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1、(10)授权公告号 CN 102178796 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 102178796 B *CN102178796B* (21)申请号 201110110951.0 (22)申请日 2011.04.29 A61K 36/88(2006.01) A61K 8/97(2006.01) A23L 1/29(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 27/02(2006.01) A61P 17/06(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 9/14(2006.01) A61P 。
2、9/10(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61P 17/10(2006.01) (73)专利权人 苏州中药研究所 地址 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱路 199 号苏州大学云轩楼 专利权人 周泉生 (72)发明人 周泉生 顾振纶 蒋小岗 曹志飞 朱峰妍 郭次仪 (74)专利代理机构 苏州创元专利商标事务所有 限公司 32103 代理人 范晴 CN 1346607 A,2002.05.01, CN 1346607 A,2002.05.01, 李红霞 . 灯心草化学成分研究 .中药 材 .2006, 第 29 卷 ( 第 11 期 ), (54) 发明名称 灯芯。
3、草有效组份在制备抗肿瘤或抑制血管生 成药物、 保健食品或化妆品中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种灯芯草有效组份在制备抗 肿瘤和抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆 品中的应用。该发明首次发现灯芯草有效组份具 有抑制肿瘤及肿瘤血管生成的活性， 利用该发现 制备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物可用于治疗 或预防和恶性肿瘤以及与肿瘤血管生成相关的疾 病， 还可用于肿瘤化疗和 /或辅助化疗方面的治 疗。 本发明巧妙地以肿瘤干细胞、 肿瘤细胞和肿瘤 新生血管生成作为治疗疾病的靶点， 研究并阐明 灯芯草有效组份的药用疗效和作用机制， 为灯芯 草有效组份和有效成分的抗肿瘤创新中药研发奠 定了基础， 也为。
4、恶性肿瘤的中药治疗提供科学依 据和重要信息。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李毅 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种灯心草有效组份在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆品 中的应用 ； 所述灯心草有效组份通过以下制备方法得到 ： 干燥的灯心草药材 , 压碎， 50-95% 乙 醇冷浸提取， 醇液减压浓缩至无醇味， 放冷， 得稠浸膏， 加水混悬， 过滤， 上样于已处理好的 AB-8 大孔树脂柱， 依次用水、 30-70。
5、% 乙醇、 80-95% 乙醇洗脱， 收集 80-95% 乙醇洗脱部位， 减 压回收至干， 硅胶拌样， 上样于 100 300 目的硅胶柱， 石油醚 - 乙酸乙酯 4:1-1:4 洗脱至 洗脱液中出现蓝色荧光即止， 将所有淡黄色的流分合并， 减压浓缩至沉淀析出， 过滤， 滤液 再用石油醚 - 乙酸乙酯 4:1-1:4 反复浓缩沉淀， 合并沉淀物， 得到灯心草有效组份。 2. 根据权利要求 1 所述的灯心草有效组份在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或 保健食品或化妆品中的应用， 其特征在于灯心草有效组份用于肿瘤的化学治疗或肿瘤的辅 助治疗。 3. 根据权利要求 1 所述的灯心草有效组份在制备抗肿。
