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1、(10)授权公告号 CN 102178685 B (45)授权公告日 2012.12.05 CN 102178685 B *CN102178685B* (21)申请号 201110050754.4 (22)申请日 2011.03.03 A61K 31/575(2006.01) A61P 5/38(2006.01) (73)专利权人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 石有斐 李金莲 王丛丛 夏俊峰 李培锋 US 7772220 B2,2010.08.10, 权利要求 1-24. US 7772220 B2,2010.08.10, 权利要求 1-24。
2、. KEITH D. LILLEMOE et al.Tauroursodeoxycholic Acid is Less Damaging than Taurochenodeoxycholic Acid to the Gastric and Esophageal Mucosa. Digestive Diseases and Sciences .1983, 第 28 卷 ( 第 4 期 ),359-364. 金少琳等 . 牛磺鹅去氧胆酸对小鼠不同免疫 细胞凋亡的影响 .动物医学进展 .2007, 第 28 卷 ( 第 6 期 ),27-30. KEITH D. LILLEMOE et al.Tau。
3、roursodeoxycholic Acid is Less Damaging than Taurochenodeoxycholic Acid to the Gastric and Esophageal Mucosa. Digestive Diseases and Sciences .1983, 第 28 卷 ( 第 4 期 ),359-364. 金少琳等 . 牛磺鹅去氧胆酸对小鼠不同免疫 细胞凋亡的影响 .动物医学进展 .2007, 第 28 卷 ( 第 6 期 ),27-30. (54) 发明名称 牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上腺功能上的应用 (57) 摘要 本发明涉及牛磺鹅去氧胆酸的一种新用途。
4、， 具体涉及牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上腺功能上的 新用途， 发明人通过对牛磺鹅去氧胆酸的研究， 发 现其可以对抗肾上腺细胞凋亡， 同时促进肾上腺 皮质干细胞增殖， 进而将其应用于保护肾上腺功 能， 可以直接给药， 也可以将其制成各种剂型用于 抗应激反应或防治与肾上腺功能低下有关的其他 疾病或状态。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李林 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 牛磺鹅去氧胆酸在制备保护肾上腺功能药物中的应用， 所述牛磺鹅去氧胆酸。
5、的结构 式如下 ： 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述保护肾上腺功能是指牛磺鹅去氧胆 酸用于对抗肾上腺细胞凋亡和 / 或促进肾上腺皮质干细胞增殖。 3. 根据权利要求 2 所述的应用， 其特征在于 ： 所述保护肾上腺功能是指牛磺鹅去氧胆 酸用于抗应激反应或用于防治与肾上腺功能低下有关的疾病。 权 利 要 求 书 CN 102178685 B 2 1/4 页 3 牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上腺功能上的应用 技术领域 0001 本发明涉及牛磺鹅去氧胆酸的一种新用途， 具体涉及牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上 腺功能上的新用途。 背景技术 0002 牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenod。
6、eoxycholic Acid， TCDCA)是主要存在于鸡、 鸭、 鹅、 牛、 绵羊、 蛇等动物胆汁中的结合型胆汁酸。其化学名称为 3， 7- 二羟基 -5-24- 胆烷 酰 -N- 牛磺酸， 结构式如下 ： 0003 0004 它是由牛磺酸 (Taurine， Tau) 和鹅去氧胆酸 (Chenodeoxycholic acid， CDCA) 相 结合而成的无臭、 白色粉末、 味极苦的酸性化合物， 分子式为 C23(OH) 2H37CONHCH2CH2SO3H， 相对分子质量为 499.69。TCDCA 作为胆汁中的一种主要成分， 具有药物来源广泛、 安全、 有 效等特点。目前的研究发现 。
