《生物相容性高分子与具有生物相容性的磁性纳米微粒.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物相容性高分子与具有生物相容性的磁性纳米微粒.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102112158 A (43)申请公布日 2011.06.29 CN 102112158 A *CN102112158A* (21)申请号 200880129963.4 (22)申请日 2008.04.22 A61K 49/10(2006.01) C08G 65/48(2006.01) C07F 7/04(2006.01) C08G 77/38(2006.01) (71)申请人 财团法人工业技术研究院 地址 中国台湾新竹县 (72)发明人 张文祥 谢文元 黄秀华 林进益 王先知 邓克立 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 陈小雯 (54)。
2、 发明名称 生物相容性高分子与具有生物相容性的磁性 纳米微粒 (57) 摘要 本发明公开了一种生物相容性高分子， 可用 以化学键结修饰磁性纳米微粒。该生物相容性高 分子可以偶联特异性靶向分子或 / 及荧光染剂。 本发明还公开了一种具有生物相容性的磁性纳米 微粒， 其含有上述生物相容性高分子。 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.12.22 (86)PCT申请的申请数据 PCT/CN2008/000823 2008.04.22 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/129649 EN 2009.10.29 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。
3、利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 102112162 A1/2 页 2 1. 一种生物相容性高分子， 其结构如式 (I) 所示 ： 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基 ； R2为烷基、 或芳基 ； n 为 5 到 1000 的整数 ； m 为 1 到 10 的整数。 2.如权利要求1所述的生物相容性高分子， 其中R1和R2各自独立地为C1-C20直链或具 有分枝结构的烷基。 3.如权利要求1所述的生物相容性高分子， 其中R1和R2各自独立地为C6-C12有取代基 或不具取代基的芳基。 4. 如权利要求 1 所述的生物相容性高分子， 其中 R1为甲基。 5。
4、. 如权利要求 1 所述的生物相容性高分子， 其中 R2为乙基。 6. 如权利要求 1 所述的生物相容性高分子， 其中 n 为 15。 7. 如权利要求 1 所述的生物相容性高分子， 其中 m 为 3。 8. 一种具有生物相容性的磁性纳米微粒， 包含 ： 磁性纳米微粒 ； 共价偶联至该磁性纳米微粒的式 (II) 的生物相容性高分子 ： 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基 ； n 为 5 到 1000 的整数 ； m 为 1 到 10 的整数。 9. 如权利要求 8 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中 R1为羧基、 或氨基。 10. 如权利要求 8 所述的具有生物相容性的磁性纳。
5、米微粒， 其中该磁性纳米微粒是超 顺磁性纳米微粒。 11. 如权利要求 8 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该磁性纳米微粒包含 下列中的至少一种 ： 铁、 钴、 镍、 及其氧化物。 12. 如权利要求 9 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中 R1偶联至特异性靶向 权 利 要 求 书 CN 102112158 A CN 102112162 A2/2 页 3 分子， 该特异性靶向分子包括抗体、 蛋白质、 肽、 酶、 糖类、 糖蛋白、 核酸、 或脂质。 13. 如权利要求 12 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该磁性纳米微粒的粒 径约为 3-500nm。 14. 如权利要。
