含有乳酸菌的组合物、HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201680007401.7

申请日:

20160128

公开号:

CN107249627A

公开日:

20171013

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

A61K39/12,A61P15/00,A61P31/20,A61P35/00,C07K14/025,C12N1/20,C12N15/09,C12R1/245

主分类号:

A61K39/12,A61P15/00,A61P31/20,A61P35/00,C07K14/025,C12N1/20,C12N15/09,C12R1/245

申请人:

国立大学法人东京大学,公益财团法人日本健康科学振兴财团

发明人:

川名敬,五十君静信

地址:

日本东京

优先权:

2015-017407

专利代理机构:

北京纪凯知识产权代理有限公司

代理人:

王永伟;赵蓉民

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内容摘要

一种含有乳酸菌的组合物、以及包含所述含有乳酸菌的组合物的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂,所述含有乳酸菌的组合物是含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物,所述来自HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1×108个乳酸菌菌体0.03μg~1.0μg。

权利要求书

1.一种含有乳酸菌的组合物,其特征在于:其是含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物,所述来自HPVE7蛋白质的多肽的含量为每1×10个乳酸菌菌体0.03μg~1.0μg。 2.根据权利要求1所述的含有乳酸菌的组合物,其中来自HPVE7蛋白质的多肽结合在乳酸菌的菌体表面。 3.根据权利要求1所述的含有乳酸菌的组合物,其中来自HPVE7蛋白质的多肽在乳酸菌的菌体表面被表达。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的含有乳酸菌的组合物,其中乳酸菌为干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)。 5.一种HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物,其特征在于:包含权利要求1至4中任一项所述的含有乳酸菌的组合物。 6.根据权利要求5所述的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物,其用于治疗宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病。 7.一种粘膜免疫诱导剂,其特征在于:包含权利要求1至4中任一项所述的含有乳酸菌的组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV,Human Papilloma Virus)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物、以及包含所述含有乳酸菌的组合物的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂。

背景技术

人乳头状瘤病毒(HPV)是DNA病毒,迄今已报告有100种以上的不同类型。所述HPV通过感染皮肤(例如HPV1、HPV2)或粘膜表面(例如HPV6、HPV11),而形成以数月至数年为单位存在的良性肿瘤(疣)。

此外,所述HPV中有15种分型(例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58等)通过长期感染粘膜,而引发恶性肿瘤,因此被称为高危型HPV。

关于作为女性特有癌的患病率仅次于乳腺癌的宫颈癌,几乎100%的宫颈癌是因所述HPV长期感染生殖器而发病,全世界每年报告有53万名新增患者,日本每年报告有1万5千名新增患者。

因宫颈癌导致的一年的死亡人数在全世界达到27万人,在日本达到3,500人。

理论上,只要能够将所述HPV的全部感染防范于未然,则可以完全根除所述宫颈癌。

已明确所述HPV的感染除所述宫颈癌以外,还关系到外阴癌、肛门癌、口腔癌、阴道癌、阴茎癌、咽喉癌、以及尖锐湿疣(生殖器疣),为了预防这些癌及性传播疾病,认为有效的是针对所述HPV感染的预防疫苗。但是,现有的HPV预防疫苗只能预防高危型HPV中的2种分型。

所述HPV中,特别是HPV16与HPV18在日本女性的所述宫颈癌的发病原因中约占65%,尤其对于20~30岁的女性而言HPV16与HPV18在宫颈癌的发病原因中约占90%。

已知所述HPV16与所述HPV18在被视为所述外阴癌前期病变的外阴上皮内瘤变的高度病变中也占据将近50%的发病原因,还与有可能发展为所述阴道癌的阴道上皮内瘤变的85%的发病有关。

因所述HPV感染导致的所述宫颈癌的癌前病变、即宫颈上皮内瘤变(CIN,Cervical Intraepithelial Neoplasia)发生在子宫阴道部(宫颈部的下半部分、突出至阴道的部分)的粘膜上皮。HPV感染症是因性行为引起的微细损伤导致HPV侵入粘膜上皮(复层扁平上皮)的基底细胞,而在扁平上皮内进行病毒增殖的病毒感染症。如果HPV在上皮内长期持续增殖,则上皮细胞产生永生化、癌化。认为这是宫颈癌的起源。

在所述宫颈癌的产生过程中,如果所述HPV在基底细胞中持续增殖,则认为会产生如下变化:一部分HPV的病毒基因被插入至上皮细胞基因,而使低水平的E6蛋白质与E7蛋白质的表达持续亢进。

所述E6蛋白质与所述E7蛋白质的表达在作为病毒感染像的CIN1(轻度非典型增生)中非常低,相对于此,在已形成肿瘤的CIN2(中度非典型增生)与CIN3(高度非典型增生)中确认到高度表达,因此认为所述E6蛋白质与所述E7蛋白质的表达的持续亢进是发生在所述CIN2之后。

所述HPV的所述E6蛋白质与所述E7蛋白质中,特别是所述E7蛋白质被认为是在针对HPV相关癌症的治疗用疫苗的开发中非常有吸引力的标靶。其原因在于,E7蛋白质在人体内的抗原性高。

目前为止,虽然已经开发出若干以所述HPV E7蛋白质作为抗原的所述治疗用疫苗(例如参照非专利文献1、专利文献1),但并未揭示这些治疗用疫苗排除患者宫颈部的癌前病变(所述CIN)或癌细胞,强烈期待开发出实际具有治疗效果的疫苗。

本发明人等发现,在所述HPV16的所述E7蛋白质中将和与所述Rb蛋白质结合相关的第21号Asp、第24号Cys及第26号Glu全部被置换为Gly,使所获得的变异型E7蛋白质(序列编号2)在干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)中进行表达,并通过热处理而死菌化,并且进行干燥、粉末化而获得疫苗(LacE7),对小鼠口服给药所获得的疫苗(LacE7),由此显示出不仅在脾脏,而且在粘膜中也可以诱导E7特异性细胞免疫应答(参照非专利文献2)。

另外,本发明人等也推进研究有关HPV的E7多肽与具有营养强化作用的中药的组合作为HPV感染症治疗用口服医药组合物(参照专利文献2)。

根据迄今为止本发明人等的研究,正在开发起到一定程度临床效果的疫苗。

然而,所述治疗疫苗仅限于从CIN3(高度非典型增生)消退为CIN2(中度非典型增生)的消退效果,难以实现正常化。为了进一步提高宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病的患者的临床效果而实现正常化,强烈要求尽快提供具有更优异的粘膜免疫诱导能力的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1:日本专利特表2012-514469号公报

专利文献2:国际公开第2013/191225号

[非专利文献]

非专利文献1:H.Poo et al.,Int J.Cancer,2006,vol.119,pp.1702-1709

非专利文献2:K.Adachi et al.,Vaccine,2010,vol.28,pp.2810-2817

发明内容

[发明所要解决的问题]

本发明的课题在于解决现有的所述各种问题而达成以下目的。即,本发明的目的在于提供具有优异的粘膜免疫诱导能力的含有乳酸菌的组合物、以及包含所述含有乳酸菌的组合物的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂。

[解决问题的技术手段]

解决所述问题的技术手段如下所述。即,

<1>一种含有乳酸菌的组合物,其特征在于:其是含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物,并且

所述来自HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1×108个乳酸菌菌体0.03μg~1.0μg。

<2>一种HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物,其特征在于:包含所述<1>所记载的含有乳酸菌的组合物。

<3>一种粘膜免疫诱导剂,其特征在于:包含所述<1>所记载的含有乳酸菌的组合物。

[发明的效果]

根据本发明,能够解决现有的所述各问题,从而达成所述目的,可以提供具有优异的粘膜免疫诱导能力的含有乳酸菌的组合物、以及包含所述含有乳酸菌的组合物的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂。

附图说明

图1A是制造例1中的pQE31::cA=E7Rb的示意图。

图1B是表示制造例1的FACS分析结果的图-1。

图1C是表示制造例1的FACS分析结果的图-2。

图1D是表示通过蛋白质印迹(Western blot)法对各种蛋白质进行确认后的结果的一例的图。

图2A是制造例2中的pIGM2::E7Rb=prtP锚定序列的示意图。

图2B是表示制造例2的FACS分析结果的图。

图3A是表示试验例1的FACS分析(测定条件为电压(Voltage):525)结果的图。

图3B是表示试验例1的FACS分析(测定条件为电压:600)结果的图。

图4是表示试验例2的ELISPOT分析结果的图表。

图5是表示试验例3的ELISPOT分析结果的图表。

具体实施方式

(含有乳酸菌的组合物)

本发明的含有乳酸菌的组合物至少包含在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌,且根据需要还包含其他成分。

<乳酸菌>

所述乳酸菌没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选乳酸杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌,就确认到1型辅助T细胞(Th1)的诱导能力的方面而言,更优选干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)。所述乳酸菌可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

所述含有乳酸菌的组合物也可以含有在菌体表面不具有所述来自HPV E7蛋白质的多肽的乳酸菌,但在菌体表面具有所述来自HPV E7蛋白质的多肽的乳酸菌的含有比率优选80%以上,更优选90%以上,特别优选95%以上。

<<来自HPV E7蛋白质的多肽>>

作为所述来自HPV E7蛋白质的多肽,只要具有抗原性,则没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

所述HPV的分型没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选属于癌症相关的高危型群的HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53、HPV63,更优选HPV16、HPV18,特别优选HPV16。所述HPV16的E7蛋白质是在以宫颈癌为代表的HPV相关癌(肛门癌、咽喉癌、阴茎癌、外阴癌、阴道癌等)中进行组成型表达(constitutive expression)的癌抗原。

所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是所述HPV E7蛋白质的全长蛋白质,也可以是缺失、置换或添加了1个至多个氨基酸的蛋白质。

另外,所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是来自野生型E7蛋白质的多肽,也可以是来自变异型E7蛋白质的多肽。

