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1、(10)授权公告号 CN 102188381 B (45)授权公告日 2012.06.27 CN 102188381 B *CN102188381B* (21)申请号 201110107172.5 (22)申请日 2011.04.27 A61K 9/127(2006.01) A61K 38/22(2006.01) A61P 25/00(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路 17 号 (72)发明人 董海龙 熊利泽 仝黎 张昊鹏 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 朱海临 WO 200904。
2、9215 A1,2009.04.16, 唐宏琨 .减肥多肽 JFT 的固相合成及纯化 制备工艺研究 . 魏海等 . 纳米脂质体的制备与表征 . 中国粉 体技术 .2007, 第 13 卷 ( 第 8 期 ),147-50 页 . (54) 发明名称 orexin-A载药脂质体的制备方法及用于治疗 发作性睡眠的药剂 (57) 摘要 本发明公开了一种 orexin-A 载药脂质体的 制备方法及用于治疗发作性睡眠的药剂， 所述 orexin-A 载药脂质体的制备方法包括下述步骤 ： a. 将 orexin-A 多肽准确称量， 用磷酸盐缓冲液 配制成 20g/ml 的 orexin-A 原液 ； b.。
3、 称取一定 量的卵磷脂、 胆固醇、 膜材 PEG2000-DSPE， 溶解于 三氯甲烷中得到混合液 ； c. 将上述混合液在常温 水浴减压旋转蒸发 ； d. 蒸干物中滴加磷酸盐缓 冲液， 制得水性混悬液 ； e. 用对水性混悬液超声 3 5min， 冷至室温 ； 将步骤 a 所得 orexin-A 原 液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌 30min， 0.45m 滤膜过滤 2 次， 即得 orexin-A 载 药脂质体。 对该orexin-A载药脂质体进行冷冻干 燥即得治疗发作性睡眠的鼻喷剂 ： 将该鼻喷剂溶 于生理盐水中即得静脉注射剂。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员。
4、 张婷 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种 orexin-A 载药脂质体的制备方法， 其特征在于， 包括下述步骤 a.将orexin-A多肽准确称量， 用pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液PBS， 配制成20g/ml 的 orexin-A 原液 ； b. 称取 400mg 卵磷脂、 160mg 胆固醇、 96mg 的膜材 PEG2000-DSPE， 溶解于 100ml 三氯甲 烷中得到混合液 ； c. 将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发 ； d. 。
5、蒸干物中滴加 10ml 磷酸盐缓冲液 PBS， 制得水性混悬液 ； e. 用对水性混悬液超声 3 5min， 冷至室温 ； f. 将 10ml 的步骤 a 所得 orexin-A 原液加入超声后的水性混悬液中室温下磁力搅拌 30min， 0.45m 滤膜过滤 2 次， 即得 orexin-A 载药脂质体。 2. 根据权利要求 1 所述的 orexin-A 载药脂质体的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 a 中的 orexin-A 多肽的制备方法包括下述步骤 ； (1) 将 1g 的 Rink-MBHAresin 树脂用 10ml 的 DMF 溶液溶胀 40 分钟 ； (2) 将溶胀后的上述 R。
6、ink-MBHAresin 树脂用 DMF 溶液洗涤三次 ； (3) 洗涤后的 Rink-MBHAresin 树脂加入 10ml 的 DMF 溶液反应 20 分钟 ； (4) 在步骤 (3) 反应后的溶液中加入 3 倍于溶液质量的 Fmoc-L-Leu-OH， 和 4 倍于溶液 质量的 HOBT 和 DIC， 以及 10ml 的 DMF 溶液， 反应 45 分钟， 得到连接有多肽分子的树脂 ； (5) 将步骤 (4) 连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗， 冻干后用 95三氟乙酸溶液浸泡 1 2 小时， 将树脂上的多肽分子切掉 ； 将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预冷的 乙醚中， 得到白色沉淀。
