肿瘤坏死因子受体融合蛋白及其使用方法.pdf

本发明提供了嵌合融合多肽，其包含与犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区结合的犬TNF受体p60或p80多肽的细胞外结构域。该嵌合融合多肽可用于治疗或预防犬的由TNF表达介导的病症。

1.  嵌合融合多肽，包含犬TNF受体多肽的细胞外结构域或所述细胞外结构域的TNF结合片段，其结合包含犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区或其片段的多肽，其中所述Fc区的片段至少包含CH2和CH3恒定结构域。

2.  如权利要求1所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包括犬TNF受体多肽p80或其TNF结合片段。

3.  如权利要求2所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包含SEQ ID NO:14或与其具有至少95％序列同一性的序列。

4.  如权利要求1所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包括犬TNF受体多肽p60或其TNF结合片段。

5.  如权利要求4所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包含SEQ ID NO:1或与其具有至少95％序列同一性的序列。

6.  如权利要求1-5中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述Fc区包括铰链区、CH2恒定结构域和CH3恒定结构域。

7.  如权利要求1-6中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述Fc区包括选自亚型A、亚型B、亚型C和亚型D的IgG亚型。

8.  如权利要求7所述的嵌合融合多肽，其中所述Fc区包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

9.  如前述权利要求中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含功能上插入所述犬TNF受体多肽和包含所述Fc区的所述多肽之间的连接肽。

10.  如权利要求5所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

11.  如权利要求5所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

12.  如权利要求3所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

13.  如权利要求3所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

14.  如前述权利要求中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽以平衡解离常数(KD)为1x10^-8或更小的结合亲和性结合犬TNF-α。

15.  分离的多肽，其包含SEQ ID NO:14或与其具有至少95％序列同源性的序列。

16.  分离的多核苷酸，其编码权利要求15所述的多肽。

17.  多核苷酸，其编码包含选自下组的氨基酸序列的嵌合融合多肽：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

18.  重组载体，其包含权利要求17所述的多核苷酸。

19.  如权利要求18所述的重组载体，其中所述载体与表达启动子位置上相邻且受其控制，或者与其可操作地连接。

20.  药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽或权利要求17所述的多核苷酸，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

21.  药物组合物，其包含嵌合融合多肽和药学上可接受的载体或赋形剂，所述嵌合融合多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID  NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列。

22.  如权利要求20或21所述的药学组合物，还包含至少一种其他的TNF拮抗剂化合物和/或抗炎化合物。

23.  如权利要求22所述的药物组合物，其中所述TNF拮抗剂化合物是氨甲蝶呤。

24.  权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽，权利要求17所述的多核苷酸、权利要求18或19所述的载体或权利要求20-23中任一项所述的药物组合物作为药物的用途。

25.  权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽，权利要求17所述的多核苷酸、权利要求18或19所述的载体或权利要求20-23中任一项所述的药物组合物在治疗或预防犬的由TNF表达介导的病症中的用途。

26.  权利要求25所述的嵌合融合多肽用于权利要求25所述的用途，其中所述由TNF表达介导的病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

27.  权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽，权利要求17所述的多核苷酸、权利要求18或19所述的载体或权利要求20-23中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗或预防犬的由TNF表达介导的病症的药物中的用途。

28.  如权利要求27所述的用途，其中所述由TNF表达介导的病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性 血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

29.  用于治疗或预防有需要的犬中由TNF表达介导的病症的方法，其包括将权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽，权利要求17所述的多核苷酸、权利要求18或19所述的载体或权利要求20-23中任一项所述的药物组合物施用于所述犬的步骤。

30.  如权利要求29所述的方法，其中所述由TNF表达介导的病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

31.  如权利要求29或30所述的方法，还包括施用至少一种额外的药物组合物的步骤。

32.  如权利要求31所述的方法，其中所述额外的药物组合物包含选自下组的药物：TNF拮抗剂、抗炎化合物、氨甲蝶呤、针对犬TNF的嵌合抗体或犬源化抗体、抗犬TNF抗体片段、至少一种镇痛剂、细胞因子抑制抗炎药物的化合物、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子拮抗剂。