7、TCDCA 具有抗炎 ( 李培锋， 曹金山， 关红等 . 中兽医医药杂志， 2002， 21(1) ： 7-10)、 体液和细胞免疫调节 ( 石有斐， 李培峰， 李金莲等 . 中国药理学通报， 2007， 23(7) ： 859-864)、 抗小肠上皮细胞凋亡 (Turner DJ， Alaish SM， Zou T， et al.Ann Surg.2007， 245(3) ： 415-25) 等。 0005 肾上腺是机体重要的内分泌器官， 分泌的激素主要有盐皮质激素、 糖皮质激素和 性激素。 但由于机体衰老、 自身免疫、 结核、 真菌感染、 肿瘤、 白血病、 严重的应激反应以及长 期或大剂量。
8、使用糖皮质激素类药物等原因会引起促肾上腺功能减退。机体表现出虚弱无 力， 食欲减退， 消瘦， 低血压， 直立性晕厥， 心脏缩小等症状。采用外源性物质影响肾上腺素 的分泌是现在普遍的治疗方法， 但是牛磺鹅去氧胆酸在本领域的应用并未被发现。 发明内容 0006 发明人经过长期对生磺鹅去氧胆酸的研究， 发现其可以对抗肾上腺细胞凋亡， 同 时促进肾上腺皮质干细胞增殖， 进而获得了其在保护肾上腺功能上的应用， 通过直接给药 或者间接给药的方式， 通过牛磺鹅去氧胆酸调节肾上腺功能， 并可以根据这种用途进一步 研发保护肾上腺功能的各种药物。 0007 本发明提供了牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上腺功能上的应用， 可。
9、以直接给药， 也可 以以其为主药， 配合其他辅料制备注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 口服剂等各种剂型 的药物。 说 明 书 CN 102178685 B 3 2/4 页 4 0008 通过实验发明人发现， 当直接通过口服给药时， 可以明显减轻肾上腺组织结构的 损伤 ； 对抗地塞米松等药物引起的肾上腺细胞凋亡 ； 促进肾上腺皮质干细胞增殖 ； 而且可 以使肾上腺损伤小鼠模型的抗应激能力得到恢复， 进而证实了牛磺鹅去氧胆酸在保护肾上 腺功能上的应用。 0009 除此之外， 发明人还发现， 当在食物或饲料中直接添加牛磺鹅去氧胆酸时， 通过正 常的进食消化过程， 也可以实现对于动物肾上腺。
10、功能的保护作用， 因此也可采用上述的含 有牛磺鹅去氧胆酸的混合物的食物或饲料的形式给药。 0010 而且， 由于 TCDCA 可以良好的保护肾上腺功能， 而肾上腺功能可以直接影响到生 物体的寿命， 发明人经过对小鼠的寿命影响实验， 发现在通过直接给药的形式， 可以有效 的延长小鼠的寿命， 而在理论上， 肾上腺功能下降是衰老过程中内分泌改变的重要因素， TCDCA 有效的抑制了肾上腺动能停滞， 增强了肾上腺功能， 从而延长了寿命， 因此 TCDCA 可 以应用于防止肾上腺功能降低， 进而实现抗衰老的目的。 0011 通过上述研究， 本发明为肾上腺功能的保护， 提供了一个全新的途径， 进而为一系 。
11、列肾上腺功能保护药物的开发提供了技术基础。 0012 附图说明 0013 图 1 为实施例 1 中牛磺鹅去氧胆酸对肾上腺剖解变化的影响比对图 ； 0014 图 2 为实施例 2 中石蜡切片 HE 染色评价牛磺鹅去氧胆酸对肾上腺病理变化的影 响比对图 ； 0015 图 3 为实施例 3 中 TUNEL 法检测牛磺鹅去氧胆酸对肾上腺细胞凋亡的影响比对 图 ； 0016 图 4 为实施例 4 中采用 EdU DNA in vivo Kit 检测牛磺鹅去氧胆酸对肾上腺细胞 增殖反应的影响比对图 ； 0017 图 5 为图 1 的灰度示意图 ； 0018 图 6 为图 2 的灰度示意图 ； 0019 图。
12、 7 为图 3 的灰度示意图 ； 0020 图 8 为图 4 的灰度示意图， 0021 图 8 中各组 overlay 图片上粉红点状物为阳性增殖的肾上腺皮质细胞。 0022 具体实施方式 0023 实施例 1 0024 实验时分为正常组、 模型组和给药组， 每组均为 10 只小鼠。正常组仅灌服蒸馏水 ； 模型组采用剂量为80mg/kg地塞米松对小鼠进行腹腔注射， 连续7天， 制备小鼠糖皮质激素 类药物引起的肾上腺功能抑制模型 ； 给药组在模型制备完成后给药， 给药组 TCDCA 给药剂 量为 0.1g/kg， 给药途径为灌胃给药， 每天 1 次， 连续给药 7 天。对正常组、 模型组和中剂量。
13、 给药组进行小鼠解剖， 特别是对于肾上腺进行观察， 发现肾上腺剖解变化的影响结果见附 图 1 和附图 5 所示。可以看出， 模型组与给药组比较， 出现了充血水肿症状 ； 而给药组与正 常组比较， 肾上腺剖解变化不明显， 可见 TCDCA 可以有效减轻肾上腺的剖解病变。 0025 实施例 2 0026 实验时分为正常组、 模型组和给药组， 每组均为 10 只小鼠。正常组仅灌服蒸馏水 ； 模型组采用剂量为80mg/kg地塞米松对小鼠进行腹腔注射， 连续7天， 制备小鼠糖皮质激素 说 明 书 CN 102178685 B 4 3/4 页 5 类药物引起的肾上腺功能抑制模型 ； 给药组在模型制备完成后。