7、即为还原型 orexin-A 多肽 ； (6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH值为7.2-7.6的磷酸盐 缓冲液 PBS 中， 并用 1的 H2O2氧化， 12-36 小时后停止氧化， 得到氧化的 orexin-A 多肽。 3. 一种治疗发作性睡眠的鼻喷剂， 其特征在于， 该鼻喷剂为 ： 对权利要求 1 所述的 orexin-A 载药脂质体进行冷冻干燥所得。 4. 一种治疗发作性睡眠的静脉注射剂， 其特征在于， 该静脉注射剂为 ： 对权利要求 3 所 述的经冷冻干燥所得鼻喷剂溶于生理盐水中获得。 权 利 要 求 书 CN 102188381 B 2 1/6 。
8、页 3 orexin-A 载药脂质体的制备方法及用于治疗发作性睡眠 的药剂 技术领域 0001 本发明涉及一种人工合成orexin-A(食欲素A)载药脂质体的制备方法， 以及含有 所得载药脂质体的用于治疗发作性睡眠的两种常用药剂。 背景技术 0002 发作性睡眠病是以不可抗拒的短期睡眠发作为特点的一种疾病， 多发生于儿童和 青春期的青少年， 成年人偶有发生。大多数学者认为， 该病是由于睡眠介质紊乱引起， 部分 病人有脑炎和颅脑外伤史。 也可以发生在免疫功能低下、 脑肿瘤、 多发性硬化或者情绪紧张 之后。约有 10 30的病人有家族遗传史， 多数病人没有明显的诱因。发作性睡眠的发 病病因尚未完全。
9、明确， 但最近有学者提出自身免疫假说。研究发现， 发作性睡眠和 HLA 一些 基因变化存在着相关性， HLA 的复杂多样性可以增加机体自动免疫反应的能力， 从而使下丘 脑神经元产生一种名为食欲素的蛋白质， 其作用是控制食欲和睡眠。而患有发作性睡眠的 病人， 其下丘脑内能产生食欲素的神经元明显降低。治疗发作性睡眠要根据个人症状和治 疗反应， 治疗可能需要数月或者更长的时间， 药物要经常进行调整。 目前发作性睡眠的主要 治疗方案是口服安非他明、 甲基苯丙胺或者莫达非尼。 0003 Orexin-A 是存在于下丘脑的一种神经多肽， 参与调节摄食、 睡眠 - 觉醒周期、 生 殖、 体温、 血压、 激素。
10、分泌和感觉等生理功能。1998 年 Yanagisawa 等在大鼠下丘脑腹外侧 发现了两种与食欲有关的神经肽， 命名为 orexin-A( 食欲素 -A) 和 orexin-B( 食欲素 -B)。 近年来有多项研究证实 orexin 系统功能受损可导致多种神经系统疾病的发生， 例如睡眠 障碍、 急性颅脑损伤、 蛛网膜下腔出血等。有研究发现， 发作性睡眠的发生是由于下丘脑内 orexin蛋白质表达降低所导致。 因此， 我们推测用脂质体包裹神经多肽orexin-A可治疗发 作性睡眠。 0004 目前国际上在使用 orexin 治疗中枢神经系统疾病时大部分还仅限于脑室给药， 然而这种给药方式易引起损。
11、伤和感染， 给临床应用带诸多不便， 限制了其在临床上的应用。 发明内容 0005 为解决 orexin-A 治疗中脑室给药所存在的问题， 本发明的目的是提供一种采用 脂体包裹orexin-A的制备工艺， 可以得到纳米级orexin-A脂质体， 使载药脂质体更易穿透 血脑屏障， 增加其脑组织药物摄入量， 增加 orexin-A 在体内的稳定性， 达到了较好的疗效。 0006 为达到以上目的， 本发明是采取如下技术方案予以实现的 ： 0007 一种 orexin-A 载药脂质体的制备方法， 其特征在于， 包括下述步骤 ： 0008 a. 将 orexin-A 多肽准确称量， 用 pH 为 7.2-。
12、7.6 的磷酸盐缓冲液 PBS， 配制成 20g/ml 的 orexin-A 原液 ； 0009 b. 称取 400mg 卵磷脂、 160mg 胆固醇、 96mg 的膜材 PEG2000-DSPE， 溶解于 100ml 三 氯甲烷中得到混合液 ； 说 明 书 CN 102188381 B 3 2/6 页 4 0010 c. 将上述混合液在常温水浴减压旋转蒸发 ； 0011 d. 蒸干物中滴加 10ml 磷酸盐缓冲液 PBS， 制得水性混悬液 ； 0012 e. 用对水性混悬液超声 3 5min， 冷至室温 ； 0013 f.将10ml的步骤a所得orexin-A原液加入超声后的水性混悬液中室温。