6、瘤或抑制肿瘤血管生成药物或 保健食品或化妆品中的应用， 其特征在于所述抑制肿瘤和 / 或血管生成的药物中含有药学 上有效量的灯心草有效组份及其药学上可接受的载体。 4. 根据权利要求 1 所述的灯心草有效组份在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或 保健食品或化妆品中的应用， 其特征在于所述抑制肿瘤和 / 或血管生成的药物剂型选自注 射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 膏剂、 霜剂或乳剂。 5. 根据权利要求 1 所述的灯心草有效组份在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或 保健食品或化妆品中的应用， 其中所述的肿瘤包括淋巴瘤、 白血病、 淋巴细胞白血病、 肿瘤 干细胞引起的肿瘤、 乳腺癌、 。
7、骨肉瘤、 黑色素瘤、 脑胶质瘤、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 结肠癌。 权 利 要 求 书 CN 102178796 B 2 1/7 页 3 灯芯草有效组份在制备抗肿瘤或抑制血管生成药物、 保健 食品或化妆品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种灯芯草有效组份在制备抗肿瘤药物及肿瘤血管生成抑制物或保 健食品或化妆品中的应用。 背景技术 0002 据 2010 年 2 月卫生部统计资料， 每年全球癌症死亡人数达 1000 万。目前全球四 分之一人口死亡的原因是癌症所致， 并预测若按目前的趋势发展下去， 到 2050 年将有二分 之一的死亡者是由于患了癌症。 我国恶性肿瘤发病率以每年2.5-5速。
8、度增长， 已成为严重 危害人类生命的元凶。中医药治疗肿瘤的历史源远流长， 迄今已有紫杉、 喜树、 砒霜、 绿茶、 灵芝、 人参、 长春花、 天门冬、 半枝莲、 天葵子等用于临床治疗癌症， 取得了一些较好的效果 ； 长期以来， 人们应用传统思维、 理念和方法研发抗癌中草药， 虽然已取得了进步， 但收效甚 微。迄今中草药尚未在国内外成为首选抗癌药物， 现有临床中草药的抗癌疗效亟需进一步 提高。因此， 研发中草药抗癌有效组份、 有效成分是目前治疗恶性肿瘤的当务之急。 0003 血管为正常组织器官的形态发生与功能维护所必需， 它与人体发育失调和多种病 因导致的种种疾病密切相关。 肿瘤新血管形成在肿瘤发。
9、生、 发展、 转移和复发在起举足轻重 的作用。一系列研究表明只要有效地抑制肿瘤新血管形成或破坏已有肿瘤血管， 就能抑制 肿瘤生成、 转移与复发。此外， 糖尿病和风湿性关节炎等疾病都有血管增生， 其血管异常与 肿瘤血管非常相似。因此， 血管增生抑制剂也可用于治疗糖尿病和风湿性关节炎等血管增 生性疾病。 近年来， 人们对肿瘤血管生成机制的研究不断深入， 许多抗肿瘤血管生成的药物 如 Avastin、 Angiostatin 等相继被开发出来， 已在临床上推广应用。这类药物不但可以用 于大多数实体肿瘤的治疗， 还可以用于肿瘤的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗， 同时对其 他与血管生成有关的疾病如糖尿病视。
10、网膜病变、 风湿性关节炎、 银屑病、 血管瘤、 动脉粥样 硬化等的预防与治疗， 都具有一定的理论和现实意义。 0004 灯心草 (Juncus effusus L.) 为灯心草科 (Juncaceae) 灯心草属 (Juncus L.) 植 物灯心草 (Juncus effusus L.) 的干燥茎髓或全草， 别名灯心草、 灯草， 又名虎须草、 灯心、 碧玉草、 水灯心、 铁灯心等。主产于江苏、 四川、 云南、 贵州等地。性微寒， 味甘、 淡， 归心、 肺、 小肠经， 功能清心火， 利小便， 可治疗心烦少眠、 高热口渴、 尿少涩痛、 小儿疳积、 口舌生疮等 症。目前研究表明， 灯心草中的菲类成。
11、分具有抗菌、 抗氧化、 抗微生物及抗藻活性。经文献 调研和查新， 灯心草 (Juncus effuses L) 提取物对肿瘤细胞及肿瘤血管生成的影响， 国内 外至今未见文献报道。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种灯芯草有效组份在制备抑制肿瘤及血管生成的药物或 保健食品或化妆品中的应用， 提供了一种新的抑制肿瘤及肿瘤血管生成的防治方案， 为研 发新型抗肿瘤药物和发现药物作用新的靶点提供科学依据和重要信息， 为中医药抗肿瘤治 说 明 书 CN 102178796 B 3 2/7 页 4 疗提供了新的发展方向。 0006 发明提供的技术方案及用途 0007 为了解决现有技术中的这些问题， 。