6、求 12 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该生物相容性高分子 偶联至荧光染剂。 15. 如权利要求 14 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中含有该荧光染剂与该 特异性靶向分子的磁性纳米微粒的粒径为约 15-200nm。 16. 如权利要求 14 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该荧光染剂显示出以 下的至少之一 ： 紫外 (UV)、 近红外 (NIR) 和可见 (VIS) 光的激发或发射波长。 17. 如权利要求 14 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该荧光染剂包括有机 染剂、 无机染剂、 或有机金属络合物。 18. 如权利要求 14 所述的具有生物相容性的。
7、磁性纳米微粒， 其中该荧光染剂与该特异 性靶向分子系以共价键与该生物相容性高分子键结。 19. 如权利要求 14 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该特异性靶向分子与 该生物相容性高分子通过 -CONH- 连接基团偶联。 20. 如权利要求 8 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该生物相容性高分子 被涂覆于该磁性纳米微粒上形成核壳结构。 21. 如权利要求 20 所述的具有生物相容性的磁性纳米微粒， 其中该生物相容性高分子 形成涂覆在该磁性纳米微粒上的单层。 权 利 要 求 书 CN 102112158 A CN 102112162 A1/6 页 4 生物相容性高分子与具有生物。
8、相容性的磁性纳米微粒 技术领域 0001 本发明涉及一种生物相容性高分子， 且特别涉及一种以共价键结修饰磁性纳米微 粒的生物相容性高分子。 背景技术 0002 磁振造影 (MRI) 是早期癌症诊断和治疗的有吸引力的非破坏性方法。MRI 成像的 主要信号来源是由观察强磁场下质子磁旋(magnetic spin)与无线电波频率电磁辐射的干 涉而得。诊断时， 将欲分析的器官或组织放置于强磁场下， 利用无线电波能量的撞击， 接着 质子的核磁化产生弛豫现象 (relaxation) 而形成影像。 0003 MRI 侦测体内影像的侦测极限约在 1mm， 这项限制显示了显影剂对比度的重要。 磁性纳米微粒应用。
9、在 MRI 显影剂上有提升对比度的特性， 再使用生物相容性高分子作 修饰， 可达到生物相容性效果。若在生物相容性高分子偶联特异性靶向分子 (specific targeting agent) 及荧光染剂， 则此含有特异性靶向分子及荧光染剂的磁性纳米微粒可增 加侦测特异性、 提高灵敏度、 及同时观察荧光信号。 0004 美国专利公开 US2007/0148095( 台湾专利公开 200724904) 中公开一种多功能磁 性纳米微粒， 并以生物相容性高分子修饰此磁性纳米微粒， 且在生物相容性高分子上偶联 特异性靶向分子及荧光染剂。此生物相容性高分子包括 ： 聚乙二醇 (PEG)、 聚乳酸 - 聚乙。
10、 二醇 (PLA-PEG)、 聚丙交酯 (PLA)、 聚乙交酯 (PGA)、 聚己内酯 (PCL)、 或聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)。 0005 美国专利公开 US2007/0148095 中公开一种硅烷化合物用于修饰磁性纳米微粒， 和用于使用该纳米微粒探测和治疗所关注的组织。 0006 市售的 MRI 对比度增强剂包括( 葡聚糖涂覆的氧化铁 ) 或 ( 羧基葡聚糖涂覆的氧化铁 )。 发明内容 0007 本发明提供一种生物相容性高分子， 其结构如式 (I) 所示 ： 0008 0009 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基 ； 0010 R2为烷基、 或芳基 ； 0011 n 为 5。
11、 到 1000 的整数 ； 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A2/6 页 5 0012 m 为 1 到 10 的整数。 0013 另一方面， 本发明提供一种具有生物相容性的磁性纳米微粒， 包含 ： 0014 磁性纳米微粒 ； 0015 共价偶联至该磁性纳米微粒的式 (II) 的生物相容性高分子 ： 0016 0017 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基 ； 0018 n 为 5 到 1000 的整数 ； 0019 m 为 1 到 10 的整数。 附图说明 0020 本发明可通过阅读以下的实施方式和实施例， 同时参照以下附图而更加全面地理 解 ： 0。