13、下磁力搅 拌 30min， 0.45m 滤膜过滤 2 次， 即得 orexin-A 载药脂质体。 0014 上述方法中， 所述步骤a中， orexin-A多肽可采用商售的产品(美国Tocris公司， No.1455)， 也可采用本发明自制的 orexin-A 多肽， 其制备方法包括以下步骤 ； 0015 (1) 将 1g 的 Rink-MBHAresin 树脂用 10ml 的 DMF 溶液溶胀 40 分钟 ； 0016 (2) 将溶胀后的上述 Rink-MBHAresin 树脂用 DMF 溶液洗涤三次 ； 0017 (3) 洗涤后的 Rink-MBHAresin 树脂加入 10ml 的 DMF。
14、 溶液反应 20 分钟 ； 0018 (4) 在步骤 (3) 反应后的溶液中加入 3 倍于溶液质量的 Fmoc-L-Leu-OH， 和 4 倍于 溶液质量的HOBT和DIC， 以及10ml的DMF溶液， 反应45分钟， 得到连接有多肽分子的树脂 ； 0019 (5) 将步骤 (4) 连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗， 冻干后用 95三氟乙酸溶液 浸泡12小时， 将树脂上的多肽分子切掉 ； 将切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入预 冷的乙醚中， 得到白色沉淀即为还原型 orexin-A 多肽 ； 0020 (6)将还原性orexin-A多肽以浓度为0.5-1mg/ml的量加入PH值为7.2-7.6。
15、的磷 酸盐缓冲液 PBS 中， 并用 1的 H2O2氧化， 12-36 小时后停止氧化， 得到氧化的 orexin-A 多 肽。 0021 本发明的另一目的是提供两种治疗发作性睡眠的常用药剂， 其中之一为鼻喷剂， 该鼻喷剂的特征在于 ： 对本发明前述方法所得的 orexin-A 载药脂质体进行冷冻干燥即可。 另一种为静脉注射剂， 该静脉注射剂的特征在于 ： 对经冷冻干燥所得鼻喷剂， 将其溶解于生 理盐水中即可临床使用。 0022 与现有莫达非尼作为已知的治疗发作性睡眠的药物相比， 通过动物实验， 本发明 的优点在于 ： 0023 1、 在制备工艺中可通过分次载药提高载药率， 通过超声处理和滤膜。
16、过滤相结合降 低脂质体粒径， 可以得到纳米级 orexin-A 脂质体。 0024 2、 采用本发明脂质体包裹 orexin-A 可以防止 orexin-A 被体内的酶所降解， 从而 提高其稳定性， 延长其体内半衰期， 具有较好的发挥 orexin-A 生物活性的能力。 0025 3、 本发明所提供的 orexin-A 脂质体鼻喷剂 ( 或注射剂 ) 可明显提高大鼠觉醒时 间， 从而提高治疗发作性睡眠的疗效。 0026 此外， 由于 orexin-A 是正常存在于人体中的一种神经多肽， 因此就开发成药品的 角度而言， 其具有毒副作用小， 对正常生理功能干扰小等独特优势， 研制开发 orexin。
17、-A 类 药物用于治疗发作性睡眠具有广泛的应用前景。 0027 说明书附图 0028 图 1 为传统工艺与改良工艺脂质体包封率比较。 0029 图 2 为 orexin-A 脂质体、 orexin-A 与空白组 12h 活动时间比较。 0030 图 3 为 orexin-A 给药前与给药后 12h 活动时间比较 0031 图 4 为 orexin-A 不同剂量组 24h 总体活动时间。 0032 图 5 为 orexin-A 与莫达非尼给药前后 12h 活动时间。 说 明 书 CN 102188381 B 4 3/6 页 5 具体实施方式 0033 以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。 。
18、0034 实施例 1 0035 一种 orexin-A 载药脂质体的制备方法， 包括下述步骤 ： 0036 a、 准确称量 orexin-A， 用 pH 7.2-7.6 的 PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 配制成质量浓 度为 20g/mlorexin-A 原液 ； 其中 orexin-A 多肽采用商售的产品 ( 美国 Tocris 公司， No.1455) ； 0037 b、 称取卵磷脂 400mg， 胆固醇 160mg， 膜材 PEG2000-DSPE( 长循环脂质体 )96mg， 溶 解于 100ml 三氯甲烷中得到混合液 ； 0038 c、 将上述混合液于 30水浴减压旋转蒸发 ； 0039。