33.  具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列的氨基酸序列的嵌合融合多肽或编码所述氨基酸序列的多核苷酸作为药物的用途。

34.  具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID  NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列的氨基酸序列的嵌合融合多肽，或编码所述氨基酸序列的多核苷酸，在治疗或预防犬的由TNF表达介导的病症中的用途。

35.  权利要求34所述的嵌合融合多肽用于权利要求34所述的用途，其中所述由TNF表达介导的病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

36.  具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列的氨基酸序列的嵌合融合多肽，或编码所述氨基酸序列的多核苷酸，在制备用于治疗和/或预防犬的由TNF表达介导的病症的药物中的用途。

37.  如权利要求36所述的嵌合融合多肽的用途，其中所述由TNF表达介导的病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

38.  用于治疗或预防有需要的犬的由TNF表达介导的病症的方法，包括以下步骤：
-将具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及与前述任一序列具有至少90％序列同源性的序列的氨基酸序列的嵌合融合多肽，或包含编码所述氨基酸序列的多核苷酸的载体以治疗有效量施用于所述犬。

39.  如权利要求38所述的方法，其中由TNF表达介导的所述病症选自炎性介导的病症、慢性炎性疾病、关节炎如免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、多发性关节炎、幼年特发性关节炎和银屑病性关节炎、强直性脊椎炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘、过敏症、败血症、休克、糖尿病，和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

40.  如权利要求38或39所述的方法，还包括施用至少一种额外的药物组合物的步骤。

41.  如权利要求40所述的方法，其中所述额外的药物组合物包含选自下组的药物：TNF拮抗剂、抗炎化合物、氨甲蝶呤、针对犬TNF的嵌合抗体或犬源化抗体、抗犬TNF抗体片段、至少一种镇痛剂、细胞因子抑制抗炎药物的化合物、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子拮抗剂。

42.  用于降低有需要的犬中肿瘤坏死因子水平的方法，所述方法包括以下步骤：
-将具有选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22以及与前述任一 序列具有至少90％序列同源性的序列的氨基酸序列的嵌合融合多肽，或包含编码所述氨基酸序列的多核苷酸的载体以治疗有效量施用于所述犬。

43.  如权利要求42或所述的方法，还包括施用至少一种额外的药物组合物的步骤。

44.  如权利要求43所述的方法，其中所述额外的药物组合物包含选自下组的药物：TNF拮抗剂、抗炎化合物、氨甲蝶呤、针对犬TNF的嵌合抗体或犬源化抗体、抗犬TNF抗体片段、至少一种镇痛剂、细胞因子抑制抗炎药物的化合物、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子拮抗剂。

45.  用于产生权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽的方法，所述方法包括：
(i)提供重组宿主细胞，其包含能够表达编码权利要求1-14中任一项所述的嵌合融合多肽的多核苷酸的载体；
(ii)在适合表达所述嵌合融合多肽的条件下培养所述重组宿主细胞，以及
(iii)回收所述嵌合融合多肽。

46.  纯化二聚体形式的嵌合融合多肽的方法，所述嵌合融合多肽包含犬TNF受体多肽的细胞外结构域或所述细胞外结构域的TNF结合片段，其结合包含犬IgG免疫球蛋白B型重链的Fc区或其片段的多肽，所述Fc区的片段至少包含CH2和CH3恒定结构域，所述方法包括在pH为4.7-5.3下从蛋白A洗脱所述二聚体形式的嵌合融合多肽的步骤。

47.  如权利要求46所述的方法，其中在pH为4.8-5.2下从蛋白A洗脱所述二聚体形式的嵌合融合多肽。

48.  如权利要求47所述的方法，其中在pH为4.9-5.1下从蛋白A洗脱所述二聚体形式的嵌合融合多肽。

49.  如权利要求48所述的方法，其中在pH为5.0下从蛋白A洗脱所述二聚体形式的嵌合融合多肽。

50.  如权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述犬TNF受体包 括犬TNF受体多肽p80或其TNF结合片段。