所述来自HPV E7蛋白质的多肽中,优选将相当于HPV16的野生型E7蛋白质(序列编号1)中的第21号Asp、第24号Cys及第26号Glu的和E7蛋白质与Rb蛋白质的结合相关的氨基酸残基置换为其他氨基酸残基的变异型E7蛋白质,更优选将HPV16的野生型E7蛋白质(序列编号1)的第21号Asp、第24号Cys及第26号Glu全部置换为Gly的变异型E7蛋白质(序列编号2)。

-含量-

作为所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量,只要为每1×108个乳酸菌菌体0.03μg~1.0μg,则没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选0.03μg~0.3μg,更优选0.06μg~0.3μg,特别优选0.09μg~0.3μg。如果在所述优选的范围内,则能够发挥更优异的药理效果(粘膜免疫诱导能力),在该方面有利。

测定所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量的方法没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举通过使用对HPV E7蛋白质具有特异性的抗体的流式细胞仪(Flow cytometer)(FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting,荧光激活细胞分选))进行测定的方法等。

在利用所述FACS进行测定的方法中,通过在与所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量已知的样品相同的条件下进行测定,能够测定所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量未知的样品含量。

<<形态>>

所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是结合在乳酸菌的菌体表面的多肽(以下有时称为“E7蛋白质结合型乳酸菌”),也可以是在乳酸菌的菌体表面被表达的多肽(以下有时称为“E7蛋白质表达型乳酸菌”)。另外,也可以是将两者组合而成的形态。

另外,所述乳酸菌可以是活菌,也可以是死菌。

制成所述死菌的方法没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举利用高压釜在80℃下加热处理5分钟的方法等。

-E7蛋白质结合型乳酸菌-

所述E7蛋白质结合型乳酸菌可以通过如下方式进行制造:使通过使用转化细菌的基因重组方法或化学合成方法等所制造的所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在乳酸菌的菌体表面。

关于所述来自HPV E7蛋白质的多肽,就成本等方面而言,优选为使用转化细菌的基因重组方法。

用作所述基因重组方法的宿主的细菌没有特别限制,可以根据目的进行选择,例如可以列举:酵母、大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌等。

作为适于所述细菌中所述来自HPV E7蛋白质的多肽的表达的表达载体,没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举pQE31等。

所述转化的方法没有特别限制,可以适当选择公知方法。

由所述转化菌生产的所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以适当选择公知方法进行精制。

作为使所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在所述乳酸菌的菌体表面的方法,没有特别限制,可以适当选择共价键结合、电性结合等公知方法,优选经由锚定蛋白质电性结合在所述乳酸菌的菌体表面的方法。

所述锚定蛋白质没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举来自AcmA的作为细胞壁结合蛋白的cA等,该AcmA是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的肽聚糖水解酶。

在经由所述锚定蛋白质将所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在所述乳酸菌的菌体表面的情况下,所述来自HPV E7蛋白质的多肽优选设为与所述锚定蛋白质的融合蛋白质。

所述融合蛋白质中的所述锚定蛋白质与所述来自HPV E7蛋白质的多肽的顺序没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选依序融合所述锚定蛋白质与所述来自HPV E7蛋白质的多肽的形态。作为所述优选形态的具体例,可以列举序列编号3所表示的序列。

所述电性结合(以下有时称为“固定化”)的方法没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举对所述乳酸菌添加包含所述来自HPV E7蛋白质的多肽的溶液并进行混合的方法等。

所述混合时间没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举1小时左右等。

所述电性结合的方法中,也可以进行预处理。

所述预处理没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举加热处理等。通过所述加热处理,使所述乳酸菌成为死菌。

所述加热处理的条件没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举在100℃下加热30分钟等。

所述加热处理可以在使所述乳酸菌悬浮在三氯乙酸(TCA,Trichloroacetic Acid)的状态下进行,也可在使所述乳酸菌悬浮在PBS(Phosphate Buffer Saline,磷酸盐缓冲生理盐水)的状态下进行。

-E7蛋白质表达型乳酸菌-

所述E7蛋白质结合型乳酸菌可以通过对如下乳酸菌进行培养而制造,该乳酸菌是使用包含编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸的表达载体进行转化而成。

所述表达载体没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举pIGM2等。所述pIGM2在短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC1559的S-层蛋白质的启动子序列的下游具有短乳酸杆菌ATCC1559的prtP基因的分泌信号,且在这些序列的下游具有来自干酪乳酸杆菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei))。

作为所述表达载体的其他例,可以列举:包含repE变异基因、来自乳酸菌的醛缩酶启动子(Aldolase Promoter,Pald)以及选自由pgsB、pgsC及pgsA所组成的族群中的聚谷氨酸合成酶复合体基因的载体(参照日本专利特表2012-514468号公报、日本专利特表2012-514469号公报)等。

所述转化的方法没有特别限制,可以适当选择公知的方法。

在设为所述E7蛋白质表达型乳酸菌的情况下,编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸优选设为与锚定基因结合的核酸。

所述锚定基因没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选来自干酪乳酸杆菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei))。

编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸与所述锚定基因的顺序没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选依序结合编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸与所述锚定基因的形态。作为所述优选形态的具体例,可以列举序列编号4所表示的序列。

所述E7蛋白质表达型乳酸菌所使用的乳酸菌没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,优选干酪乳酸杆菌IGM393株、干酪乳酸杆菌IGM394株。所述干酪乳酸杆菌IGM394株是所述干酪乳酸杆菌IGM393株的继代衍生株,是转化效率高的变异株。所述干酪乳酸杆菌IGM393株及干酪乳酸杆菌IGM394株在干酪乳酸杆菌BL23株的全基因组序列中同源性最高。

所述E7蛋白质表达型乳酸菌的培养方法没有特别限制,可以适当选择公知的方法。

作为将所述E7蛋白质表达型乳酸菌中的所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的表达量加以调节的方法,没有特别限制。可以根据目的进行适当选择,例如可以列举调整培养液的pH值的方法等。

如下述制造例2所示,通过使用改变碳酸氢钠的浓度而调整了培养液的pH值的培养液,可以调节所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的表达量。

所述培养液的pH值有特别限制,可以根据目的进行适当选择,pH值优选7左右。

在所述来自HPV E7蛋白质的多肽为与所述锚定蛋白质的融合蛋白质的情况下,所述融合蛋白质在菌体表面的含量没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,每1×108个乳酸菌菌体,优选0.1μg~3.3μg,更优选0.1μg~1.0μg,进而优选0.2μg~1.0μg,特别优选0.3μg~1.0μg。如果在所述优选的范围内,则可以发挥更优异的药理效果(粘膜免疫诱导能力),在该方面有利。

<其他成分>

作为所述含有乳酸菌的组合物中的其他成分,只要无损本发明的效果则没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举医药上允许的载体等。这些可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

所述含有乳酸菌的组合物中的其他成分的含量没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

(HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物)

本发明的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物至少包含含有乳酸菌的组合物,根据需要还可以包含其他成分。

<含有乳酸菌的组合物>

所述含有乳酸菌的组合物为上述的本发明的含有乳酸菌的组合物。

所述含有乳酸菌的组合物在所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物中的含量没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

<其他成分>

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物中的其他成分没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药、粘膜佐剂、医药上允许的载体等。这些可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

-具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药-

所述具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举:葛根汤、十全大补汤、补中益气汤、小柴胡汤、小青龙汤等。这些可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

-粘膜佐剂-

所述粘膜佐剂没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如优选与所述具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药配合来进一步增强所述来自HPV E7蛋白质的多肽等口服疫苗的特异性体液性免疫和细胞性免疫的粘膜佐剂。

作为所述粘膜佐剂的例子,可以列举:来自细菌毒素的佐剂、合成神经酰胺(αGalCer)、CpG寡核苷酸、SP-C(表面活性剂)、SP-B、IFN-α(野生型或变异型)、双链RNA、活性扩增型TNF(Tumor Necrosis Factor,肿瘤坏死因子)变异体等。这些可以单独使用1种,也可以将2种以上并用。

所述来自细菌毒素的佐剂没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举:来自霍乱毒素(CT,Cholera Toxin)的多肽、来自大肠杆菌不耐热毒素(LT,Heat labileen Terotoxin)的多肽、来自Vero毒素(VT)的多肽、来自白喉毒素(DT,Diphtheria Toxin)的多肽、来自百日咳毒素(PT,Pertussis Toxin)的多肽等。

所述来自细菌毒素的佐剂可以是来自野生型细菌毒素的佐剂,也可以是来自变异型细菌毒素的佐剂,优选来自如下变异型细菌毒素的佐剂,该变异型细菌毒素为了防止在口服给药人时产生严重副作用而预先导入有变异。

-医药上允许的载体-

所述医药上允许的载体没有特别限制,可以根据剂型适当选择公知的载体。

作为所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物中的其他成分的含量,没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

<使用>

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以单独使用,也可以与以其他成分作为有效成分的医药并用。另外,所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以在调配到以其他成分作为有效成分的医药中的状态下使用。

<剂型>

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物的剂型只要为能够口服给药的剂型,则没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举口服固体制剂(片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)等。这些剂型的所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以依据常规方法进行制造。

<给药>

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物的给药量、给药时期、及给药对象没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

所述给药量没有特别限制,可以考虑给药对象个体的年龄、体重、体质、症状、是否已给药以其他成分作为有效成分的医药或药剂等各种因素而适当选择。

所述给药对象可以适宜地列举人。

所述HPV相关肿瘤没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举:宫颈癌、外阴癌、肛门癌、口腔癌、阴道癌、阴茎癌、咽喉癌、及该等癌的癌前病变等。

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以适宜地用于宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病的治疗用途。

所述早期宫颈癌包括微小型浸润癌的状态。

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物适于通过对HPV感染症的患者给药,而用作其治疗用疫苗。

(治疗HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的方法)

所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以通过对个体口服给药而治疗个体的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病。因此,本发明也涉及一种治疗HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的方法,其特征在于:对个体口服给药所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物。

(粘膜免疫诱导剂)

