的基因复合物。该基因复合物的粒径为126.6nm。 0066 实施例15抗蛋白吸。

44、附的光增敏型缺氧应激阳离子载体的巨噬细胞RAW264.7摄取实验 0067 取对数生长期的巨噬细胞RAW 264.7， 1105个/孔接种于24孔板，培养24h后，吸走旧培养基，按照实施例7方法分别制备得到的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体、无甜菜碱修饰的光增敏型缺氧应激PEI衍生物载体(D14-PEI-(AZO20+PS10)、 PEI- (AZO20+PS10)，用培养基稀释至各组样品光敏剂浓度为5ug/ml，分别取500ul加入每孔。继续孵育1-4h，吸走旧培养基， PBS洗，胰酶消化，培养基终止消化， PBS重悬细胞，过尼龙膜，进行流式定量摄取分。

45、析。 0068 结果如图2所示巨噬细胞RAW264.7对抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体、无甜菜碱修饰的光增敏型缺氧应激PEI衍生物载体摄取能力大小为： PEI-(AZO20+ PS10)D14-PEI- (AZO20+PS10）生理盐水组，表明由于甜菜碱两性离子的抗蛋白吸附能力，载体越不易被巨噬细胞RAW264.7，从而可能延长体系的血液循环时间，促进纳米体系在肿瘤蓄积，提高抗肿瘤作用。 0069 实施例16光激活的体外细胞毒评价 0070 按照实施例8和11方法分别制备得到的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体 D14-PEI-(AZO20+PS10)以及其载。

46、药纳米粒D14-PEI-(AZO20+PS10)/PTX)，再分别与细胞共同培养。取处于对数生长期的4T1细胞以5103cell/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入RPMI 1640培养基稀释的不同浓度的抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体D14-PEI-(AZO20+PS10)， 37继续孵育24h后，红光激光器以200mW/cm2 照射3分钟。照射结束，细胞继续培养4h，培育结束后，用MTT法检测细胞的存活率。不同浓度 D14-PEI-(AZO20+PS10)和D14-PEI-(AZO20+PS10)/PTX在光照以及无光照条件下4T1细胞。

47、的存活率如图3、 4所示。 0071 图3结果显示，无光照条件下， D14-PEI-(AZO20+PS10)没有明显的细胞毒性，证明抗蛋白吸附的光增敏型缺氧应激阳离子载体具有安全性；在光照条件下D14-PEI-(AZO20+ PS10) 毒性比相应的无光照组毒性增大，表明在光照条件下，载体上的光敏剂发挥PDT作用，产生单线态氧，对肿瘤细胞生长有抑制作用。图4结果显示，无光照条件下， D14-PEI- (AZO20+PS10)/PTX对肿瘤细胞有抑制作用，说明纳米粒(Dn-PEI-(AZOm+PSr)物理负载的 PTX发挥抗肿瘤作用。在光照条件下， D14-PEI-(AZO20+PS10)/PTX的细胞毒性明显增大，并且毒性较不含药物的载体光照时显著增强，表明光照条件下，载体上的光敏剂发挥PDT作用，与内核物理负载的化药PTX协同治疗作用，显著抑制肿瘤细胞的生长。说明书 7/7 页 10 CN 107982533 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 107982533 A 11 图3 图4 说明书附图 2/2 页 12 CN 107982533 A 12 。

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