51.  如权利要求50所述的方法，其中所述犬TNF受体多肽包含SEQ ID NO:14或与其具有至少95％序列同一性的序列。

52.  如权利要求46-49中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包括犬TNF受体多肽p60或其TNF结合片段。

53.  如权利要求52所述的嵌合融合多肽，其中所述犬TNF受体多肽包含SEQ ID NO:1或与其具有至少95％序列同一性的序列。

54.  如权利要求46-53中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述Fc区包含SEQ ID NO:3。

55.  如权利要求46-54中任一项所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和与前述任一序列具有至少90％序列同源性的多肽序列。

56.  如权利要求55所述的嵌合融合多肽，其中所述嵌合融合多肽包含SEQ ID NO:7或与其具有至少90％序列同源性的多肽序列。

肿瘤坏死因子受体融合蛋白及其使用方法
发明领域
本发明涉及嵌合融合多肽，其包含经结合而形成二聚融合蛋白的犬肿瘤坏死因子的细胞外配体结合部分和犬免疫球蛋白Fc结构域多肽。本发明还延及编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸、嵌合融合多肽的制备方法，并且还延及其用于治疗或预防炎性疾病特别是TNF相关病症的用途。
发明背景
肿瘤坏死因子α(TNF-α)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)在功能上表现出明显的重叠。这种相同性使得这些细胞因子被统称为肿瘤坏死因子(TNF)。TNF对介导促炎免疫应答发挥强大的多效性作用，并且还显示出参与控制细胞增殖、分化和凋亡。TNF通过结合I和II型TNF受体(TNFR)来介导这些作用，所述受体是在TNF应答细胞上表达的细胞表面受体。
TNF拮抗剂，如抗TNF抗体、可溶性TNF受体蛋白和TNF受体-Fc融合蛋白的使用已表明，可以逆转由TNF介导的促炎作用，如诱导促炎细胞因子表达(IL-1、IL-8)的表达和组织破坏。此外，重组TNFR-Fc融合蛋白如ENBREL(Etanercept,Immunex)的使用已表明，TNF的拮抗作用可用于治疗TNF相关病症，特别是风湿性关节炎。
因此，已经证明，使用肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白或抗TNF中和单克隆抗体抑制TNF是治疗包括风湿病关节炎和银屑病性关节炎的各种人炎性疾病的成功治疗途径。
伴侣动物如狗会发生类似于人所发生的炎性疾病，例如风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、免疫介导的多发性关节炎、血浆-淋巴细胞性滑膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎和各种自身免疫性皮肤病。据估计，在美国五分之一的成年狗有关节炎，并且狗被用作人关节疾病如骨关节炎、前交叉韧带撕裂和半月板损伤的模型。
已有大量的文献证明TNF在狗发生炎症中的作用。例如，已观察到，在患有膝关节炎的狗的滑液的细胞渗透物中，TNF-α的分泌增加，并且已显示，在患有青光眼的狗的中心视网膜和外围视网膜中，作为广泛的炎性反应的一部分，II型TNF受体显著增加。在人的心脏病的封闭胸腔模型中由球囊闭塞引起缺血再灌注后，用人TNFR-Fc融合蛋白依那西普((huTNFR-Fc)Immunex,一种TNF拮抗剂)处理狗，使心肌损伤降低约25-40％，同时伴随有相关炎症标记物如ICΑM-1和NF-kB的减少。同样，也已经证明，在缺血-再灌注的开胸狗模型中使用2mg/kg TNFR-Fc，梗死面积降低60％。然而，由于当注射于狗时人的蛋白的免疫原性，使用huTNFR-Fc作为治疗狗的疾病的治疗剂并不表明超出这个人类疾病的模型。此外，依那西普的IgG Fc结构域是补体募集的(complement recruiting)，并因此由于介导的免疫反应，其在炎性疾病的背景下是不期望的。
抗犬TNF单克隆抗体已用于通过捕获ELISA法检测用脂多糖(LPS)处理的犬PBMC的上清液中低水平的TNF，并且还报道过，在犬血管外皮细胞瘤、成视网膜细胞瘤(tricoblastoma)、脂肪瘤和肥大细胞瘤的皮肤样品中存在TNF-α表达。在骨关节炎的诱导模型中，犬关节软骨中存在TNF-α受体和TNF受体，同时已经在患剥脱性皮肤型红斑狼疮(ECLE)的两只狗中测试了抗TNF的人源化单克隆抗体阿达木单抗(Adalimumab)(每两周0.5mg/kg，共8周)，但是疾病进展照旧且血清TNF-α水平保持不变。对阿达木单抗的免疫原性会潜在地导致这些重复给药研究失去效果。具体而言，可能产生抗阿达木单抗的中和抗体会妨碍重复给药，并因此限制这种治疗途径的长期有效性。