本发明的粘膜免疫诱导剂至少包含含有乳酸菌的组合物,根据需要还包含其他成分。

<含有乳酸菌的组合物>

所述含有乳酸菌的组合物是上述的本发明的含有乳酸菌的组合物。

所述含有乳酸菌的组合物在所述粘膜免疫诱导剂中的含量没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

<其他成分>

所述粘膜免疫诱导剂中的其他成分没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以设为与所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物的其他成分的项目中所记载的成分相同。

所述粘膜免疫诱导剂中的其他成分的含量没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

<使用>

所述粘膜免疫诱导剂可以单独使用,也可以与以其他成分作为有效成分的医药并用。另外,所述粘膜免疫诱导剂也可以在调配到以其他成分作为有效成分的医药中的状态下使用。

<剂型>

所述粘膜免疫诱导剂的剂型只要能够口服给药,则没有特别限制,可以根据目的进行适当选择,例如可以列举:口服固体制剂(片剂、包衣片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等)、口服液剂(内服液剂、糖浆剂、酏剂等)等。这些剂型的所述粘膜免疫诱导剂可以根据常规方法进行制造。

<给药>

所述粘膜免疫诱导剂的给药量、给药时期、及给药对象没有特别限制,可以根据目的进行适当选择。

所述给药量没有特别限制,可以考虑给药对象个体的年龄、体重、体质、症状、是否已给药以其他成分作为有效成分的医药或药剂等各种因素而适当选择。

所述给药对象可以适宜地列举人。

所述粘膜免疫诱导剂可以诱导粘膜上的HPV E7蛋白质特异性细胞免疫应答。

(诱导粘膜免疫的方法)

所述粘膜免疫诱导剂通过对个体口服给药,能够诱导个体的粘膜免疫。因此,本发明也涉及一种诱导粘膜免疫的方法,其特征在于:对个体口服给药所述粘膜免疫诱导剂。

实施例

以下,说明本发明的制造例及试验例,但本发明不受这些制造例及试验例的任何限定。

(比较制造例1:公知的LacE7制剂的制造)

依据Poo H.et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1,702-1,709中所记载的方法,制造作为公知制剂的LacE7制剂。

简言之,使用表达载体,将来自HPV16的变异型E7蛋白质(由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的将与野生型E7蛋白质与Rb蛋白质结合相关的第21号Asp、第24号Cys及第26号Glu全部置换为Gly的变异型E7蛋白质)导入至确认有1型辅助T细胞(Th1细胞)的诱导能力的干酪乳酸杆菌。利用热使培养后的重组体(LacE7)成为死菌。用蒸馏水将从培养基精制而获得的LacE7清洗数次,然后进行干燥、粉体化(LacE7制剂),在使用之前保存在4℃下。所述LacE7制剂不溶于水性溶剂。

(制造例1:变异型E7蛋白质结合型乳酸菌的制造)

通过如下方式制造变异型E7蛋白质结合型乳酸菌,其是在乳酸菌的菌体表面结合有作为来自HPV E7蛋白质的多肽的变异型E7蛋白质(序列编号2)。

<变异型E7蛋白质的制作>

-插入了cA与变异型E7蛋白质的融合序列的蛋白质表达用质粒的构建-

所述cA是锚定蛋白质,且用作将所述变异型E7蛋白质固定在乳酸菌的菌体表面的工具。所述cA可以通过电荷与特定的模体而固定在阳性菌肽聚糖上,并且是来自乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的细胞壁结合蛋白(Tjibbe Bosma,Rolf Kanninga,Jolanda Neef,Sandrine A.L.Audouy,Maarten L.van Roosmalen,Anton Steen,Girbe Buist,Jan Kok,Oscar P.Kuipers,George Robillard,and Kees Leenhouts(2006)Novel Surface Display System for Proteins on Non-Genetically Modified Gram-Positive Bacteria.Appl.Environ.Microbiol.p.880-889)。

通过常规方法,将所述cA与变异型E7蛋白质的融合序列(参照序列编号3)插入到作为载体质粒的pQE31(以下有时称为“pQE31::cA=E7Rb”,参照图1A)。

-转化-

作为表达所述cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质的宿主,使用ClearColi(注册商标)(大肠杆菌BL21DE3LPS改型株,Lucigen)。

首先,为了导入pREP4(invitrogen),通过电穿孔法进行ClearColi(注册商标)的转化。

接着,通过氯化钙法将pQE31::cA=E7Rb导入转化体中,获得了表达所述cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质的大肠杆菌(以下有时称为“Clear Coli(注册商标)pQE31::cA=E7Rb,pREP4”)。

-融合蛋白质的表达及精制-

在包含氨苄西林(最终浓度100μg/mL)及卡那霉素(最终浓度25μg/mL)的Luria-Bertani(LB)液体培养基(Difco实验室公司(Difco Laboratories))中接种一白金环的所述菌体,在37℃下振荡培养一夜。

对所述培养物进行集菌并清洗后,利用与培养时相同量的PBS进行定容,以成为包含氨苄西林(最终浓度100μg/mL)及卡那霉素(最终浓度25μg/mL)的主培养用LB液体培养基的1/20量的方式进行接种。

主培养是在37℃下进行振荡培养,当O.D.600达到0.5时以最终浓度成为1mM的方式添加IPTG(Isopropyl Thiogalactoside,异丙基硫代半乳糖苷),在37℃下振荡培养4小时,进行所述融合蛋白质的表达诱导。

对所述诱导后的培养液进行集菌,对每1g菌体添加5mL的裂解缓冲液(Lysis buffer)(100mM的NaH2PO4、10mM的Tris-Cl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液)、8M尿素(Urea)、pH值8),在室温下平稳地搅拌1小时。在4℃下以10,000×g离心分离30分钟,并回收上清液。

在室温下,对所回收的上清液4mL以40分钟平稳地混合利用裂解缓冲液进行过平衡化的TALON(注册商标)金属亲和性树脂(Metal Affinity Resin)1mL(Clontech)。将上清液与树脂的混合液移至聚丙烯柱(Polypropylene columns)(QIAGEN)并去除上清液。利用4mL的清洗缓冲液(Wash buffer)(100mM的NaH2PO4、10mM的Tris-Cl、8M尿素(Urea)、pH值6.3)清洗2次,并利用洗脱缓冲液(Elution buffer)1(100mM的NaH2PO4、10mM的Tris-Cl、8M尿素(Urea)、150mM咪唑(Imidazole)、pH值5.9)及洗脱缓冲液(Elution buffer)2(100mM的NaH2PO4、10mM的Tris-Cl、8M尿素(Urea)、300mM咪唑(Imidazole)、pH值4.5)使His标签融合蛋白质溶出。

所回收的蛋白质溶液是通过透析进行脱盐,并通过使用Ultracel(注册商标)-10k(Merk Millipore)的超滤进行浓缩。

浓缩后的蛋白质溶液在利用Quick StartTM Bradford Protein Assay(Bradford蛋白浓度测定)(BIO-RAD)测定浓度后,在使用之前保存在-80℃下。

-通过蛋白质印迹法而确认融合蛋白质-

在所述-融合蛋白质的表达及精制-中的主培养过程中,添加IPTG,将在37℃下振荡培养4小时后的培养液以10,000×g离心3分钟,并进行集菌。弃去上清液,使颗粒悬浮在100mL的1×SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)样品缓冲液中。将所述悬浮的悬浮液在100℃下加热5分钟。

对加热后的悬浮液利用SDS-PAGE进行电泳,转印到PVDF膜(EDM Millipore)上。

将所述转印后的膜于室温下在一级抗体溶液(含1%BSA、0.05%Tween20的PBS(-),小鼠抗His IgG(Anti-His-tag mAb,医学生物学研究所股份有限公司)(1:2,000))中培养1小时。

然后,将所述膜利用PBST清洗2次。

接着,于室温下在二级抗体溶液(含1%BSA、0.05%Tween20的PBS(-),山羊抗小鼠IgG HRP(Anti-Mouse IgG(完整分子(whole moledule))-山羊过氧化物酶抗体(Peroxidase antibody produced in goat)、西格玛奥德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司)(1:10,000))中培养1小时。

然后,将所述膜利用PBST清洗2次。

接着,使用ECL Plus(GE医疗生命科学(GE Health Care Life Science)),利用Chemi doc(Bio-Rad实验室公司(Bio-Rad Laboratories))检测条带,而确认到目标融合蛋白质的表达。

<向乳酸菌菌体表面的结合>

所述cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质在乳酸菌的菌体表面的结合(以下也有时称为“固定化”)是参考Tjibbe Bosma,Rolf Kanninga,Jolanda Neef,Sandrine A.L.Audouy,Maarten L.van Roosmalen,Anton Steen,Girbe Buist,Jan Kok,Oscar P.Kuipers,George Robillard,and Kees Leenhouts(2006)Novel Surface Display System for Proteins on Non-Genetically Modified Gram-Positive Bacteria.Appl.Environ.Microbiol.p.880–889,通过如下方式进行。

-乳酸菌的培养-

作为乳酸菌,使用已作为抗原运输载体确认到佐剂效果的干酪乳酸杆菌IGM393(Kajikawa A,Igimi S(2010)Innate and acquired immune responses induced by recombinant Lactobacillus casei displaying flagellin-fusion antigen on the cell-surface.Vaccine 28:3409-3415)。

将所述乳酸菌利用Mann-Rogosa-Sharp(MRS)液体培养基(Difco实验室公司(Difco Laboratories))在37℃下静置培养一夜。对培养液进行集菌,利用PBS清洗2次。

-固定化的预处理-

作为所述固定化的预处理,准备“利用三氯乙酸(TCA)处理过的所述乳酸菌”(以下有时称为“有TCA处理”)及“利用PBS处理过的所述乳酸菌”(以下有时称为“无TCA处理”)这两种。

所述利用TCA所进行的处理是将菌体再悬浮在培养液的0.2倍量的10%TCA中,在100℃下加热30分钟后,利用PBS清洗3次。

所述利用PBS所进行的处理是将菌体再悬浮在培养液的0.2倍量的PBS中,在100℃下加热30分钟后,利用PBS清洗3次。

-固定化-

每1.0×108个所述预处理后的乳酸菌菌体,添加所述融合蛋白质1.0μg、0.3μg、0.1μg或0.03μg(分别以所述变异型E7蛋白质量计相当于0.3μg、0.09μg、0.03μg、或0.009μg),并在包含所述融合蛋白质的PBS溶液中混合1小时。由此,使所述融合蛋白质电性结合在乳酸菌的表面。

