可生物降解纳米微球的制备方法 【技术领域】
本发明涉及的是一种药用纳米材料技术领域的产品及其制备方法，具体是一种具有标记和治疗功能的可生物降解纳米微球的制备方法。
背景技术
具有良好的生物相容性的可降解聚乳酸/乙醇酸共聚物(poly lactide-co-glycolide，PLGA)纳米微粒用于制备生物降解型缓释或定向给药体系已经研究了近30年，是国内外研究的热点。PLGA目前已获美国FDA批准用作手术缝合线，心血管支架控释药物涂层，以及注射用微囊、微球、埋植剂等的材料。根据药物的性质、给药途径和释药时间，选用不同分子量、不同光学活性的乳酸共聚，不同种丙交酯和乙交酯的聚合比例，采用相应的制备工艺来控制药物达到不同的释放模型；还可以通过PLGA优选药物的输送系统，从而获得药物的新剂型。纳米粒能够使给药局部的药物浓度长时间维持在治疗水平，减少给药次数和用药量，从而在多个层面上防止或减轻毒副作用。聚乳酸水解的最终产物是水和二氧化碳，中问产物乳酸也是体内正常糖代谢产物，故该聚合物无毒、无刺激性，并具有很好的生物相溶性。
随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质、抗体等药物不断涌现，目前已有多种重要治疗药物上市。生物技术药物的基本剂型是冻干剂，常规制剂尽管其疗效早为临床所证实，但由于半衰期短，在室温情况下又非常不稳定，需要长期频繁注射给药，从患者心理和经济负担角度看，这些都较难接受，另外，有的药物必须超过一定时间才能有效发挥作用。所以，用PLGA为载体材料，包括多肽、蛋白质、抗体等药物制成微球，能在体内达到缓释、长效目的，是近十多年来各国学者大力研究的新领域。
对药效的评价以及直观观察药物所处的位置，需要对药物进行一定的标记，目前常用的标记是核素标记和荧光染料标记，但是核素标记存在辐射和污染，而染料标记存在需要特定的波长和能量高的光源激发，发射光的光谱宽，并且红光区有拖尾，光稳定性差，检测本底高，灵敏度低等缺陷。量子点标记的荧光分析原理和检测技术与现有的荧光分析技术相似，其显著优势是具有良好的光稳定性，在持续光照射下可以维持几个小时，荧光寿命长，通过控制时间来抑制天然物质自身的荧光干扰，灵敏度高。而对于缓释药物在体内的循环过程进行监控是个长期复杂的过程，对其标记需要长时间的检测，量子点正是能满足这个需要，克服荧光染料很容易猝灭的缺陷，而且直接通过荧光成像观察到药物及其载体所处的位置，对实时观察药物疗效有很重要的作用。
经对现有技术的文献检索发现，中国专利文献号CN101327189A，记载了一种“具有标记和治疗双功能的纳米乙醇脂质体材料制备方法”，该技术将5-FU和亲水性的量子点溶解和分散在磷酸盐缓冲溶液中。以磷脂作为载体，制备含有5-FU和量子点的纳米乙醇脂质体。但是该技术存在药物包封率低，并且容易泄漏等缺点，从而导致药物及量子点的早期释放率高，从而不能达到缓释的目的。
【发明内容】
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种可生物降解纳米微球的制备方法，以生物降解材料PLGA作为载体材料，采用复乳的方法，结合量子点的荧光特性和多肽、蛋白质、抗体等药物的药效，制备成具有标记和治疗效果的可生物降解纳米微球，具有缓释的效果。
本发明是通过以下技术方案实现的：将具有荧光特性的量子点和具有治疗功能的药物包裹在可以生物降解的聚合物PLGA内，并通过复乳技术，得到纳米微球。
本发明具体包括以下步骤：
第一步，将亲水性量子点与多肽、蛋白质或抗体中的一种溶解在磷酸盐缓冲溶液中，得到水相混合物。
所述的亲水性量子点选用CdTe、CdSe、ZnS、ZnSe或者CdSe/ZnS核/壳型半导体量子点，其荧光发射波长从488nm到605nm之间。
所述的水相混合物中：亲水性量子点的浓度为0.005～0.03g/μL、多肽、蛋白质或抗体的浓度为0.1～0.5g/μL。
所述的磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。
第二步，将PLGA超声溶解于有机溶剂后加入到水相混合物中并充分搅拌，然后经超声乳化处理后，得到油包水初乳。
所述的PLGA地浓度为1～5g/μL，其中DL-LA∶GA的摩尔比为90∶10、80∶20、75∶25、60∶40或50∶50。
所述的有机溶剂为：氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一种或其组合。
所述超声乳化处理是指：设定超声功率40～100W进行超声分散1～5分钟后在700r/min条件下持续搅拌混合1小时。