由于TNF参与犬的各种炎性介导的病症，因此为了治疗狗的TNF相关病症和炎性病症，需要可用于长期抑制TNF的犬TNF抑制剂。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了嵌合融合多肽，其包含、组成或基本组成为：犬TNF受体多肽的细胞外结构域或其TNF结合片段，其结合包 含、组成为或基本组成为犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区或其片段的多肽，其中所述Fc区的片段至少包含CH2和CH3恒定结构域。
通常，嵌合融合多肽特异性结合犬TNF。通常，嵌合融合多肽中和犬TNF的生物活性。在某些实施方案中，TNF是指TNF-α和/或TNF-β。嵌合融合蛋白显示提高的稳定性和体内半寿期。此外，更具体地，嵌合融合多肽在施用至犬时，通过限制中和抗体、特别是其异种抗体的生成，克服了与将迄今为止已知的抗TNF化合物施用于犬相关的问题。
通常犬TNF受体多肽的细胞外结构域包含、组成为或基本组成为缺少跨膜结构域和胞浆结构域的截短形式的犬肿瘤坏死因子受体。通常，细胞外结构域或其片段包含犬TNF受体多肽的配体结合部分，并结合至TNF。在某些实施方案中，嵌合融合多肽包含与犬TNF受体多肽的细胞外结构域连接的信号序列。通常，细胞外结构域或其片段抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，犬TNF受体多肽是犬TNF受体多肽p60(caTNFR p60)。因此，在某些实施方案中，细胞外结构域包含、组成为或基本组成p60可溶形式的犬TNF受体的细胞外结构域。在某些实施方案中，细胞外结构域包括与细胞外结构域连接的信号序列。在某些实施方案中，可以使用caTNFR p60肽的片段，特别是细胞外结构域的TNF结合部分。在某些实施方案中，犬TNF受体多肽包含、组成为或基本组成为SEQ ID NO:1的氨基酸(由SEQ ID NO:23编码)或与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列与犬TNF结合。通常，所述序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，犬TNF受体多肽是犬TNF受体多肽p80(caTNFR p80)。因此，在某些实施方案中，细胞外结构域包含、组成为或基本组成为caTNFR p80的细胞外结构域。在某些实施方案中，细胞外结构域包括与细胞外结构域连接的信号序列。在某些实施方案中，可以使用caTNFR p80肽的片段，特别是细胞外结构域的TNF结合部分。在某些实施方案中，犬TNF受体多肽包含、组成为或基本组成为SEQ ID NO:14的氨基酸或与 其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述序列与犬TNF结合。通常，所述序列抵消犬TNF的生物活性。
通常，犬TNF受体多肽的细胞外结构域的片段特异性结合犬TNF。通常，所述片段抵消犬TNF的生物活性。
通常，包含、组成为或基本组成为犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区成的多肽或其片段至少包含、组成为或基本组成为犬IgG免疫球蛋白重链的CH2和CH3恒定结构域。在某些实施方案中，还提供了铰链区或其片段。在某些实施方案中，从犬IgG免疫球蛋白重链衍生的Fc区是IgG亚型A(例如caHCA，SEQ ID NO:2)、IgG亚型B(例如caHCB，SEQ ID NO:3)、IgG亚型C(例如caHCC，SEQ ID NO:4)或IgG亚型D(例如caHCD，SEQ ID NO:5)，或其片段。在某些实施方案中，Fc区包含、组成为或基本组成为选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2(如通过SEQ ID NO:24所编码的)、SEQ ID NO:3(如通过SEQ ID NO:25所编码的)、SEQ ID NO:4(如通过SEQ ID NO:26所编码的)、SEQ ID NO:5(如通过SEQ ID NO:27所编码的)和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，或其片段。通常Fc区或其片段或与其具有同源性的序列提供了稳定性提高和体内半寿期提高的犬TNF受体多肽。
犬TNF受体多肽的细胞外结构域或其片段可以共价连接的方式与包含犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区的多肽或其片段结合。在某些实施方案中，连接体如多肽连接体可以用于使犬TNFR细胞外结构域多肽与犬Fc结构域多肽或其片段共价连接，以形成嵌合融合多肽，其也被称为融合蛋白或免疫缀合物。尽管由于犬来源的免疫球蛋白组分的Fc结构域的铰链区所赋予的结构柔性，通常不需要连接体区，但是如果使用了连接体，则该连接体可含有至少一个切割位点。因此，在某些实施方案中，嵌合融合多肽还包含功能上插入犬TNF受体多肽和犬IgG Fc结构域多肽之间的连接肽。