12、本发明提供的技术方案如下 ： 0008 一种灯芯草有效组份在制备抗肿瘤或抑制肿瘤血管生成药物或保健食品或化妆 品中的应用。 0009 优选的， 该提取物通过以下制备方法得到 ： 根据权利 1 所述的灯心草有效组份， 其 特征在于该提取物通过以下制备方法得到 ： 干燥的灯心草药材， 压碎， 50-95乙醇冷浸提 取， 醇液减压浓缩至无醇味， 放冷， 得稠浸膏， 加水混悬， 过滤， 上样于已处理好的 AB-8 大孔 树脂柱， 依次用水、 30-70乙醇、 80-95乙醇洗脱， 收集 80-95乙醇洗脱部位， 减压回收 至干， 硅胶拌样， 上样于硅胶 (100 300 目 ) 柱， 石油醚 - 乙酸。
13、乙酯 4 1-1 4 洗脱至洗 脱液中出现蓝色荧光即止， 将所有淡黄色的流分合并， 减压浓缩至沉淀析出， 过滤， 滤液再 用石油醚 - 乙酸乙酯 4 1-1 4 反复浓缩沉淀， 合并沉淀物， 得到灯心草有效组份。 0010 优选的， 灯芯草有效组份用于肿瘤的化学治疗或肿瘤的辅助治疗。 0011 优选的， 所述抑制肿瘤和 / 或血管生成的药物中含有药学上有效量的灯芯草有效 组份及其药学上可接受的载体。 0012 优选的， 所述抑制肿瘤和 / 或血管生成的药物剂型选自注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒 剂、 胶囊剂、 口服剂、 膏剂、 霜剂或乳剂。 0013 优选的， 其中所述的肿瘤包括淋巴瘤、 白血。
14、病、 淋巴细胞白血病、 T 淋巴细胞瘤、 肿 瘤干细胞引起的肿瘤、 乳腺癌、 骨肉瘤、 黑色素瘤、 脑胶质瘤、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 结肠癌等。 0014 优选的， 所述药物用于预防或治疗原发或继发产生的血管瘤、 血管纤维瘤、 新生血 管性青光眼、 糖尿病视网膜病变、 早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞、 视网膜变性、 晶体后纤 维组织增生、 颗粒性结膜炎、 血管生成引起的角膜疾病、 更年期黄斑和黄斑变性、 牛皮癣、 老 年盘状斑变性及风湿性关节炎、 银屑病、 毛细管扩张、 脓性肉芽肿、 伤口愈合中抑制斑痕形 成、 动脉粥样硬化、 脂溢性皮炎和痤疮。 0015 (1) 本发明的用于抑制肿瘤及肿瘤血。
15、管生成的灯芯草有效组份， 其制备方法， 是 干燥的灯芯草药材用乙醇冷浸提取， 醇液减压浓缩至无醇味， 放冷， 得稠浸膏， 加水混悬， 过 滤， 上样于已处理好的大孔树脂柱， 收集乙醇洗脱部位， 减压回收至干， 硅胶拌样， 上样于硅 胶柱， 石油醚 - 乙酸乙酯洗脱至洗脱液中出现蓝色荧光即止， 将所有淡黄色的流分合并， 减 压浓缩至沉淀析出， 过滤， 滤液再用石油醚 - 乙酸乙酯反复浓缩沉淀， 合并沉淀物， 即得。所 述灯芯草有效组份制备的抑制肿瘤及肿瘤血管生成药物含有有效剂量的灯芯草有效组份 及常规要用载体和或赋形剂。可被制成注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 口服剂、 膏剂、 霜剂。
16、或乳剂。 0016 (2) 一种灯芯草有效组份在制备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物或保健食品或化 妆品中的应用。肿瘤包括淋巴瘤、 肿瘤干细胞引起的肿瘤、 淋巴细胞白血病、 T 淋巴细胞瘤、 乳腺癌、 白血病、 骨肉瘤、 黑色素瘤、 脑胶质瘤、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 结肠癌等。 0017 (3) 优选的， 所述抑制肿瘤及血管生成的药物中含有药学上有效量的灯芯草有效 组份及其药学上可接受的载体。 0018 (4) 优选的， 所述抑制肿瘤及血管生成的药物剂型选自注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒 剂、 胶囊剂、 口服剂、 膏剂、 霜剂或乳剂。 说 明 书 CN 102178796 B 4 3/7 页 5。