所述混合后,利用PBS清洗3次,并保存在-80℃下。

通过以上方式,获得了下述变异型E7蛋白质结合型乳酸菌。

(1)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

(2)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.09μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

(3)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.03μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

(4)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.009μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

(5)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

(6)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.09μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

(7)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.03μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

(8)每1.0×108个乳酸菌菌体,结合有0.009μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

<FACS分析>

针对所述(1)~(8)的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌,使用对HPV E7蛋白质具有特异性的抗体进行荧光标记,然后利用流式细胞仪(FACS,BD公司制造)确认到固定化。

具体而言,将所述变异型E7蛋白质结合型乳酸菌在0.5mL的一级抗体溶液(含1%BSA、0.05%Tween20的PBS(-),抗HPV16E7小鼠IgG(HPV16型E7蛋白质抗体(Protein antibody)[289-1 7013(TVG-701Y)],GeneTex公司)(1:1000))中进行倒置混合(室温、60分钟)。然后,进行离心(15,000×g,3分钟)后,利用PBS(-)清洗2次。接着,一边进行遮光,一边在0.5mL的二级抗体溶液(含1%BSA、0.05%Tween20的PBS(-),抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(Alexa Fluor(R)488山羊抗小鼠IgG(H+L),美国生命技术公司(Life technologies))(1:500))中进行倒置混合(室温、60分钟)。然后,进行离心(15,000×g,3分钟)后,利用PBS(-)清洗2次。

然后,利用PBS(-)定容至0.6mL,并利用FACS检测荧光。

此外,使用除不使用所述融合蛋白质以外经过相同操作的乳酸菌作为阴性对照。

将结果示于图1B及图1C。

图1B中,“N”表示阴性对照的结果,“(1)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)的结果,“(2)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.09μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)的结果,“(3)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.03μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)的结果,“(4)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.009μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)的结果。

图1C中,“N”表示阴性对照的结果,“(5)”表示每1.0×108乳酸菌个菌体结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)的结果,“(6)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.09μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)的结果,“(7)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.03μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)的结果,“(8)”表示每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.009μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)的结果。

由图1B及图1C的结果显示出,随着变异型E7蛋白质的量增加,荧光强度增强。

此外,也得知在将所述变异型E7蛋白质的量设为每1.0×108个乳酸菌菌体0.9μg的情况下,结果与每1.0×108个乳酸菌菌体0.3μg的情况相同,能够结合在乳酸菌的菌体表面的所述变异型E7蛋白质的量在0.3μg左右达到饱和。

此外,图1D中表示通过蛋白质印迹法对以下的蛋白质进行了确认的一例。

[蛋白质]

·带有His标签的cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质(48kDa)

·带有His标签的cA(33kDa)

·带有His标签的变异型E7蛋白质(15kDa)

图1D中,“1”表示“带有His标签的cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质”的结果,“2”表示“带有His标签的cA”的结果,“3”及“5”表示“由诱导带有His标签的cA表达前的大肠杆菌所制备的样品”的结果,“4”及“6”表示“由诱导带有His标签的cA表达后的大肠杆菌所制备的样品”的结果,“7”表示“带有His标签的变异型E7蛋白质”的结果,“8”及“10”表示“由诱导带有His标签的变异型E7蛋白质表达前的大肠杆菌所制备的样品”的结果,“9”及“11”表示“由诱导带有His标签的变异型E7蛋白质表达后的大肠杆菌所制备的样品”的结果。

(制造例2:变异型E7蛋白质表达型乳酸菌的制造)

通过如下方式制造在乳酸菌的菌体表面表达了作为来自HPV E7蛋白质的多肽的变异型E7蛋白质(序列编号2)的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌。

作为载体质粒,使用pIGM2(Kajikawa Akinobu,Eiko Ichikawa,and Shizunobu Igimi(2010)Development of a Highly Efficient Protein-Secreting System in Recombinant Lactobacillus casei.J.Microbiol.Biotechnol.,20(2),375-382),制作插入有如下序列(序列编号4)的载体质粒(以下有时称为“pIGM2::E7Rb=prtP锚定序列”),该序列(序列编号4)中依序结合有编码变异型E7蛋白质(序列编号2)的序列与来自干酪乳酸杆菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei))的序列(参照图2A)。

去除所述载体质粒的终止子序列,通过电穿孔法导入至干酪乳酸杆菌IGM394(以下有时称为“干酪乳酸杆菌IGM394[pEK7::E7Rb]”)。

另外,作为阴性对照,使用未插入如下序列(序列编号4)的载体质粒,除此以外以相同的方式制作将载体质粒导入至干酪乳酸杆菌IGM394的株(以下有时称为“L.casei IGM394[pLPempty]”),该序列(序列编号4)中依序结合有编码变异型E7蛋白质(序列编号2)的序列与来自干酪乳酸杆菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei))的序列。

将所述乳酸菌接种到向Mann-Rogosa-Sharp(Difco实验室公司)中添加有5μg/mL的Em的液体培养基(MRSE)中,在37℃下培养一夜(约14小时)。对培养液进行集菌(5,000g×10分钟),利用PBS清洗1次(5,000g×10分钟)。添加PBS,将细胞悬浮液浓度调整为1×109CFU/mL。

向1L的MRSE((i)未添加NaHCO3、pH值6.4,(ii)添加10mM的NaHCO3、pH值6.8,或(iii)添加25mM的NaHCO3、pH值7.1)中接种10%所述调整的细胞悬浮液(1×108CFU/mL),在37℃下一边平稳搅拌约5小时一边在厌氧条件下(使用Anaeropack)进行培养。

此外,阴性对照的乳酸菌是使用(i)未添加NaHCO3的MRSE进行培养。

对培养液进行集菌(5,000g×10分钟),利用PBS清洗1次(5,000g×10分钟)。添加PBS 30mL,将细胞悬浮液浓度调整为最终浓度7.5×109cells/mL(OD≈7.5)。此外,使用血球计算出乳酸菌数。

将所述细胞悬浮液在高压釜中在80℃下加热处理5分钟,使之成为死菌。

另外,将未进行所述加热处理的细胞悬浮液设为活菌样品。

通过以上方式,获得了下述变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(i-1)由未添加NaHCO3的MRSE(pH值6.4)进行培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(i-2)由未添加NaHCO3的MRSE(pH值6.4)进行培养并设为活菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(ii-1)由添加了10mM NaHCO3的MRSE(pH值6.8)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(ii-2)由添加了10mM NaHCO3的MRSE(pH值6.8)培养并设为活菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(iii-1)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

(iii-2)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为活菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

<FACS分析>

针对所述(i-1)、(ii-1)、及(iii-1)的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌以及阴性对照的乳酸菌,通过与所述制造例1相同的方式进行FACS分析,确认到每1.0×108个乳酸菌菌体的菌体表面的变异型E7蛋白质的表达程度。将结果示于图2B。

图2B中,“N”表示阴性对照(死菌)的结果,“(i-1)”表示由未添加NaHCO3的MRSE(pH值6.4)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌的结果,“(ii-1)”表示由添加了10mM的NaHCO3的MRSE(pH值6.8)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌的结果,“(iii-1)”表示由添加了25mM的NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌的结果。

由图2B的结果显示,通过调整培养液的pH值,能够调节变异型E7蛋白质在菌体表面的表达量。

(试验例1:菌体表面的变异型E7蛋白质量的比较)

针对以下的样品,通过与所述制造例1相同的方式进行FACS分析,对每1.0×108个乳酸菌菌体的变异型E7蛋白质在菌体表面的量进行比较。将结果示于图3A及图3B。

<样品>

(I)…所述制造例2中的阴性对照(死菌)。

(II)…所述比较制造例1中所制造的LacE7制剂。

(III)…所述制造例1中的(3)每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.03μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

(IV)…所述制造例2中的(iii-1)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

图3A及图3B中,“(I)”表示所述样品(I)的结果,“(II)”表示所述样品(II)的结果,“(III)”表示所述样品(III)的结果,“(IV)”表示所述样品(IV)的结果。

由图3A(测定条件为电压(Voltage):525)的结果显示,对于现有的LacE7制剂,表现出变异型E7蛋白质在菌体表面的表达的乳酸菌与未显示出该表达的乳酸菌的偏差大。另外,由图3B(测定条件为电压(Voltage):600)的结果显示,对于现有的LacE7制剂,变异型E7蛋白质在菌体表面的表达量低。

另一方面,对于所述制造例2中的(iii-1)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌,推测出每1.0×108个乳酸菌菌体的变异型E7蛋白质的表达量为0.3μg左右。

(试验例2:抗HPV粘膜免疫诱导能力试验-1)

使用比较制造例1中所制造的LacE7制剂,通过如下方式进行抗HPV粘膜免疫诱导能力试验。

<小鼠的免疫>

利用LacE7制剂对小鼠所进行的口服免疫是依据K.Adachi et al.,Vaccine,2010,vol.28,pp.2810-2817中所记载的方法进行。

<<对小鼠口服给药LacE7制剂>>

通过对6周龄的雌SPF C67BL小鼠(CLEA Japan股份有限公司)口服给药所述LacE7制剂,而进行免疫。

对每只小鼠,在第1周、第2周、第4周、及第6周分别给药0.1mg、0.3mg、或1.0mg的所述LacE7制剂,共计给药4个疗程。所有的给药均使用灌胃管,在禁食3小时后,给药使所述LacE7制剂悬浮在200mL PBS中的悬浮液,1天1次,每周连续5天。

<肠的回收>

在所述LacE7制剂的最后一次接种起经过1周后(接种开始后的第7周),对接种过所述LacE7制剂的5只小鼠进行解剖,并采集肠。对于所述肠,在除去排泄物后,利用10mL加入了蛋白酶抑制剂的HBSS将肠道内部加以清洗。