在某些实施方案中，嵌合融合多肽包含、组成为或基本组成为选自 下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6(如通过SEQ ID NO:28所编码的)、SEQ ID NO:7(如通过SEQ ID NO:29所编码的)、SEQ ID NO:8(如通过SEQ ID NO:30所编码的)、SEQ ID NO:9(如通过SEQ ID NO:31所编码的)和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与犬TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，嵌合融合多肽包含、组成为或基本组成为选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与犬TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，嵌合融合多肽包含、组成为或基本组成为选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与犬TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，嵌合融合多肽包含、组成为或基本组成为选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与犬TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些进一步的实施方案中，本发明的嵌合融合多肽以1x10^-8或更小的平衡解离常数(K_D)的结合亲和性与犬TNF-α(肿瘤坏死因子α)特异性结合。此外，优选的是，在施用于犬个体后，没有产生抗本发明的嵌合融合多肽的异种抗体(也称为中和抗体)。此外，优选的是，嵌合融合多肽的Fc结构域部分不介导任何下游效应子功能，包括但不限于，补体募集、定位和激活，ADCC以及Fc受体的结合与激活。可对犬IgG Fc结构域多肽的氨基酸序列进行突变、取代和添加，以确保Fc受体介导下游效应子功 能不会发生。此外，可根据所期望的不介导下游效应子功能的特性来选择衍生自犬IgG重链的特定亚型的犬IgG Fc结构域多肽。
在某些实施方案中，可对本发明的嵌合融合多肽的Fc结构域的氨基酸残基的氨基酸序列进行修饰。所述修饰可涉及添加、取代或缺失一个或多个氨基酸残基。通常会进行所述氨基酸的改变，以改变抗体的功能特性。例如，可进行氨基酸修饰，从而通过例如阻止Fc结构域组分结合Fc受体、激活补体或诱导ADCC的能力防止由嵌合融合多肽的Fc结构域组分介导的下游效应子功能。此外，可对Fc结构域残基的氨基酸残基进行修饰，以改变嵌合融合多肽的循环半寿期。
本发明还延及分离的多肽及其在本发明的下述方法中的用途，所述分离的多肽包含、组成为或基本组成为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:14或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。通常，所述同源序列结合犬TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。本发明还延及使用SEQ ID NO:14作为犬TNF受体多肽p80的细胞外结构域。
在各个其他的方面，本发明延及编码本发明嵌合融合多肽的多核苷酸。在各个其他的方面，本发明延及编码本发明的嵌合融合多肽的多核苷酸在犬中的表达。
因此，本发明其他方面提供了编码嵌合融合多肽的多核苷酸，所述嵌合融合多肽包含犬TNF受体多肽的细胞外结构域或其片段，其结合包含犬IgG免疫球蛋白重链的Fc区或其片段的多肽。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含选自下组的序列：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列编码结合犬TNF的多肽。通常，所述多肽抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码包含选自下组的氨基酸序列的嵌合多肽：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和与前述 任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与犬TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，所述多核苷酸编码嵌合多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
本发明的又一方面提供了包含编码嵌合融合多肽的多核苷酸的重组载体，所述嵌合融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与前述任一序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。在某些实施方案中，所述载体与表达启动子位置上相邻且受其控制，或者与其可操作地连接。