12、021 图 1 为合成流程图， 用以说明本发明的生物相容性高分子的合成流程。 0022 图 2 绘示用本发明的生物相容性高分子修饰的磁性纳米微粒。 具体实施方式 0023 以下描述是进行本发明的最佳模式。 本说明书是出于说明本发明的一般原理的目 的， 不应该认为是限制。本发明的范围通过参考所附权利要求而确定。 0024 本发明的生物相容性高分子由通式 (I) 所示 ： 0025 0026 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基至少之一的官能团 ； 0027 R2为烷基、 或芳基 ； 0028 n 为 5 到 1000 的整数 ； 0029 m 为 1 到 10 的整数。 0030 图 1。
13、 是合成流程图， 说明本发明的生物相容性高分子的合成流程， 其中 R1、 R2、 n 和 m 具有如上所述的含义。如图 1 中所示， 该合成方案包括利用丁二酸酐 (succinic 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A3/6 页 6 anhydride) 化合物将聚乙二醇 (PEG) 的羟基端基转换成为羧基， 然后将硅烷基偶联到该 PEG 上。适合 R1和 R2的烷基包括 C1-C20直链或具有分枝结构的烷基。在一实施例中 R1和 R2独立地为 C1-C6直链或具有分枝结构的烷基， 例如甲基， 乙基， 丙基， 异丙基， 正丁基， 仲丁 基， 叔丁基， 正戊基，。
14、 异戊基， 叔戊基， 正己基， 异己基。适合 R1和 R2的芳基包括 C6-C12有取 代基或未取代基的芳基， 例如苯基， 联苯基， 萘基等， 且其取代基的实例包括 ： 羟基， 卤烷基， 烷氧基， 氰基， 硝基， 氨基， 或烷氨基等。亚甲基单元的数目 (m) 优选为 1 到 10 的整数， 氧基 亚乙基的数目 (n) 优选为 5 到 1000 的整数 ( 相当于 PEG 的分子量大约为 200 至 50000g/ mole 的聚乙二醇 )。在一实施例中 m 大约是 3， n 大约是 15。 0031 在图 1 中合成的生物相容性聚合物是有用的， 这是因为它能够化学地修饰氧化铁 纳米微粒的表面，。
15、 从而增加生物相容性。此外， 本发明的生物相容性聚合物是有用的， 还因 为它能够标记微粒 ( 例如 ： 纳米粒子、 磁性粒子、 磁性纳米粒子、 超顺磁性粒子 )， 从而使该 微粒与靶向分子 (targeting agent)、 荧光剂、 医疗试剂、 或诊断用试剂中的一种或者多种 还具有反应性。 0032 本发明还提供一种具有生物相容性的磁性纳米微粒， 包含 ： 0033 磁性纳米微粒 ； 0034 共价偶联至该磁性纳米微粒的式 (II) 的生物相容性高分子 ： 0035 0036 其中， R1为烷基、 芳基、 羧基、 或氨基 ； 0037 n 为 5 到 1000 的整数 ； 0038 m 为。
16、 1 到 10 的整数 ； 0039 图 2 为用本发明的生物相容性高分子修饰的磁性纳米微粒的示意图。磁性纳米微 粒优选由铁、 钴、 镍、 和其氧化物中的至少一种制成。 应该理解， 该纳米微粒可由单种或者复 合磁性材料制成， 但是超顺磁性材料是特别优选的。在该生物相容性高分子化学键合至该 磁性纳米微粒之后， 可将该端基 R1转化成反应性官能团， 例如羧基或氨基， 以容许与特异性 靶向分子或 / 和荧光染剂进行偶联。但是 R1不为烷基、 芳基， 因为烷基、 芳基不能与靶向分 子或荧光染剂偶联。在一实施例中 R1是羧基。亚甲基单元的数目 (m) 优选为 1 到 10 的整 数， 氧基亚乙基的数目 。
17、(n) 优选为 5 到 1000 的整数。在一实施例中 m 大约是 3， n 大约是 15。优选将该生物相容性高分子涂覆在磁性纳米微粒上形成核壳结构。更优选该生物相容 性高分子形成涂覆在该磁性纳米微粒上的单层。 0040 实验结果表明， 本发明的生物相容性高分子可提高磁性纳米微粒的 r2 值， 达到目 前市面上的显影剂，和的 r2 值的约 2 倍， 因此当该磁性纳米微粒作为 MRI 显影剂时， 可提供的影像对比度更大提高。 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A4/6 页 7 0041 该靶向分子优选以共价键与生物相容性高分子键结。 常用的靶向分子包括 ： 抗体。