<小鼠的粘膜淋巴球的制备>

将肠沿纵向切开,在添加了10质量%FBS、100units/mL青霉素及100μg/mL链霉素的PRMI 1640(含有10质量%灭活胎牛血清、2mM L-谷酰胺、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、50mM的2-巯基乙醇)培养基中,在37℃下剧烈振荡30分钟。将回收的细胞悬浮液利用BD Falcon(商标)Streiner(美国BD生物科学股份有限公司)去除组织残屑,接着使用层叠有70质量%和40质量%的Percoll PLUS的15mL试管进行不连续浓度梯度离心。在上面层叠约107个~108个细胞,在室温下以600×g离心20分钟,由此在70质量%和40质量%的Percoll PLUS的界面聚集有粘膜淋巴球(存活率95%)。从各小鼠获得了约5×106个~10×106个粘膜淋巴球。

<ELISPOT分析>

将肠粘膜淋巴球(5×106个细胞/mL)的悬浮液50μL在37℃下与抗原递呈细胞一起培养24小时。

依据小鼠IFN-γ用ELISPOT试剂盒(MABTEC AB,瑞典)的厂商协议,将HPV16的E7蛋白质(序列编号1)中被报告为CTL表位的由E7蛋白质的第49号至第57号的氨基酸序列构成的10μL合成肽(1μg/mL)、分裂素(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯40ng/mL+离子霉素4μg/mL)、或仅培养基(对照)滴至涂有抗小鼠IFN-γ抗体的96孔培养板(ELIIP培养板,美国密理博(Millipore)股份有限公司)。对96孔培养板上的IFN-γ阳性的点数进行分析。此时,使用KS ELISPOT(德国卡尔蔡司光学(Carl Zeiss Vision)公司)的计算机完全辅助视频成像分析系统。

<统计分析>

以平均值±标准偏差表示ELISPOT分析的数据。在免疫组(各组有5只小鼠)间,将这些值或相对值加以比较。此时,进行双侧学生t-检验。p值<0.05时视为显著差异。

将试验例2的结果示于图4。

由图4明确得知,每106个细胞的IFN-γ产生细胞数依赖于给药量而增加。

另外,根据图4,算出在给药0.5mg的LacE7制剂的情况下每106个细胞的IFN-γ产生细胞数为65.8细胞(图4中的箭头部分)。

(试验例3:抗HPV粘膜免疫诱导能力试验-2)

使用以下的样品,将样品的给药量设为0.5mg/小鼠,除此以外,通过与试验例2相同的方式进行抗HPV粘膜免疫诱导能力试验。

<样品>

·样品-1:制造例1中的(1)每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(有TCA处理)。

·样品-2:制造例1中的(6)每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.09μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

·样品-3:制造例1中的(5)每1.0×108个乳酸菌菌体结合有0.3μg所述变异型E7蛋白质的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌(无TCA处理)。

·样品-4:制造例2中的(iii-2)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为活菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

·样品-5:制造例2中的(iii-1)由添加了25mM NaHCO3的MRSE(pH值7.1)培养并设为死菌的变异型E7蛋白质表达型乳酸菌。

将结果示于图5。图5中,横轴的1~5表示所述样品的编号。

另外,在图5中还一并披露所述试验例2的结果。图5中,A表示试验例2中LacE7制剂的给药量为0.1mg/小鼠的结果,B表示试验例2中LacE7制剂的给药量为0.3mg/小鼠的结果,C表示试验例2中LacE7制剂的给药量为1.0mg/小鼠的结果。

图5的箭头表示根据所述试验例2的结果算出的在以0.5mg/小鼠给药LacE7制剂的情况下每106个细胞的IFN-γ产生细胞数。

根据图5的结果,在使用本发明的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌或变异型E7蛋白质表达型乳酸菌、即样品-1~5的情况下,与给药量相同的作为公知制剂的LacE7制剂的情况相比,显示出具有优异的抗HPV免疫诱导能力。

其中,在使用样品-2~5的情况下,与给药量相同的作为公知制剂的LacE7制剂的情况相比,显示出具有约2倍左右的非常优异的抗HPV免疫诱导能力。

在本发明等人所进行的利用作为公知制剂的LacE7制剂的人CIN3患者的临床试验中,如果对治愈组与未治愈组的IFN-γ产生细胞数加以比较,则显示出前者的IFN-γ产生细胞数比后者多2倍左右(K.Kawana et al.,“Oral vaccination against HPV E7for treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 3(CIN3)elicits E7-specific mucosal immunity in the cervix of CIN3patients.”,Vaccine,2014Oct 29;32(47):6233-9.)。

因此,预测本发明的变异型E7蛋白质结合型乳酸菌或变异型E7蛋白质表达型乳酸菌在相同给药量下,IFN-γ产生细胞数比作为公知制剂的LacE7制剂多2倍左右,显著地提高临床效果(有效率)。

作为本发明的形态,例如可以列举以下形态。

<1>一种含有乳酸菌的组合物,其特征在于:其是含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物,

所述来自HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1×108个乳酸菌菌体0.03μg~1.0μg。

<2>根据所述<1>所记载的含有乳酸菌的组合物,其中来自HPV E7蛋白质的多肽结合在乳酸菌的菌体表面。

<3>根据所述<1>所记载的含有乳酸菌的组合物,其中来自HPV E7蛋白质的多肽在乳酸菌的菌体表面被表达。

<4>根据所述<1>至<3>中任一项所记载的含有乳酸菌的组合物,其中乳酸菌为干酪乳酸杆菌。

<5>一种HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物,其特征在于:包含所述<1>至<4>中任一项所记载的含有乳酸菌的组合物。

<6>根据所述<5>所记载的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物,其用于治疗宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病。

<7>一种粘膜免疫诱导剂,其特征在于:包含所述<1>至<4>中任一项所记载的含有乳酸菌的组合物。

序列表

<110> 国立大学法人东京大学

公益财团法人日本健康科学振兴财团

<120> 含有乳酸菌的组合物、HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂

<130> N-ST016-15P

<150> JP 2015-017407

<151> 2015-01-30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> 人乳头状瘤病毒16型

<400> 1

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人乳头状瘤病毒16型

<400> 2

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 3

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

tcttctgctg gtacttctaa ttccggtggt tcaacagcta caaataccaa taataattca 60

aatacaagct caaccactta tacagttaaa tctggcgata cactttgggg aatttcgcaa 120

aaatatggaa ttagtgttgc tcaaattcaa agcgcaaaca atcttaaaag tacagtcatc 180

tatattgggc aaaagcttgt attgacaact tcaagttctt cgtctaatac aaatagttca 240

acttcttcag gaaattctgc cggaactaca acgcctacta cttcggtcac tcctgccaaa 300

ccagcttcac agacgacgat taaggttaaa tctggtgata cgctttgggg actctctgtc 360

aaatataaaa cgacgattgc tcaactcaag agttggaatc atttgaattc tgatacaatt 420

ttcattggac aaaacttgat tgtttcacaa tctgccggtt cttcaagttc ttcaacaggt 480

tcaagctcag cctctacgag ttcaacttct aactcttctg cagcttcaaa tacctctatc 540

cataaggttg ttaaaggaga tacgctttgg ggactttcac aaaaatctgg tagcccaatt 600

gcttcaatta aggcttggaa tcatttatca agtgatacca ttttaattgg tcaatatctt 660

cgtattaaag aggatccgat gcatggagat acacctacat tgcatgaata tatgttagat 720

ttgcaaccag agacaactgg tctctacggt tatgggcaat taaatgacag ctcagaggag 780

gaggatgaaa tagatggtcc agctggacaa gcagaaccgg acagagccca ttacaatatt 840

gtaacctttt gttgcaagtg tgactctacg cttcggttgt gcgtacaaag cacacacgta 900

gacattcgta ctttggaaga cctgttaatg ggcacactag gaattgtgtg ccccatctgt 960

tctcagaaac cataa 975

<210> 4

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

atgcatggag atacacctac attgcatgaa atatgttaga tttgcaacca gagacaactg 60

gtctctacgg ttatgggcaa ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc 120

cagctggaca agcagaaccg gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt 180

gtgactctac gcttcggttg tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag 240

acctgttaat gggcacacta ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccactcgagg 300

cagctgccgt tgaagcggcc aagacagctg gtaaaggcga cgatacaagc ggtactagcg 360

acaaaggcgg cggtcaaggt accccggcgc ccgctccagg cgacacaggt aagaacaaag 420

gcgatgaggg cagccagcct agttctggcg gtaatatccc aacaaagcca gccacaacga 480

cgtcaacgag cacggatgat acgactgatc gtaatggtca acatacatcc ggtaagggag 540

cattacccaa gacagcagag acaactgagc ggccagcgtt tggcttcttg ggtgtcattg 600

tggtcagtct gatgggggta ttag 624

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680007401.7 (22)申请日 2016.01.28 (30)优先权数据 2015-017407 2015.01.30 JP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2017.07.27 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2016/052481 2016.01.28 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2016/121865 JA 2016.08.04 (71)申请人 国立大学法人东京大学 地址 日本东京 申请人 公益财团法人日本健康科学振兴财 团 (7。

2、2)发明人 川名敬 五十君静信 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 王永伟 赵蓉民 (51)Int.Cl. A61K 39/12(2006.01) A61P 15/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C07K 14/025(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (54)发明名称 含有乳酸菌的组合物、 HPV感染症及HPV相关 肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组 合物及粘膜免疫诱导剂 (5。

3、7)摘要 一种含有乳酸菌的组合物、 以及包含所述含 有乳酸菌的组合物的HPV感染症及HPV相关肿瘤 中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物 及粘膜免疫诱导剂, 所述含有乳酸菌的组合物是 含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV) E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物, 所述来自 HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1108个乳酸 菌菌体0.03g1.0g。 权利要求书1页 说明书17页 序列表3页 附图6页 CN 107249627 A 2017.10.13 CN 107249627 A 1.一种含有乳酸菌的组合物, 其特征在于: 其是含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤 病毒(HPV)E7蛋白质。