17、 0019 (5) 优选的， 所述抑制肿瘤及血管生成的药物用于防治至少一种选自下述之一的 疾病 ： 血管瘤、 血管纤维瘤、 白血病、 新生血管性青光眼、 糖尿病视网膜病变、 早熟视网膜病 及视网膜静脉闭塞、 视网膜变性、 晶体后纤维组织增生、 颗粒性结膜炎、 血管生成引起的角 膜疾病、 更年期黄斑和黄斑变性、 牛皮癣、 老年盘状斑变性、 风湿性关节炎、 银屑病、 毛细管 扩张、 脓性肉芽肿、 伤口愈合中抑制斑痕形成、 动脉粥样硬化、 脂溢性皮炎和痤疮。 0020 (6) 优选的， 所述抑制肿瘤及血管生成的药物用于肿瘤或肿瘤转移的化学疗法或 辅助治疗。 0021 2. 本发明的用途如下 ： 00。
18、22 (1) 本发明的提取物用于防治和或治疗至少一种以上选自下述之一的疾病 ： 癌症 (请详见以上权利3所述)和或癌症转移， 白血病、 淋巴瘤、 血管瘤， 血管纤维瘤， 新生血管性 青光眼， 糖尿病视网膜病变， 早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞， 视网膜变性， 晶体后纤维组 织增生， 颗粒性结膜炎， 血管生成引起的角膜疾病， 更年期黄斑和黄斑变性， 牛皮癣， 老年盘 状斑变性及风湿性关节炎， 银屑病， 毛细管扩张， 脓性肉芽肿， 伤口愈合中抑制斑痕形成， 动 脉粥样硬化， 脂溢性皮炎和痤疮。 0023 (2) 本发明提取物有抗肿瘤、 肿瘤血管生成及其他与血管生成有关疾病治疗、 预防 的用途。当然，。
19、 提取物还有用于肿瘤化疗和 / 或辅助治疗的用途。本发明的提取物可制备 抑制肿瘤及肿瘤血管生成保健食品或化妆品。 0024 (3) 本发明中灯芯草有效组份可以单独使用或与其他药物配合制备成灾临床上可 以使用的各种不同剂型的药物， 例如注射液、 片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 口服剂、 膏剂、 霜 剂或乳剂等多种形式。 0025 (4) 本发明中灯芯草有效组份可以应用于抗肿瘤、 肿瘤血管生成及其他与血管生 成有关疾病治疗、 预防， 还可以用于肿瘤化疗和 / 或辅助化疗。更具体地， 本发明提供了用 于药物、 食品、 化妆品的抑制血管生成的提取物。 0026 发明的特点和优点 0027 相对于现。
20、有技术中的方案， 本发明具有以下特点和优点 ： 0028 (1) 研究的原创性 ： 本专利申请人应用自己创立的肿瘤干细胞和肿瘤新生血管生 成模型， 在国内外首先发现灯心草组份具有很强的抗肿瘤及抗肿瘤新生血管生成的作用， 灯心草及其组份的抗肿瘤作用迄今尚未见报道。本研究成果具有原创性。 0029 (2) 研究的创新性 ： 本专利申请人打破常规， 勇于创新， 采用现代高新科学技术发 掘中草药宝库， 研发口服有效、 高效低毒、 价格便宜、 特异性高的灯心草抗癌药物和抗肿瘤 血管生成抑制剂， 具有高科技和中国特色。 本研究以肿瘤干细胞和肿瘤细胞为靶标， 研发中 草药抗癌和抗肿瘤新生血管形成药物， 发现。
21、灯心草组份对肿瘤干细胞和肿瘤细胞具有一定 的特异性抑制作用， 我们将研发出灯心草有效组份和有效成分的创新中药， 本研究成果具 有创新性和开拓性。 0030 (3) 发明的实用性 ： 本专利申请人的研究工作已证明灯心草组份具有较强的抗肿 瘤作用和抗肿瘤新生血管形成的活性， 而且口服有效、 高效低毒、 稳定性好。利用该发现制 备抑制肿瘤及肿瘤血管生成的药物可用于治疗或预防与肿瘤或肿瘤血管生成相关的疾病， 还可用于肿瘤化疗和 / 或辅助化疗方面的治疗。本发明巧妙地以血管生成作为治疗疾病的 靶点， 研究并阐明灯芯草有效组份的药用疗效和机制， 为其新用途开发和发现药物作用新 说 明 书 CN 10217。
22、8796 B 5 4/7 页 6 的靶点提供科学依据和重要信息。灯芯草有效组份可用于药物、 保健品和或化妆品等多种 用途。 0031 综上所述， 本研究集理论创新、 应用创新、 技术创新为一体， 能获得具有自主知识 产权的新药和药用前体物质。 这一创新项目在祖国传统医学的二次开发和研究中具有前瞻 性、 先导性和探索性的前沿技术， 能为抗肿瘤治疗另辟蹊径。 0032 发明的附图说明 0033 图 1 灯芯草有效组份对肿瘤细胞类血管生成的影响 0034 图 2 灯芯草有效组份对肿瘤细胞 MGC803 细胞周期的影响 0035 图 3 灯芯草有效组份对肿瘤细胞 MGC803 细胞凋亡的影响 0036。