19、 d、 蒸干后滴加 PBS 溶液 10ml， 制得水性混悬液 ； 0040 e、 探头式超声仪超声 3min， 冷至室温 ； 0041 f、 将 orexin-A 原液 5ml 加入水性混悬液中超声 1min 后， 再加入 orexin-A 原液 5ml， 室温下磁力搅拌 30min， 0.45m 滤膜过滤 2 次， 即得 orexin-A 载药脂质体， 终浓度 10g/ml。 所得载药脂质体平均粒径54.55.6nm， 包封率也从原来的72提高到98(图 1)。 0042 对所得脂质体微囊和包裹于其中的神经多肽食欲素 -A， 可应用制备治疗发作性睡 眠的凝胶剂、 喷雾剂、 溶液剂、 混悬剂、。
20、 粉针剂。例如对实施例 1 所制备的 orexin-A 载药脂 质体进行冷冻干燥即得鼻喷剂。或将该 orexin-A 载药脂质体的鼻喷剂溶于生理盐水中， 可 用于腹腔及静脉注射。 0043 实施例 2 0044 另一种 orexin-A 载药脂质体的制备方法， 与实施例 1 不同的是， 其中的 orexin-A 多肽采用自制的合成 orexin-A， 包括下述步骤 ： 0045 合成原料 ： 多肽合成用树脂 Rink-MBHAresin( 美国默克公司出品 ) 0046 有机溶剂 ： DMF( 二甲基甲酰胺 )， 甲醇， 乙醚。TFA( 三氟乙酸 ) 溶液 0047 其它试剂 ： 1- 羟基苯。
21、并三唑 (HOBT)， N， N- 二异丙基碳二亚胺 (DIC) 0048 称取 1g 的 Rink-MBHAresin 树脂用 10mlDMF 溶胀 40 分钟。 0049 溶胀后的上述 Rink-MBHAresin 树脂用 DMF 洗涤三次 0050 洗涤后的 RinK-MBHAresin 树脂加入 10ml 的 DMF 溶液反应 20 分钟， 脱去树脂上 的 Fmoc 保护基团。 0051 在步骤反应后的溶液中加入 3 倍量的 Fmoc-L-Leu-OH( 金思特科技有限公司 生产的 )， 和 4 倍量的 HOBT， DIC， 以及 10ml 的 DMF， 反应 45 分钟， 反应后得到。
22、连接有多肽分 子的树脂， 并用茚三酮检验连接效率。 0052 将连接有多肽分子的树脂用甲醇清洗， 冻干后用质量浓度 95 TFA 溶液浸泡 2 小时， 树脂上的多肽分子被切掉， 进入 TFA 溶液中， 将溶液迅速倒入预冷的乙醚中， 得到白 色沉淀， 然后通过 HPLC( 高效液相色谱法 ) 纯化， 得到纯度大于 98的产品， 即为还原型 orexin-A 多肽。 0053 将还原性 orexin-A 多肽以浓度为 0.5-1mg/ml 的量加入 PH 7.4 的磷酸盐缓 说 明 书 CN 102188381 B 5 4/6 页 6 冲液 (PBS) 中溶解， 用质量浓度 1的 H2O2氧化， 。
23、12-36 小时后停止氧化， 通过 HPLC 监测并 纯化， 得到氧化的 orexin-A 多肽。通过质谱检验， 比对氧化的样品和标准对照品。 0054 鼻腔注射 orexin-A， 监测大鼠觉醒时间 0055 1. 实验方法 0056 1.1 动物分组及实验计划 0057 1.1.1orexin-A与orexin-A脂质体(本发明实施例1所得orexin-A载药脂质体) 比较 0058 此部分实验共采用 18 只 SD 大鼠， 随机分为 3 组 ： 对照组、 orexin-A 组、 orexin-A 脂质体组。三组每隔 4 小时分别鼻腔注射相应剂量生理盐水 (0.1ml)、 orexin-A。
24、 脂质体 10g/kg( 用 PBS 溶解稀释成 0.1ml)、 orexin-A10g/kg( 用 PBS 溶解稀释成 0.1m)， 放于 视频系统下观察大鼠 12 小时内总体活动时间。 0059 1.1.2orexin-A 脂质体与空白组自体比较 0060 此部分实验共采用 12 只 SD 大鼠。实验第 1 日所有大鼠均每隔 4 小时给予生理盐 水， 放于视频系统下观察大鼠 12 小时内总体活动时间， 作为该大鼠活动时间标准。实验第 2 日， 大鼠每隔 4 小时鼻腔注射 orexin-A 脂质体 30g/kg( 用 PBS 溶解稀释成 0.5ml)， 放 于视频系统下观察大鼠 12 小时内。