4、的多肽的乳酸菌的组合物, 所述来自HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1108个乳酸菌菌体0.03 g1.0 g。 2.根据权利要求1所述的含有乳酸菌的组合物, 其中来自HPV E7蛋白质的多肽结合在 乳酸菌的菌体表面。 3.根据权利要求1所述的含有乳酸菌的组合物, 其中来自HPV E7蛋白质的多肽在乳酸 菌的菌体表面被表达。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的含有乳酸菌的组合物, 其中乳酸菌为干酪乳酸杆 菌(Lactobacillus casei)。 5.一种HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物, 其特 征在于: 包含权利要求1至4中任一项所述的含有乳酸菌的组。

5、合物。 6.根据权利要求5所述的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服 医药组合物, 其用于治疗宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病。 7.一种粘膜免疫诱导剂, 其特征在于: 包含权利要求1至4中任一项所述的含有乳酸菌 的组合物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107249627 A 2 含有乳酸菌的组合物、 HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任 一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂 技术领域 0001 本发明涉及一种含有在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒(HPV, Human Papilloma Virus)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物。

6、、 以及包含所述含有乳酸菌的组合物 的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱 导剂。 背景技术 0002 人乳头状瘤病毒(HPV)是DNA病毒, 迄今已报告有100种以上的不同类型。 所述HPV 通过感染皮肤(例如HPV1、 HPV2)或粘膜表面(例如HPV6、 HPV11), 而形成以数月至数年为单 位存在的良性肿瘤(疣)。 0003 此外, 所述HPV中有15种分型(例如HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV52、 HPV58等)通 过长期感染粘膜, 而引发恶性肿瘤, 因此被称为高危型HPV。 0004 关于作为女性特有癌的。

7、患病率仅次于乳腺癌的宫颈癌, 几乎100的宫颈癌是因 所述HPV长期感染生殖器而发病, 全世界每年报告有53万名新增患者, 日本每年报告有1万5 千名新增患者。 0005 因宫颈癌导致的一年的死亡人数在全世界达到27万人, 在日本达到3,500人。 0006 理论上, 只要能够将所述HPV的全部感染防范于未然, 则可以完全根除所述宫颈 癌。 0007 已明确所述HPV的感染除所述宫颈癌以外, 还关系到外阴癌、 肛门癌、 口腔癌、 阴道 癌、 阴茎癌、 咽喉癌、 以及尖锐湿疣(生殖器疣), 为了预防这些癌及性传播疾病, 认为有效的 是针对所述HPV感染的预防疫苗。 但是, 现有的HPV预防疫苗只。

8、能预防高危型HPV中的2种分 型。 0008 所述HPV中, 特别是HPV16与HPV18在日本女性的所述宫颈癌的发病原因中约占 65, 尤其对于2030岁的女性而言HPV16与HPV18在宫颈癌的发病原因中约占90。 0009 已知所述HPV16与所述HPV18在被视为所述外阴癌前期病变的外阴上皮内瘤变的 高度病变中也占据将近50的发病原因, 还与有可能发展为所述阴道癌的阴道上皮内瘤变 的85的发病有关。 0010 因所述HPV感染导致的所述宫颈癌的癌前病变、 即宫颈上皮内瘤变(CIN, Cervical Intraepithelial Neoplasia)发生在子宫阴道部(宫颈部的下半部分。

9、、 突出至阴道的部分) 的粘膜上皮。 HPV感染症是因性行为引起的微细损伤导致HPV侵入粘膜上皮(复层扁平上皮) 的基底细胞, 而在扁平上皮内进行病毒增殖的病毒感染症。 如果HPV在上皮内长期持续增 殖, 则上皮细胞产生永生化、 癌化。 认为这是宫颈癌的起源。 0011 在所述宫颈癌的产生过程中, 如果所述HPV在基底细胞中持续增殖, 则认为会产生 如下变化: 一部分HPV的病毒基因被插入至上皮细胞基因, 而使低水平的E6蛋白质与E7蛋白 质的表达持续亢进。 说 明 书 1/17 页 3 CN 107249627 A 3 0012 所述E6蛋白质与所述E7蛋白质的表达在作为病毒感染像的CIN1。

10、(轻度非典型增 生)中非常低, 相对于此, 在已形成肿瘤的CIN2(中度非典型增生)与CIN3(高度非典型增生) 中确认到高度表达, 因此认为所述E6蛋白质与所述E7蛋白质的表达的持续亢进是发生在所 述CIN2之后。 0013 所述HPV的所述E6蛋白质与所述E7蛋白质中, 特别是所述E7蛋白质被认为是在针 对HPV相关癌症的治疗用疫苗的开发中非常有吸引力的标靶。 其原因在于, E7蛋白质在人体 内的抗原性高。 0014 目前为止, 虽然已经开发出若干以所述HPV E7蛋白质作为抗原的所述治疗用疫苗 (例如参照非专利文献1、 专利文献1), 但并未揭示这些治疗用疫苗排除患者宫颈部的癌前 病变(。

11、所述CIN)或癌细胞, 强烈期待开发出实际具有治疗效果的疫苗。 0015 本发明人等发现, 在所述HPV16的所述E7蛋白质中将和与所述Rb蛋白质结合相关 的第21号Asp、 第24号Cys及第26号Glu全部被置换为Gly, 使所获得的变异型E7蛋白质(序列 编号2)在干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)中进行表达, 并通过热处理而死菌化, 并且 进行干燥、 粉末化而获得疫苗(LacE7), 对小鼠口服给药所获得的疫苗(LacE7), 由此显示出 不仅在脾脏, 而且在粘膜中也可以诱导E7特异性细胞免疫应答(参照非专利文献2)。 0016 另外, 本发明人等也推进研究有关HP。

12、V的E7多肽与具有营养强化作用的中药的组 合作为HPV感染症治疗用口服医药组合物(参照专利文献2)。 0017 根据迄今为止本发明人等的研究, 正在开发起到一定程度临床效果的疫苗。 0018 然而, 所述治疗疫苗仅限于从CIN3(高度非典型增生)消退为CIN2(中度非典型增 生)的消退效果, 难以实现正常化。 为了进一步提高宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至 少任一种疾病的患者的临床效果而实现正常化, 强烈要求尽快提供具有更优异的粘膜免疫 诱导能力的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物。 0019 现有技术文献 0020 专利文献 0021 专利文献1: 日本专。

13、利特表2012-514469号公报 0022 专利文献2: 国际公开第2013/191225号 0023 非专利文献 0024 非专利文献1: H.Poo et al.,Int J.Cancer,2006,vol.119,pp.1702-1709 0025 非专利文献2: K.Adachi et al.,Vaccine,2010,vol.28,pp.2810-2817 发明内容 0026 发明所要解决的问题 0027 本发明的课题在于解决现有的所述各种问题而达成以下目的。 即, 本发明的目的 在于提供具有优异的粘膜免疫诱导能力的含有乳酸菌的组合物、 以及包含所述含有乳酸菌 的组合物的HPV感染。

14、症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘 膜免疫诱导剂。 0028 解决问题的技术手段 0029 解决所述问题的技术手段如下所述。 即, 0030 1一种含有乳酸菌的组合物, 其特征在于: 其是含有在菌体表面具有来自人乳 说 明 书 2/17 页 4 CN 107249627 A 4 头状瘤病毒(HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌的组合物, 并且 0031 所述来自HPV E7蛋白质的多肽的含量为每1108个乳酸菌菌体0.03 g1.0 g。 0032 2一种HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合 物, 其特征在于: 包含所述1所记载的含有乳酸菌。

15、的组合物。 0033 3一种粘膜免疫诱导剂, 其特征在于: 包含所述1所记载的含有乳酸菌的 组合物。 0034 发明的效果 0035 根据本发明, 能够解决现有的所述各问题, 从而达成所述目的, 可以提供具有优异 的粘膜免疫诱导能力的含有乳酸菌的组合物、 以及包含所述含有乳酸菌的组合物的HPV感 染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物及粘膜免疫诱导剂。 附图说明 0036 图1A是制造例1中的pQE31: : cAE7Rb的示意图。 0037 图1B是表示制造例1的FACS分析结果的图-1。 0038 图1C是表示制造例1的FACS分析结果的图-2。 0039 图1D是表。

16、示通过蛋白质印迹(Western blot)法对各种蛋白质进行确认后的结果 的一例的图。 0040 图2A是制造例2中的pIGM2: : E7RbprtP锚定序列的示意图。 0041 图2B是表示制造例2的FACS分析结果的图。 0042 图3A是表示试验例1的FACS分析(测定条件为电压(Voltage): 525)结果的图。 0043 图3B是表示试验例1的FACS分析(测定条件为电压: 600)结果的图。 0044 图4是表示试验例2的ELISPOT分析结果的图表。 0045 图5是表示试验例3的ELISPOT分析结果的图表。 具体实施方式 0046 (含有乳酸菌的组合物) 0047 本。

17、发明的含有乳酸菌的组合物至少包含在菌体表面具有来自人乳头状瘤病毒 (HPV)E7蛋白质的多肽的乳酸菌, 且根据需要还包含其他成分。 0048 乳酸菌 0049 所述乳酸菌没有特别限 制, 可以根据目的进行适当选择 , 优选乳酸杆菌 (Lactobacillus)属的乳酸菌, 就确认到1型辅助T细胞(Th1)的诱导能力的方面而言, 更优 选干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)。 所述乳酸菌可以单独使用1种, 也可以将2种以上 并用。 0050 所述含有乳酸菌的组合物也可以含有在菌体表面不具有所述来自HPV E7蛋白质 的多肽的乳酸菌, 但在菌体表面具有所述来自HPV E7蛋白质。