23、 图 4 灯芯草有效组份对肿瘤细胞 MGC803DAPI 染色的影响 0037 图 5 灯芯草有效组份对正常胃上皮细胞 GES-1DAPI 染色的影响 具体实施方式 0038 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解， 这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。 实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。本发明提供的灯芯草有效组份 由苏州中药研究所制备。 0039 实施例 1 ： 灯心草醇提物及水提物制备 ： 干燥的灯心草材料， 压碎， 5 10 倍量 的 95乙醇或水冷浸提取两次， 每次 24h， 合并提取液， 。
24、过滤， 减压浓缩得稠浸膏， 置烘箱中 65烘干， 即得。 0040 实施例 2 ： 干燥的灯心草药材， 压碎， 90乙醇冷浸提取， 醇液减压浓缩至无醇味， 放冷， 得稠浸膏， 加水混悬， 过滤， 上样于已处理好的 AB-8 大孔树脂柱， 依次用水、 40乙 醇、 80乙醇洗脱， 收集90乙醇洗脱部位， 减压回收至干， 硅胶拌样， 上样于硅胶(200目) 柱， 石油醚 - 乙酸乙酯 3 1 洗脱至洗脱液中出现蓝色荧光即止， 将所有淡黄色的流分合 并， 减压浓缩至沉淀析出， 过滤， 滤液再用石油醚 - 乙酸乙酯 3 1 反复浓缩沉淀， 合并沉淀 物， 得到灯心草有效组份。 0041 实施例 3 ：。
25、 灯心草有效组份对对多种肿瘤细胞增殖的影响 ： 0042 1 肿瘤细胞株 0043 人 Burkitt s 淋巴瘤细胞 Namalva 及 Raji、 前肿瘤干细胞 2C4G2、 PMKO102-3# 和 p3B11、 人 T 淋巴细胞白血病细胞 Jurkat、 人 T 淋巴细胞系 H9、 人乳腺癌细胞系 MCF-7、 人 白血病细胞株 UC-CUC、 NB4 和 HL-60、 人骨肉瘤细胞系 U-2OS 和 SW1353、 人黑色素瘤细胞系 C8161、 人肺癌细胞 ( 淋巴结转移 )NCI-H292、 人胃癌细胞株 HGC-27、 人肝癌细胞株 HepG2 和 人结肠癌细胞株 SW480 。
26、为本所实验室冻存。 0044 细胞培养基 RPMI 1640 和 DMEM( 高糖 ) 为 Hyclone 公司产品。Alamarblue 试剂为 INVITROGEN 公司产品。 0045 2 受试药物 0046 灯心草醇提物 ( 按实施例 1 方法制备， 含有效组分 ) 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶， 用 RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0047 3 实验方法 ： 说 明 书 CN 102178796 B 6 5/7 页 7 0048 细胞培养 ： 细胞用含体积分数 10小牛血清及 1双抗 ( 抗青霉素和抗链霉素 ) 的 RPMI 1640 或 D。
27、MEM( 高糖 ) 培养液常规培养。每 48-72h 用 0.25胰酶消化， 1 2 1 4 扩瓶传代。 0049 (1) 贴壁细胞 ： 0050 用 0.25胰酶消化贴壁细胞， 离心后计数， 以合适的浓度接种于 96 孔板， 37、 5 CO2 培养箱中培养 24h， 分别加入不同浓度的灯心草醇提物， 另外以单纯的培养液 和未经药物作用的细胞作为空白对照和阴性对照， 每组设 3 个复孔， 培养 46h 后， 加入 AlamarBlue 试剂 10ul/ 孔， 继续培养 2h， 用微孔检测仪进行测定荧光下 OD560/OD590， 按以 下公式计算平均抑制率。 0051 0052 (2) 悬浮。
28、细胞 ： 0053 吸取悬浮细胞悬液， 离心计数， 以合适的浓度与不同浓度的灯心草醇提物混合后， 接种于 96 孔板， 分别以单纯的培养液和未经药物作用的细胞作为空白对照和阴性对照， 每 组设 3 个复孔， 37、 5 CO2培养箱中培养 46h 后， 加入 AlamarBlue 试剂 10ul/ 孔， 继续培 养 2h， 用微孔检测仪进行测定荧光下 OD560/OD590， 按上述公式计算平均抑制率。 0054 灯心草提取物对多种肿瘤细胞表现出较好的增殖抑制作用， 且随着药物浓度的提 高， 对多种肿瘤细胞增殖抑制作用相应地增强， 各药物浓度组比较差异有统计学意义 (P 0.01， P 0.0。