还提供了分离的多核苷酸，其编码犬TNF受体多肽的细胞外结构域。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码犬TNF受体(caTNFR)多肽，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。在某些实施方案中，所述多核苷酸编码犬TNF受体(caTNFR)多肽，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源序列与TNF结合。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。在某些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:23或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列，其中所述同源 序列编码与TNF结合的多肽。通常，所述多肽抵消犬TNF的生物活性。SEQ ID NO:23是编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还延及包含本文所述的多核苷酸之一的重组载体。
在各个其他方面，本发明延及所述嵌合融合多肽或编码所述多肽的多核苷酸在治疗和/或预防犬的由TNF表达介导的病症的方法中的用途。本发明的方法所使用的嵌合融合多肽、载体或多核苷酸可以是以上所述的嵌合融合多肽、载体或多核苷酸的任意一种。
因此，本发明的又一方面提供了用于预防、降低或改善有需要的犬的不期望的炎性反应的方法，该方法包括以下步骤：
-提供嵌合融合多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列，或者提供包含编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸的载体，以及
-将其以足以预防、降低或改善炎性反应的治疗有效量施用于犬。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，该方法还包括与所述嵌合融合多肽一同施用至少一种其他的TNF拮抗剂或抗炎化合物的步骤。
本发明的又一方面提供了用于降低有需要的犬中肿瘤坏死因子(TNF)水平的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供嵌合融合多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或 99％序列同源性的多肽序列，或者提供包含编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸的载体，以及
-将其以足以降低肿瘤坏死因子水平的治疗有效量施用于犬。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，该方法还包括施至少一种其他的TNF拮抗剂或抗炎化合物的步骤。
本发明的再一方面提供了用于治疗或改善有需要的犬的肿瘤坏死因子(TNF)相关病症的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供嵌合融合多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列，或者提供包含编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸的载体，以及
-将其以足以治疗或改善病症的治疗有效量施用于犬。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，该方法还包括施用至少一种其他TNF拮抗剂或抗炎化合物的步骤。
在某些实施方案中，不期望的炎性反应或TNF相关病症为慢性炎性疾病。所述慢性炎性疾病可以选自下组：风湿性关节炎(RA)、骨关节炎和其他多发性关节炎、强直性脊椎炎(AS)、克罗恩病和溃疡性结肠炎、银屑病和银屑病性关节炎(PsA)、系统性血管炎、异位性皮炎、充血性心力衰竭(CHF)、难治性葡萄膜炎、支气管哮喘以及过敏症，但并不限于此。炎性介导的病症还可以包括败血症和休克、糖尿病和神经退行性病症如阿兹海默病、帕金森氏病、中风和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
在某些其他的实施方案中，不期望的免疫反应或TNF相关病症(其也可以成为TNF-α相关病症(disorder)或其中TNF-α是关键炎性介质的病症)可包括但不限于：白塞氏病、大疱性皮炎、嗜中性皮炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性血管炎、坏疽性脓皮病、化脓性皮炎、脑型疟、溶血性尿毒综合症、先兆子痫、同种异体移植排斥、中耳炎、蛇咬伤、结节性红斑、骨髓增生异常综合症、移植物抗宿主疾病、皮肌炎和多肌炎。