18、的多肽的乳酸菌的含有比率优 选80以上, 更优选90以上, 特别优选95以上。 0051 来自HPV E7蛋白质的多肽 0052 作为所述来自HPV E7蛋白质的多肽, 只要具有抗原性, 则没有特别限制, 可以根据 目的进行适当选择。 所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以单独使用1种, 也可以将2种以上并 说 明 书 3/17 页 5 CN 107249627 A 5 用。 0053 所述HPV的分型没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 优选属于癌症相关的 高危型群的HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV39、 HPV45、 HPV51、 HPV52。

19、、 HPV56、 HPV58、 HPV59、 HPV68、 HPV73、 HPV82、 HPV26、 HPV53、 HPV63, 更优选HPV16、 HPV18, 特别优选HPV16。 所 述HPV16的E7蛋白质是在以宫颈癌为代表的HPV相关癌(肛门癌、 咽喉癌、 阴茎癌、 外阴癌、 阴 道癌等)中进行组成型表达(constitutive expression)的癌抗原。 0054 所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是所述HPV E7蛋白质的全长蛋白质, 也可以是 缺失、 置换或添加了1个至多个氨基酸的蛋白质。 0055 另外, 所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是来自野生型E7蛋白质的。

20、多肽, 也可以 是来自变异型E7蛋白质的多肽。 0056 所述来自HPV E7蛋白质的多肽中, 优选将相当于HPV16的野生型E7蛋白质(序列编 号1)中的第21号Asp、 第24号Cys及第26号Glu的和E7蛋白质与Rb蛋白质的结合相关的氨基 酸残基置换为其他氨基酸残基的变异型E7蛋白质, 更优选将HPV16的野生型E7蛋白质(序列 编号1)的第21号Asp、 第24号Cys及第26号Glu全部置换为Gly的变异型E7蛋白质(序列编号 2)。 0057 -含量- 0058 作为所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量, 只要为每1108个乳酸菌 菌体0.03 g1.0 g, 则没有。

21、特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 优选0.03 g0.3 g, 更优选0.06 g0.3 g, 特别优选0.09 g0.3 g。 如果在所述优选的范围内, 则能够发挥更 优异的药理效果(粘膜免疫诱导能力), 在该方面有利。 0059 测定所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的含量的方法没有特别限制, 可以 根据目的进行适当选择, 例如可以列举通过使用对HPV E7蛋白质具有特异性的抗体的流式 细胞仪(Flow cytometer)(FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting, 荧光激活细胞 分选)进行测定的方法等。 0060 在利用所述FACS。

22、进行测定的方法中, 通过在与所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌 体表面的含量已知的样品相同的条件下进行测定, 能够测定所述来自HPV E7蛋白质的多肽 在菌体表面的含量未知的样品含量。 0061 形态 0062 所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以是结合在乳酸菌的菌体表面的多肽(以下有时 称为 “E7蛋白质结合型乳酸菌” ), 也可以是在乳酸菌的菌体表面被表达的多肽(以下有时称 为 “E7蛋白质表达型乳酸菌” )。 另外, 也可以是将两者组合而成的形态。 0063 另外, 所述乳酸菌可以是活菌, 也可以是死菌。 0064 制成所述死菌的方法没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以。

23、列举 利用高压釜在80下加热处理5分钟的方法等。 0065 -E7蛋白质结合型乳酸菌- 0066 所述E7蛋白质结合型乳酸菌可以通过如下方式进行制造: 使通过使用转化细菌的 基因重组方法或化学合成方法等所制造的所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在乳酸菌的 菌体表面。 0067 关于所述来自HPV E7蛋白质的多肽, 就成本等方面而言, 优选为使用转化细菌的 说 明 书 4/17 页 6 CN 107249627 A 6 基因重组方法。 0068 用作所述基因重组方法的宿主的细菌没有特别限制, 可以根据目的进行选择, 例 如可以列举: 酵母、 大肠杆菌、 枯草杆菌、 乳酸菌等。 0069 作为。

24、适于所述细菌中所述来自HPV E7蛋白质的多肽的表达的表达载体, 没有特别 限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举pQE31等。 0070 所述转化的方法没有特别限制, 可以适当选择公知方法。 0071 由所述转化菌生产的所述来自HPV E7蛋白质的多肽可以适当选择公知方法进行 精制。 0072 作为使所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在所述乳酸菌的菌体表面的方法, 没有 特别限制, 可以适当选择共价键结合、 电性结合等公知方法, 优选经由锚定蛋白质电性结合 在所述乳酸菌的菌体表面的方法。 0073 所述锚定蛋白质没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举来自 Acm。

25、A的作为细胞壁结合蛋白的cA等, 该AcmA是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的肽聚糖 水解酶。 0074 在经由所述锚定蛋白质将所述来自HPV E7蛋白质的多肽结合在所述乳酸菌的菌 体表面的情况下, 所述来自HPV E7蛋白质的多肽优选设为与所述锚定蛋白质的融合蛋白 质。 0075 所述融合蛋白质中的所述锚定蛋白质与所述来自HPV E7蛋白质的多肽的顺序没 有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 优选依序融合所述锚定蛋白质与所述来自HPV E7蛋白质的多肽的形态。 作为所述优选形态的具体例, 可以列举序列编号3所表示的序列。 0076 所述电性结合(以下有时称为 “固定化。

26、” )的方法没有特别限制, 可以根据目的进行 适当选择, 例如可以列举对所述乳酸菌添加包含所述来自HPV E7蛋白质的多肽的溶液并进 行混合的方法等。 0077 所述混合时间没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举1小时左 右等。 0078 所述电性结合的方法中, 也可以进行预处理。 0079 所述预处理没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举加热处理 等。 通过所述加热处理, 使所述乳酸菌成为死菌。 0080 所述加热处理的条件没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举 在100下加热30分钟等。 0081 所述加热处理可以在使所述乳酸菌悬浮在三。

27、氯乙酸(TCA, Trichloroacetic Acid)的状态下进行, 也可在使所述乳酸菌悬浮在PBS(Phosphate Buffer Saline, 磷酸盐 缓冲生理盐水)的状态下进行。 0082 -E7蛋白质表达型乳酸菌- 0083 所述E7蛋白质结合型乳酸菌可以通过对如下乳酸菌进行培养而制造, 该乳酸菌是 使用包含编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸的表达载体进行转化而成。 0084 所述表达载体没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举pIGM2 等。 所述pIGM2在短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC1559的S-层蛋白质的启动子。

28、序 列的下游具有短乳酸杆菌ATCC1559的prtP基因的分泌信号, 且在这些序列的下游具有来自 说 明 书 5/17 页 7 CN 107249627 A 7 干酪乳酸杆菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei)。 0085 作为所述表达载体的其他例, 可以列举: 包含repE变异基因、 来自乳酸菌的醛缩酶 启动子(Aldolase Promoter, Pald)以及选自由pgsB、 pgsC及pgsA所组成的族群中的聚谷氨 酸合成酶复合体基因的载体(参照日本专利特表2012-514468号公报、 日本专利特表2012- 51446。

29、9号公报)等。 0086 所述转化的方法没有特别限制, 可以适当选择公知的方法。 0087 在设为所述E7蛋白质表达型乳酸菌的情况下, 编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽 的核酸优选设为与锚定基因结合的核酸。 0088 所述锚定基因没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 优选来自干酪乳酸杆 菌的锚定基因(干酪乳酸杆菌的蛋白酶序列(proteinase sequence of L.casei)。 0089 编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸与所述锚定基因的顺序没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 优选依序结合编码所述来自HPV E7蛋白质的多肽的核酸与所 述锚定基因的形态。 。

30、作为所述优选形态的具体例, 可以列举序列编号4所表示的序列。 0090 所述E7蛋白质表达型乳酸菌所使用的乳酸菌没有特别限制, 可以根据目的进行适 当选择, 优选干酪乳酸杆菌IGM393株、 干酪乳酸杆菌IGM394株。 所述干酪乳酸杆菌IGM394株 是所述干酪乳酸杆菌IGM393株的继代衍生株, 是转化效率高的变异株。 所述干酪乳酸杆菌 IGM393株及干酪乳酸杆菌IGM394株在干酪乳酸杆菌BL23株的全基因组序列中同源性最高。 0091 所述E7蛋白质表达型乳酸菌的培养方法没有特别限制, 可以适当选择公知的方 法。 0092 作为将所述E7蛋白质表达型乳酸菌中的所述来自HPV E7蛋白。

31、质的多肽在菌体表 面的表达量加以调节的方法, 没有特别限制。 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举调 整培养液的pH值的方法等。 0093 如下述制造例2所示, 通过使用改变碳酸氢钠的浓度而调整了培养液的pH值的培 养液, 可以调节所述来自HPV E7蛋白质的多肽在菌体表面的表达量。 0094 所述培养液的pH值有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, pH值优选7左右。 0095 在所述来自HPV E7蛋白质的多肽为与所述锚定蛋白质的融合蛋白质的情况下, 所 述融合蛋白质在菌体表面的含量没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 每1108个 乳酸菌菌体, 优选0.1 g3.3 g, 更。

32、优选0.1 g1.0 g, 进而优选0.2 g1.0 g, 特别优选 0.3 g1.0 g。 如果在所述优选的范围内, 则可以发挥更优异的药理效果(粘膜免疫诱导能 力), 在该方面有利。 0096 其他成分 0097 作为所述含有乳酸菌的组合物中的其他成分, 只要无损本发明的效果则没有特别 限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举医药上允许的载体等。 这些可以单独使用 1种, 也可以将2种以上并用。 0098 所述含有乳酸菌的组合物中的其他成分的含量没有特别限制, 可以根据目的进行 适当选择。 0099 (HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物) 0100。

33、 本发明的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合 说 明 书 6/17 页 8 CN 107249627 A 8 物至少包含含有乳酸菌的组合物, 根据需要还可以包含其他成分。 0101 含有乳酸菌的组合物 0102 所述含有乳酸菌的组合物为上述的本发明的含有乳酸菌的组合物。 0103 所述含有乳酸菌的组合物在所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病 的治疗用口服医药组合物中的含量没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择。 0104 其他成分 0105 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物中 的其他成分没有特别限制, 可以。