29、5)， 见表 1 和 2。 0055 表 1 灯心草醇提物 ( 含有效组分 ) 对多种肿瘤细胞增殖的影响 (1) 0056 0057 表 2 灯心草醇提物 ( 含有效组分 ) 对多种肿瘤细胞增殖的影响 (2) 0058 说 明 书 CN 102178796 B 7 6/7 页 8 0059 实施例 4 ： 灯心草有效组份对多种胃癌细胞和正常的胃上皮细胞增殖的影响 0060 1 细胞株 ： 人胃癌细胞 SGC-7901、 AGS 和 MGC803， 人正常胃粘膜上皮细胞 GES-1 0061 2 受试药物 ： 灯心草有效组分 ( 按实施例 2 制备 )， 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶， 用 。
30、RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0062 3 实验方法 ： 同实施例 3 0063 4 实验结果 ： 灯心草有效组份对多种胃癌细胞表现出较好的增殖抑制作用， 且随 着药物浓度的提高， 对多种胃癌细胞增殖抑制作用相应地增强， 灯心草有效组份对三种胃 癌细胞 SGC-7901、 AGS 和 MGC803 的半数抑制浓度分别为 15.06、 12.46 和 9.77ug/ml 左右 ； 同时， 灯心草有效组份对正常的胃粘膜上皮细胞 GES-1 只有在较高的浓度才表现出抑制作 用， 其半数抑制浓度在 26.08ug/ml( 表 3)， 以上结果提示灯心草有效组份能。
31、特异性地作用 于肿瘤细胞， 而对正常的细胞没有作用。 0064 表 3 灯心草有效组份对胃癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞增殖的影响 0065 0066 实施例 5 ： 灯心草有效组分对体外肿瘤细胞类血管生成的影响 0067 1 细胞株 ： 胃癌细胞 MGC803 0068 2 受试药物 ： 灯心草有效组分 ( 按实施例 2 制备 )， 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶， 用 RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0069 3 实验方法 ： 0070 实验前一天将 Matrigel 置于冰上过夜， 同时实验时用的枪头和孔板均需置于冰 上。 实验时取150uL融化的BD。
32、公司的Matrigel， 加入到48孔板中， 轻拍使之均匀分布， 37 孵育 1h 使 Matrigel 聚合成胶。取合适含量的对数生长期肿瘤细胞， 与含不同浓度的灯心 草有效组分等体积混合， 以200uL/孔接种在Matrigel上， 于37、 5C02培养箱培养若干 小时后， 应用瑞 - 姬氏染液染色后， 置于显微镜下观察并拍照。 0071 4 实验结果 ： 0072 肿瘤细胞 MGC803 在体外能够形成类血管样结构， 灯心草有效组分对肿瘤细胞的 类型管生成表现出较好的抑制作用， 且随着药物浓度的提高， 对肿瘤细胞增殖抑制作用相 应地增强， 见图 1 所示。 0073 实施例 6 ： 灯。
33、心草有效组分对肿瘤细胞细胞周期的影响 ： 0074 1 细胞株 ： 胃癌细胞 MGC803 0075 2 受试药物 ： 灯心草有效组分 ( 按实施例 2 制备 )， 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶， 用 RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0076 3 实验方法 ： 0077 将不同浓度的灯心草有效组份处理肿瘤细胞 MGC80324h 后， 收集细胞， 1000rpm 离 心 5min， 室温下 PB S 离心洗涤 2 次， 去上清， 加入体积分数为 70的冷乙醇 7001， 4固 说 明 书 CN 102178796 B 8 7/7 页 9 定过夜。离心去。