18、、 蛋白质、 肽、 酶、 糖类、 糖蛋白、 核酸、 和脂质。 在与上述靶向分子偶联后的磁性纳米微粒的粒 径大约为 3-500nm。本领域技术人员可在该纳米微粒上附接任何合适的靶向分子， 从而得 到其特异性。例如可使用叶酸分子特异性靶向 (specify) 具有叶酸受体的乳癌细胞上。叶 酸的结构容许与胺封端的或者羧基封端的生物相容性高分子偶联。例如， 叶酸容许通过形 成 -CONH- 连接基团而与胺封端的生物相容性聚合物偶联。 0042 可将荧光染剂进一步偶连至该磁性纳米微粒， 从而提供用于光学成像技术例如 NIR成像的光学信号， 由此容许通过不同的成像技术实时监视焦点。 优选将该荧光染剂以共 。
19、价键与生物相容性高分子偶联。 适当的荧光染剂包括 ： 有机染剂或无机染剂、 和有机金属络 合物等。荧光染剂的激发与发射波长可为可见光 (VIS)、 近红外光 (NIR)、 或紫外光 (UV)。 经过上述荧光染剂与靶向分子偶联后的纳米微粒， 其粒径优选为 15-200nm。 0043 不意图以任何方式限制本发明， 通过以下实施例进一步说明本发明 ： 0044 实施例 1 ： 纳米微粒的制备 0045 将 FeCl2.4H2O 11.6g(0.058mole)、 FeCl3.6H2O 11.6g(0.096mole) 与 400ml 去离 子水放入三颈瓶中， 用搅拌器以 300rpm 在 25环境。
20、下搅拌。将 2.5N NaOH(170ml) 以固定 流速 47l/ 秒滴入三颈瓶中。在添加 2.5N NaOH 后测得的 pH 值为 11 12， 加入 20ml 油 酸， 并搅拌 30 分钟。接下来缓慢添加 6N HCl 溶液， 将 pH 值调整为约 1， 由此使包覆油酸的 氧化铁微粒沉淀。收集沉淀， 用去离子水洗涤 4 5 次， 将多余的油酸洗掉， 并干燥。 0046 实施例 2 ： 生物相容性高分子 mPEG- 硅烷的合成 0047 将分子量 750 的甲氧基聚乙二醇 (mPEG)300g(0.4mol) 与 N- 甲基 2- 吡咯烷酮 600ml 置于抽真空的 1000ml 圆底烧瓶。
21、中 ( 真空度 20 托 )2 小时以上。 0048 加入丁二酸酐48g(0.48mol)与4-二甲基氨基吡啶(4-Dimethylamino-pyridine， DMAP)19.5g(0.159mol)， 在 30下反应两天。 0049 以 1ml/min 的 速 度 加 入 亚 硫 酰 氯 (thionyl chloride)36ml(0.48mol)， 并 将 混 合 物 搅 拌 2 3 小 时。 接 着 再 以 1ml/min 的 速 度 加 入 三 乙 胺 (triethylamine)133.8ml(0.96mol)。待温度冷却至室温后， 过滤混合物从而移除沉淀物， 加入 3- 氨。
22、基丙基三乙氧基硅烷 94.5ml(0.4mol) 反应至少 8 小时。 0050 将反应混合物添加到9L异丙醚中再沉淀， 收集沉淀物， 将其再溶于500ml甲苯， 并 以 5000rpm 离心 5 分钟， 收集上层清夜。再将上层清液添加到 9L 异丙醚中用于再沉淀。收 集棕色油状液体并在真空下干燥， 得到生物相容性高分子 mPEG- 硅烷。 0051 实施例 3 ： 生物相容性高分子 COOH-PEG- 硅烷的合成 0052 将分子量 750 的聚乙二醇 (PEG)300g(0.4mol) 与 N- 甲基 2- 吡咯烷酮 600ml 置于 抽真空的 1000ml 圆底烧瓶中 ( 真空度 20 。
23、托 )2 小时以上。 0053 加入丁二酸酐 96g(0.96mol) 与 4- 二甲基氨基吡啶 39.0g(0.318mol)， 在 30下 反应两天， 得到两端具有羧基的聚乙二醇 (COOH-PEG)。 0054 以 1ml/min 的速度加入亚硫酰氯 36ml(0.48mol) 并搅拌 2 3 小时。接着再以 1ml/min 的速度加入三乙胺 133.8ml(0.96mol)。待温度冷却至室温之后， 过滤该混合物从 而移除沉淀物。然后， 加入 3- 氨基丙基三乙氧基硅烷 94.5ml(0.4mol)， 反应至少 8 小时。 0055 将反应混合物添加到9L异丙醚中再沉淀， 收集沉淀物， 。
24、将其再溶于500ml甲苯， 并 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A5/6 页 8 以 5000rpm 离心 5 分钟， 收集上层清夜。再将上层清液添加到 9L 异丙醚中用于再沉淀。收 集棕色油状液体并在真空下干燥， 得到生物相容性高分子 COOH-PEG- 硅烷。 0056 实施例 4 ： 氧化铁纳米微粒表面修饰 PEG 硅烷 0057 向含有实施例 1 的 10g 氧化铁的甲苯溶液 1-1.2L 中， 加入 250g 的 mPEG- 硅烷或 COOH-PEG-硅烷， 将混合物超声处理2-3小时。 在添加1.5L去离子水之后， 将混合物用于超 滤装置进行纯化。