14、给药， 给药组 TCDCA 给药剂 量为0.1g/kg， 给药途径为灌胃给药， 每天1次， 连续给药7天。 石蜡切片HE染色评价TCDCA 对肾上腺病理变化的影响， 结果见附图 2 和附图 6 所示。模型组肾上腺腺管上皮细胞发生 颗粒变性、 数量减少、 腺管间质小血管淤血 ； 给药组与模型组相比较， 则明显减轻了肾上腺 组织结构的损伤。 0027 实施例 3 0028 实验时分为正常组、 模型组和给药组， 每组均为 10 只小鼠。正常组仅灌服蒸馏水 ； 模型组采用剂量为80mg/kg地塞米松对小鼠进行腹腔注射， 连续7天， 制备小鼠糖皮质激素 类药物引起的肾上腺功能抑制模型 ； 给药组在模型制。
15、备完成后给药， 给药组 TCDCA 给药剂 量为 0.1g/kg， 给药途径为灌胃给药， 每天 1 次， 连续给药 7 天。采用 TUNEL 法检测 TCDCA 对 肾上腺细胞凋亡的影响。 400倍光学显微镜下观察组织切片并拍照， 其中深染棕色细胞为凋 亡细胞， 浅染蓝色细胞为正常细胞。 在肾上腺皮质束状带连续选取3个视野， 利用Imagej软 件分析染色细胞数及总细胞数， 并计算阳性染色细胞数与总细胞数的比值即为凋亡指数。 结果见表1以及附图3和附图7， 给药组具有显著地对抗地塞米松引起的肾上腺细胞凋亡的 作用。 0029 表 1TCDCA 对肾上腺细胞凋亡的影响 0030 0031 注 ：。
16、 * 表示与正常组比较差异显著 (P 0.05) ； * 表示与正常组比较差异极显著 (P 0.01) ； 表示与模型组比较差异显著 (P 0.05) ； 表示与模型组比较差异极显 著 (P 0.01) ； 以下各表表示方法相同。 0032 实施例 4 0033 实验时分为正常组、 模型组和给药组， 每组均为 10 只小鼠。正常组仅灌服蒸馏水 ； 模型组采用剂量为80mg/kg地塞米松对小鼠进行腹腔注射， 连续7天， 制备小鼠糖皮质激素 类药物引起的肾上腺功能抑制模型 ； 给药组在模型制备完成后给药， 给药组 TCDCA 给药剂 量为 0.1g/kg， 给药途径为灌胃给药， 每天 1 次， 连。
17、续给药 7 天。采用 EdU DNA in vivo Kit 检测TCDCA对肾上腺皮质干细胞增殖反应的影响。 200倍荧光显微镜下观察， 分别用紫外光 和绿光激发照射并拍照。在肾上腺皮质束状带连续选取 3 个视野， 利用 Imagej 软件分析阳 性细胞数及总细胞数， 并计算阳性细胞数与总细胞数的比值即为增殖指数。结果可见表 2 以及附图 4 和附图 8。给药组与正常组相比较， 可以极显著地促进肾上腺皮质干细胞增殖 ； 给药组与模型组相比较， 可以使地塞米松抑制的肾上腺皮质干细胞增殖反应得到恢复并促 进增殖。 0034 表 2TCDCA 对肾上腺皮质干细胞增殖的影响 0035 说 明 书 C。
18、N 102178685 B 5 4/4 页 6 0036 实施例 5 0037 实验时分为正常组、 模型组和低剂量、 中剂量、 高剂量三个给药组， 每组均为 10 只 小鼠。正常组仅灌服蒸馏水 ； 模型组采用剂量为 80mg/kg 地塞米松对 小鼠进行腹腔注射， 连续 7 天， 制备小鼠糖皮质激素类药物引起的肾上腺功能抑制模型 ； 给药组在模型制备完 成后给药， 给药组 TCDCA 给药剂量分别为 0.05、 0.1 和 0.2g/kg， 给药途径为灌胃给药， 每天 1次， 连续给药7天。 末次给药24小时后对上述各个组均进行负重游泳应激实验， 结果见表 3。中、 高剂量组可以使模型组小鼠的抗。
19、游泳应激能力得到恢复。 0038 表 3TCDCA 对 HPA 轴抑制小鼠抗游泳应激的影响 0039 0040 实施例 6 0041 采用 4 周龄纯系昆明种雌性小鼠开展 TCDCA 对寿命影响的研究。实验分为正常组 和给药组， 每组 20 只小鼠。正常组只灌服蒸馏水 ； TCDCA 的给药剂量为每升水中 0.01g。给 药途径为饮水给药。 记录各组小鼠从出生到死亡的时间， 计算其平均寿命， 结果见表4， 可见 给药组比正常组小鼠的平均寿命延长了 12.96。 0042 表 4TCDCA 对小鼠寿命的影响 0043 说 明 书 CN 102178685 B 6 1/4 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102178685 B 7 2/4 页 8 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102178685 B 8 3/4 页 9 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102178685 B 9 4/4 页 10 图 8 说 明 书 附 图 CN 102178685 B 10 。