34、上清， PBS 离心洗涤， 加 PBS 制成细胞悬液， 再加入 PI 染液混匀， 置 4避光 30min 后上流式细胞仪 (EPICSXL 型， Beckman-Coulter 公司， 美国 ) 检测细胞周期。 0078 4 实验结果 ： 流式细胞仪检测结果显示 ： 随着灯心草有效组份浓度的增高， MGC803 细胞 G0/G1 期明显升高， G2/M 期明显降低， 存在着量效关系 ( 图 2)， 提示灯心草有效组份能 够使肿瘤细胞 MGC803 发生细胞周期阻滞， 从而抑制细胞增殖。 0079 实施例 7 ： 灯心草有效组分对肿瘤细胞细胞凋亡的影响 ： 0080 1 细胞株 ： 胃癌细胞 M。
35、GC803 0081 2 受试药物 ： 灯心草有效组分 ( 按实施例 2 制备 )， 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶， 用 RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0082 3 实验方法 ： 0083 将不同浓度的灯心草有效组份处理肿瘤细胞 MGC80348h 后， 常规消化不同浓度、 作用不同时间的细胞， 离心收集固定后的细胞， 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 清洗。加入 500l 结合缓冲液重悬细胞， 立即加入 Annexin V- 异硫氰酸荧光素 (FITC) 和碘化丙啶 (PI) 各 5l， 100g/ml 的核糖核酸酶 A 的溶液中重悬细胞沉淀， 流式细胞。
36、仪检测细胞凋亡率。 0084 4 实验结果 ： 0085 Annexin V-PI试剂盒进行流式细胞仪检测结果显示 ： 随着灯心草有效组份浓度的 增高， 肿瘤细胞MGC 803细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均明显上升， 存在着量效关系(图 3)， 提示灯心草有效组份能够使肿瘤细胞 MGC803 发生细胞凋亡， 从而抑制细胞增殖。 0086 实施例 8 ： 灯心草有效组分对细胞 DAPI 染色的影响 ： 0087 1 细胞株 ： 人胃癌细胞 MGC 803， 人正常胃粘膜上皮细胞 GES-1 0088 2 受试药物 ： 灯心草有效组分 ( 按实施例 2 制备 )， 用二甲基亚砜 (DMSO) 助溶。
37、， 用 RPMI 1640 或 DMEM( 高糖 ) 培养基稀释成所需浓度。 0089 3 实验方法 ： 0090 不同浓度灯心草有效组分处理48h的细胞于3000rpm离心5min后用1多聚甲醛 室温固定 20min， PBS 离心洗涤 2 次， 去上清， 加入 1ug/mL DAPI 溶液作用 10min。离心去上 清， PBS 离心洗涤后， 荧光显微镜拍照。 0091 将不同浓度的灯心草有效组份处理肿瘤细胞 MGC803 和正常胃粘膜上皮细胞 GES-148h 后， 收集细胞利用 DAPI 试剂进行染色检测。 0092 4 实验结果 ： 0093 随着灯心草有效组份浓度的增高， MGC8。
38、03 细胞死亡明显上升， 存在着量效关系 (图4-5)， 正常胃上皮细胞GES-1变化不大， 提示灯心草有效组份能特异性地作用于肿瘤细 胞， 而对正常的细胞未见明显影响 0094 本发明是结合最佳实施例进行描述的， 然而在阅读了本发明的上述内容后， 本领 域技术人员能领会并在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果， 而不超出 本发明的构思、 精神和范围。 更具体地说， 显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所 公开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说， 显 然都认为是本发明的精神、 范围和构思及权利要求范围内的， 即所有上述这些等价形式都 同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 说 明 书 CN 102178796 B 9 1/3 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102178796 B 10 2/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102178796 B 11 3/3 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 102178796 B 12 。