25、及浓缩至 100ml， 得到用生物相容性高分子修饰的氧化铁纳米微粒。 0058 实施例 5 ： 靶向分子修饰 0059 取 226l 叶酸溶液 ( 叶酸 / 二甲基亚砜 ： 10mg/ml) 于 50ml 棕色圆底瓶中。向该 溶液中加入 5ml 二甲基亚砜及 176.5l 二环己基碳二亚胺溶液 ( 二环己基碳二亚胺 / 二 甲基亚砜 ： 5mg/ml)， 并反应 1 小时。然后， 加入 98.5l NHS 溶液 (N- 羟基丁二酰亚胺 / 二 甲基亚砜 ： 5mg/ml)， 并搅拌 1 小时。然后加入 289l 乙二胺， 得到溶液 A。 0060 在真空下， 将实施例4的经由COOH-PEG-。
26、硅烷修饰的氧化铁纳米微粒1ml(4.48mg/ ml) 和 10ml DMSO 置于 50ml 圆底瓶中， 保持 1 小时。将 176.5l 二环己基碳二亚胺溶液 ( 二环己基碳二亚胺 / 二甲基亚砜 ： 5mg/ml) 添加到该溶液中并搅拌 1 小时。然后， 加入 98.5l NHS 溶液 (N- 羟基丁二酰亚胺 / 二甲基亚砜 ： 5mg/ml)， 并搅拌 1 小时， 得到溶液 B。 0061 将溶液 A 2895l(1/2 体积 ) 添加到溶液 B 中， 并搅拌 8 小时。将得到的溶液加 入透析膜(MW ： 3000)， 用水进行透析。 然后， 将该溶液通过超滤装置浓缩至2ml， 得到偶。
27、联有 靶向分子的氧化铁纳米微粒。 0062 实施例 6 ： 与荧光染剂偶联 0063 将 10-6mol/ml NIR 染剂 CypHer5E(Amersham Biosciencese 公司 )1ml 与 10-6mol 乙二胺混合并搅拌 1 小时， 得到溶液 C。 0064 将实施例 5 的 2mg/ml 已偶联叶酸的氧化铁微粒溶于 10ml 去离子水中， 接着加入 10-6mol 1- 乙基 -3-(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy l)carbodiimide ； EDC)。在将混合物搅拌 1 小时后， 加入 10-6。
28、mol N- 羟基丁二酰亚胺 (NHS ； N-hydroxysuccinimide)， 并再搅拌 1 小时， 得到溶液 D。 0065 将溶液 C 加入溶液 D 中并搅拌 8 小时。将得到的溶液装入透析膜 (MW ： 3000)， 用 水进行透析。然后， 将该溶液通过超滤装置浓缩至 2ml， 得到与荧光染剂和靶向分子偶联的 氧化铁纳米微粒。 0066 实施例 7 ： 弛豫性 (relaxivity) 测试 0067 比较实施例5的经修饰的氧化铁纳米微粒与US 2006/0216239产品及商业显影剂 即和的弛豫性 r1、 r2 值。 0068 配 制 不 同 浓 度 的 氧 化 铁 溶 液 。
29、(0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mM)， 以 来 自 BRUKER 的 Minispec mq 20 测量各浓度溶液的 T1 或 T2 弛豫时间 (relaxation time)。以弛豫时间的 倒数为纵轴， 溶液浓度为横轴， 建立线性关系。此线性关系的斜率即为 r1 或 r2 弛豫性。 0069 如表 1 所示， 本发明的修饰后的氧化铁纳米微粒的 r2 弛豫性约为 的 2 倍， 约为 US2006/0216239 的现有技术产品的 1.4 倍。因此， 由于较高的 r2 弛豫性而增加了对比度的提高。 0070 表 1、 本发明、 US2006/0216239 与目前临床用的 M。
30、RI 造影剂的 r2 与 r1 的比较 0071 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A6/6 页 9 0072 * 直径以 TEM 测量 0073 虽然本发明已以优选实施例披露如上， 然其并非用以限定本发明， 任何本发明所 属技术领域中的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围内， 应可作任意更改与润饰。因 此， 本发明的保护范围应以所附权利要求书限定的范围为准。 说 明 书 CN 102112158 A CN 102112162 A1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102112158 A CN 102112162 A2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102112158 A 。