34、根据目的进行适当选择, 例如可以列举具有营养强化作用 (免疫增强作用)的中药、 粘膜佐剂、 医药上允许的载体等。 这些可以单独使用1种, 也可以将 2种以上并用。 0106 -具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药- 0107 所述具有营养强化作用(免疫增强作用)的中药没有特别限制, 可以根据目的进行 适当选择, 例如可以列举: 葛根汤、 十全大补汤、 补中益气汤、 小柴胡汤、 小青龙汤等。 这些可 以单独使用1种, 也可以将2种以上并用。 0108 -粘膜佐剂- 0109 所述粘膜佐剂没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如优选与所述具有 营养强化作用(免疫增强作用)的中药配合来进一。

35、步增强所述来自HPV E7蛋白质的多肽等 口服疫苗的特异性体液性免疫和细胞性免疫的粘膜佐剂。 0110 作为所述粘膜佐剂的例子, 可以列举: 来自细菌毒素的佐剂、 合成神经酰胺( GalCer)、 CpG寡核苷酸、 SP-C(表面活性剂)、 SP-B、 IFN- (野生型或变异型)、 双链RNA、 活性 扩增型TNF(Tumor Necrosis Factor, 肿瘤坏死因子)变异体等。 这些可以单独使用1种, 也 可以将2种以上并用。 0111 所述来自细菌毒素的佐剂没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以 列举: 来自霍乱毒素(CT, Cholera Toxin)的多肽、 来自。

36、大肠杆菌不耐热毒素(LT, Heat labileen Terotoxin)的多肽、 来自Vero毒素(VT)的多肽、 来自白喉毒素(DT, Diphtheria Toxin)的多肽、 来自百日咳毒素(PT, Pertussis Toxin)的多肽等。 0112 所述来自细菌毒素的佐剂可以是来自野生型细菌毒素的佐剂, 也可以是来自变异 型细菌毒素的佐剂, 优选来自如下变异型细菌毒素的佐剂, 该变异型细菌毒素为了防止在 口服给药人时产生严重副作用而预先导入有变异。 0113 -医药上允许的载体- 0114 所述医药上允许的载体没有特别限制, 可以根据剂型适当选择公知的载体。 0115 作为所述H。

37、PV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合 物中的其他成分的含量, 没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择。 0116 使用 0117 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可 以单独使用, 也可以与以其他成分作为有效成分的医药并用。 另外, 所述HPV感染症及HPV相 关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可以在调配到以其他成分作为有效 成分的医药中的状态下使用。 0118 剂型 说 明 书 7/17 页 9 CN 107249627 A 9 0119 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物的。

38、 剂型只要为能够口服给药的剂型, 则没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以 列举口服固体制剂(片剂、 包衣片剂、 颗粒剂、 散剂、 胶囊剂等)、 口服液剂(内服液剂、 糖浆 剂、 酏剂等)等。 这些剂型的所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口 服医药组合物可以依据常规方法进行制造。 0120 给药 0121 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物的 给药量、 给药时期、 及给药对象没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择。 0122 所述给药量没有特别限制, 可以考虑给药对象个体的年龄、 体重、 体质、 症状、 是否 已给药。

39、以其他成分作为有效成分的医药或药剂等各种因素而适当选择。 0123 所述给药对象可以适宜地列举人。 0124 所述HPV相关肿瘤没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以列举: 宫 颈癌、 外阴癌、 肛门癌、 口腔癌、 阴道癌、 阴茎癌、 咽喉癌、 及该等癌的癌前病变等。 0125 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可 以适宜地用于宫颈部上皮内瘤变及早期宫颈癌中的至少任一种疾病的治疗用途。 0126 所述早期宫颈癌包括微小型浸润癌的状态。 0127 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物适 于通过对HPV感染症的。

40、患者给药, 而用作其治疗用疫苗。 0128 (治疗HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的方法) 0129 所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组合物可 以通过对个体口服给药而治疗个体的HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病。 因 此, 本发明也涉及一种治疗HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的方法, 其特征 在于: 对个体口服给药所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医 药组合物。 0130 (粘膜免疫诱导剂) 0131 本发明的粘膜免疫诱导剂至少包含含有乳酸菌的组合物, 根据需要还包含其他成 分。 0132 含。

41、有乳酸菌的组合物 0133 所述含有乳酸菌的组合物是上述的本发明的含有乳酸菌的组合物。 0134 所述含有乳酸菌的组合物在所述粘膜免疫诱导剂中的含量没有特别限制, 可以根 据目的进行适当选择。 0135 其他成分 0136 所述粘膜免疫诱导剂中的其他成分没有特别限制, 可以根据目的进行适当选择, 例如可以设为与所述HPV感染症及HPV相关肿瘤中的至少任一种疾病的治疗用口服医药组 合物的其他成分的项目中所记载的成分相同。 0137 所述粘膜免疫诱导剂中的其他成分的含量没有特别限制, 可以根据目的进行适当 选择。 0138 使用 0139 所述粘膜免疫诱导剂可以单独使用, 也可以与以其他成分作为有。

42、效成分的医药并 说 明 书 8/17 页 10 CN 107249627 A 10 用。 另外, 所述粘膜免疫诱导剂也可以在调配到以其他成分作为有效成分的医药中的状态 下使用。 0140 剂型 0141 所述粘膜免疫诱导剂的剂型只要能够口服给药, 则没有特别限制, 可以根据目的 进行适当选择, 例如可以列举: 口服固体制剂(片剂、 包衣片剂、 颗粒剂、 散剂、 胶囊剂等)、 口 服液剂(内服液剂、 糖浆剂、 酏剂等)等。 这些剂型的所述粘膜免疫诱导剂可以根据常规方法 进行制造。 0142 给药 0143 所述粘膜免疫诱导剂的给药量、 给药时期、 及给药对象没有特别限制, 可以根据目 的进行适当。

43、选择。 0144 所述给药量没有特别限制, 可以考虑给药对象个体的年龄、 体重、 体质、 症状、 是否 已给药以其他成分作为有效成分的医药或药剂等各种因素而适当选择。 0145 所述给药对象可以适宜地列举人。 0146 所述粘膜免疫诱导剂可以诱导粘膜上的HPV E7蛋白质特异性细胞免疫应答。 0147 (诱导粘膜免疫的方法) 0148 所述粘膜免疫诱导剂通过对个体口服给药, 能够诱导个体的粘膜免疫。 因此, 本发 明也涉及一种诱导粘膜免疫的方法, 其特征在于: 对个体口服给药所述粘膜免疫诱导剂。 0149 实施例 0150 以下, 说明本发明的制造例及试验例, 但本发明不受这些制造例及试验例的。

44、任何 限定。 0151 (比较制造例1: 公知的LacE7制剂的制造) 0152 依据Poo H.et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1,702-1,709中所记载的 方法, 制造作为公知制剂的LacE7制剂。 0153 简言之, 使用表达载体, 将来自HPV16的变异型E7蛋白质(由序列编号2所表示的氨 基酸序列构成的将与野生型E7蛋白质与Rb蛋白质结合相关的第21号Asp、 第24号Cys及第26 号Glu全部置换为Gly的变异型E7蛋白质)导入至确认有1型辅助T细胞(Th1细胞)的诱导能 力的干酪乳酸杆菌。 利用热使培养后的重组体(LacE7)成为。

45、死菌。 用蒸馏水将从培养基精制 而获得的LacE7清洗数次, 然后进行干燥、 粉体化(LacE7制剂), 在使用之前保存在4下。 所 述LacE7制剂不溶于水性溶剂。 0154 (制造例1: 变异型E7蛋白质结合型乳酸菌的制造) 0155 通过如下方式制造变异型E7蛋白质结合型乳酸菌, 其是在乳酸菌的菌体表面结合 有作为来自HPV E7蛋白质的多肽的变异型E7蛋白质(序列编号2)。 0156 变异型E7蛋白质的制作 0157 -插入了cA与变异型E7蛋白质的融合序列的蛋白质表达用质粒的构建- 0158 所述cA是锚定蛋白质, 且用作将所述变异型E7蛋白质固定在乳酸菌的菌体表面的 工具。 所述c。

46、A可以通过电荷与特定的模体而固定在阳性菌肽聚糖上, 并且是来自乳酸乳球 菌的肽聚糖水解酶AcmA的细胞壁结合蛋白(Tjibbe Bosma,Rolf Kanninga,Jolanda Neef, Sandrine A.L.Audouy,Maarten L.van Roosmalen,Anton Steen,Girbe Buist,Jan Kok, Oscar P.Kuipers,George Robillard,and Kees Leenhouts(2006)Novel Surface 说 明 书 9/17 页 11 CN 107249627 A 11 Display System for P。

47、roteins on Non-Genetically Modified Gram-Positive Bacteria.Appl.Environ.Microbiol.p.880-889)。 0159 通过常规方法, 将所述cA与变异型E7蛋白质的融合序列(参照序列编号3)插入到 作为载体质粒的pQE31(以下有时称为 “pQE31: : cAE7Rb” , 参照图1A)。 0160 -转化- 0161 作为表达所述cA与变异型E7蛋白质的融合蛋白质的宿主, 使用ClearColi(注册商 标)(大肠杆菌BL21DE3LPS改型株, Lucigen)。 0162 首先, 为了导入pREP4(inv。

48、itrogen), 通过电穿孔法进行ClearColi(注册商标)的 转化。 0163 接着, 通过氯化钙法将pQE31: : cAE7Rb导入转化体中, 获得了表达所述cA与变异 型E7蛋白质的融合蛋白质的大肠杆菌(以下有时称为 “Clear Coli(注册商标)pQE31: : cA E7Rb,pREP4” )。 0164 -融合蛋白质的表达及精制- 0165 在包含氨苄西林(最终浓度100 g/mL)及卡那霉素(最终浓度25 g/mL)的Luria- Bertani(LB)液体培养基(Difco实验室公司(Difco Laboratories)中接种一白金环的所 述菌体, 在37下振荡培养一夜。 0166 对所述培养物进行集菌并清洗后, 利用与培养时相同。

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