第三步，将油包水初乳加入到聚乙烯醇中，经常温搅拌处理后，离心过滤水洗，获得可生物降解纳米微球。
所述的温搅拌处理是指在室温环境下以700～1000rpm/min的转速搅拌4～16小时。
所述的聚乙烯醇的浓度为0.5～10g/μL。
所述的离心过滤水洗是指离心速度在6000～12000rpm/min之间，离心时间5～30分钟，经过滤后采用去离子水洗涤3次。
本发明主要是将水溶性的量子点和具有治疗作用的药物同时包裹在可生物降解材料PLGA中，并通过复乳的方法制备成纳米微球。利用量子点的荧光标记作用，药物的治疗作用，可生物降解载体的缓释作用，以及复乳的制备方法，得到具有标记和治疗双功能的可生物降解纳米微球。
【具体实施方式】
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
第一步将0.005％发射波长为488nm水中分散的CdTe量子点和0.01％胸腺肽溶解在pH为7.4磷酸盐缓冲溶液中，得到水相混合物。
第二步将1％的PLGA(DL-LA∶GA摩尔比为90∶10)超声溶解于氯仿中。在700r/min搅拌条件下，加入到第一步的水相混合物中，40W功率超声辅助乳化3分钟，室温下持续搅拌1小时，得到油包水(W/O)初乳。
第三步在700r/min机械搅拌的条件下将第二步得到的W/O初乳加入到10毫升0.5g/μL的聚乙烯醇(PVA)中，室温、持续搅拌10小时，氯仿完全挥发，乳滴开始变硬成球，过滤并水洗3遍，得到具有标记和治疗双重功能的可生物降解纳米材料。真空冻干得冻干粉，密封后置于4℃保存。
本实施例制备得到的可生物降解纳米微球，微球是由PLGA包裹量子点和胸腺肽，经荧光分光光度计测定，具有发射波长在480～490nm的荧光，胸腺肽的包封率在40～70％之间，经激光粒度仪测量，其平均粒径在8～10微米。
本实施制备所得可生物降解纳米微球，12天后释放度为78％。实验显示所制备的荧光药物纳米球体外能够持续释药，具有明显缓释效果，并且保持良好的荧光性能。
实施例2
第一步，将0.01％荧光发射波长为530nm的水溶性量子点CdTe@CdSe和0.3％表皮生长因子(EGF)溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到水相混合物。
第二步，将3％的PLGA(DL-LA∶GA摩尔比为75∶25)超声溶解于丙酮中。在700r/min搅拌条件下，加入到第一步的水相混合物中，60W超声辅助乳化3分钟，之后室温下持续搅拌1小时，得到油包水(W/O)初乳。
第三步，在机械搅拌的条件下将第二步得到的W/O初乳加入到一定体积、适宜浓度的聚乙烯醇(PVA)中，室温、800rpm/min搅拌4小时，丙酮完全挥发，乳滴开始变硬成球，离心并水洗3遍，即可制得具有荧光标记和治疗双重功能的可生物降解纳米微球。真空冻干得冻干粉，密封后置于4℃保存。
本实施例制备得到的可生物降解纳米微球，微球是由PLGA包裹量子点和表皮生长因子，经荧光分光光度计测定，具有发射波长在520～540nm之间的荧光，表皮生长因子的包封率在30～50％之间。经激光粒度仪测量，其平均粒径在500～800纳米之间。
本实施制备所得可生物降解纳米微球，体外药物释放实验表明，第9天累积释放度51.8％，并且保持良好的荧光性能，具有明显缓释效果和荧光性能。
实施例3
第一步，将0.03％荧光发射波长为605nm的水溶性量子点CdSe@ZnS和0.005％单克隆抗体药物溶解在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，得到水相混合物。
第二步，将5％的PLGA(DL-LA∶GA摩尔比为50∶50)超声溶解于乙酸乙酯中。在700r/min搅拌条件下，加入到第一步的水相混合物中，超声辅助乳化5分钟，之后室温下持续搅拌1小时，得到油包水(W/O)初乳。
第三步，在机械搅拌的条件下将第二步得到的W/O初乳加入到10g/μL聚乙烯醇(PVA)10毫升中，在室温、1000rpm/min下搅拌20小时，乙酸乙酯完全挥发，乳滴开始变硬成球，离心并水洗3遍，即可得到具有标记和治疗双重功能的可生物降解纳米微球。真空冻干得冻干粉，密封后置于4℃保存。
本实施例制备得到的可生物降解纳米微球，微球是由PLGA包裹量子点和单克隆抗体药物，经荧光分光光度计测定，具有发射波长在520～540nm之间的荧光，单克隆抗体药物的包封率在30～50％之间，经激光粒度仪测量，其平均粒径在100～500纳米之间。
本实施制备所得可生物降解纳米微球，体外药物释放实验表明，微球能够持续释放BSA达35d以上，并且保持良好的荧光性能，具有明显缓释效果和荧光性能。