25、总体活动时间。 0061 1.1.3orexin-A 脂质体与空白组异体比较 0062 此部分实验采用 24 只 SD 大鼠， 随机分为 3 组 ： 对照组、 orexin-A 脂质体 30g/kg 组 (OXA-30)、 orexin-A 脂质体 100g/kg 组 (OXA-100)。三组每隔 6 小时分别鼻腔注射溶 剂 (NaCl， 0.5ml) 或相应剂量的 orexin-A 脂质体 (0.5ml， 用 PBS 溶解稀释成不同浓度 )， 放 于视频系统下观察大鼠 24h 内总体活动时间。 0063 1.1.4orexin-A 脂质体与莫达非尼组比较 0064 根据第三部分实验结果， 我。
26、们选择 30g/kg 作为 orexin-A 脂质体治疗组的给药 剂量， 与已知可以治疗发作性睡眠的的药物莫达非尼进行比较， 进一步检验其治疗发作性 睡眠的效果。此部分实验采用 12 只 SD 大鼠， 随机分为 2 组 ： 莫达非尼组、 orexin-A 脂质体 30g/kg 组 (OXA-30)。实验第 1 日所有大鼠均每隔 4 小时给予生理盐水， 放于视频系统下 观察大鼠 12 小时内总体活动时间， 作为该大鼠活动时间标准。实验第 2 日， OXA-30 组大鼠 每隔 4 小时鼻腔注射给药 30mg/kg， 对照组每隔 4 小时莫达非尼灌胃 50mg/kg， 放于视频系 统下观察大鼠 12。
27、 小时内总体活动时间。 0065 1.2 统计学处理 0066 采用 SPSS13.0 统计分析软件进行所用实验数据统计学分析。计量资料用 xs 表 示， 采用非参数检验 (Kruskal-Wallis H 法 )， P 0.05 为差异具有统计学意义。 0067 2. 实验结果 0068 2.1orexin-A 与 orexin-A 脂质体比较 0069 图 2 示出了 orexin-A 脂质体、 orexin-A 与空白组 12h 活动时间比较。表 1 显示 大鼠 12h 内平均总体活动时间。通过鼻腔注射 orexin-A 与 orexin-A 脂质体均能明显提高 大鼠 12h 内总体活动。
28、时间， 且 OXA 脂质体组优于 OXA 组， 对于提高大鼠总体活动时间有统计 学意义 (P 0.05)。 0070 表 1 说 明 书 CN 102188381 B 6 5/6 页 7 0071 0072 2.2orexin-A 脂质体与空白组自体比较 0073 图 3 示出了 orexin-A 给药前与给药后 12h 活动时间比较， 表 2 显示大鼠 12h 内平 均总体活动时间。 通过鼻腔注射orexin-A脂质体能明显提高大鼠12h内总体活动时间。 给 药后对于提高大鼠总体活动时间有统计学意义 (P 0.05)。 0074 表 2 0075 0076 2.3orexin-A 脂质体与空。
29、白组异体比较 0077 图 4 示出了 orexin-A 不同剂量组 24h 总体活动时间， 表 3 显示各组大鼠 24h 内平 均总体活动时间。 通过鼻腔注射orexin-A脂质体能明显提高大鼠24h内总体活动时间。 给 药组与对照组相比有明显统计学差异 (P 0.05)。 0078 表 3 0079 0080 2.4 与莫达非尼比较 0081 图 5 示出了 orexin-A 与莫达非尼给药前后 12h 活动时间。表 4 显示两组大鼠 12h 内平均总体活动时间。通过鼻腔注射 orexin-A 脂质体和莫达非尼灌胃均能明显提高给予 生理盐水的大鼠 12h 内的总体活动时间， 并且 OXA-。
30、30 组的效果明显优于莫达非尼组。 0082 表 4 0083 说 明 书 CN 102188381 B 7 6/6 页 8 0084 3. 结论 0085 结果表明， 外源性给予 orexin-A 纳米脂质体可明显提高大鼠活动时间， 其中以食 欲素 A 脂质体制备成 30g/kg 或 100g/kg， 用于治疗发作性睡眠效果最佳。 0086 本发明上述实验证实外源性给予 orexin-A 纳米脂质体具有延长动物活动时间 的作用。由于 orexin-A 是正常存在于人体中的一种神经多肽， 因此就开发成药品的角度 而言， 其具有毒副作用小， 对正常生理功能干扰小等独特优势。我们有理由相信， 研制开发 orexin-A 类药物， 改变患者体内的 orexin-A， 将会对治疗发作性睡眠有良好的疗效。 说 明 书 CN 102188381 B 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102188381 B 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102188381 B 10 3/3 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 102188381 B 11 。