根据本发明的又一方面，提供了治疗有需要的犬的关节炎或关节炎病症的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供嵌合融合多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列，或者提供包含编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸的载体，以及
-以治疗有效量施用于犬。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，关节炎或关节炎病症包括选自以下的病症：免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊椎炎和相关病症。
通常，关节炎或关节炎病症的治疗包括改善、抑制、降低或压制导致关节炎病症、与其相关的或由其引起的免疫反应。
本发明的又一方面提供了治疗犬个体中由犬TNF表达增加或对TNF敏感性增加引起的或与其相关的或导致其的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供嵌合融合多肽，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID  NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列，或者提供包含编码所述嵌合融合多肽的多核苷酸的载体，以及
-以治疗有效量施用于需要该治疗的犬。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，本发明的前述方法还包括共施用至少一种其他药剂的步骤，该药剂可以提高和/或补充本发明的嵌合融合多肽的功效。例如，该嵌合融合多肽可以与一种或多种额外的药物组合物共施用。所述额外的组合物可包括用于治疗慢性炎性病症特别是TNF-α相关病症的药物。在某些实施方案中，所述额外的药物组合物可以是TNF拮抗剂，如氨甲喋呤、针对犬TNF的嵌合抗体或犬源化抗体、抗犬TNF抗体片段、至少一种镇痛剂、细胞因子抑制抗炎药物的化合物、NSAID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子拮抗剂。
合适的镇痛剂的实例包括但不限于布托啡喏、丁丙诺啡、芬太尼、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、哌替啶、吗啡、纳布啡及其衍生物。合适的NSΑID包括但不限于对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、卡洛芬、依托度酸、酪洛芬、美洛昔康、非罗考昔、罗贝考昔(robenacoxib)、德拉昔布等。
在某些另外的实施方案中，所述至少一种其他药剂或药物组合物可以是活性治疗剂，其可以是选自抗生素、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂或类似治疗剂中的一种或多种。而且，所述至少一种其他药剂可以是炎症介质(mediator)的抑制剂例如PGE受体拮抗剂，免疫抑制剂例如环孢霉素，或抗炎糖皮质激素。在某些其他方面中，所述至少一种其他药剂可以是用于治疗认知功能障碍或损伤如老龄犬中可能日益普遍的失忆或相关病症的药剂。而且，所述至少一种其他药剂可以是用于治疗心血管功能失调的抗高血压药剂或者其他化合物，例如用于治疗高血压、 心肌缺血、充血性心力衰竭等。此外，所述至少一种其他药剂可以是利尿剂、血管扩张剂、β肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张肽II转化酶抑制剂、钙通道阻滞剂或HMG-CoΑ还原酶抑制剂。
在某些实施方案中，作为前述方法的一部分，将嵌合融合蛋白或抗原结合片段以约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重，特别是从约0.03mg/kg体重至约3mg/kg体重的剂量范围施用于犬。
本发明的又一方面提供了上述的嵌合融合多肽或多核苷酸，用作药物，特别是用于治疗或预防上述病症的任一种药物。本发明延及上述嵌合融合多肽或多核苷酸在制备用于治疗或预防任意上述病症的药物中的用途。
在各种其它方面，本发明延及包含本发明任何前述方面的结合犬TNF的嵌合融合多肽的组合物。本发明的组合物所用的嵌合融合多肽可以是上述嵌合融合多肽的任一种。在某些实施方案中，该组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了包含嵌合融合多肽以及至少一种载体稀释剂或赋形剂的药物组合物，所述嵌合融合多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的序列。
在某些实施方案中，同源序列结合TNF。通常，所述同源序列抵消犬TNF的生物活性。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种其他的TNF拮抗剂化合物和/或抗炎化合物。在某些实施方案中，所述TNF拮抗剂化合物为氨甲蝶呤。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种镇痛剂、NSΑID、阿片样物质、皮质类固醇、类固醇或神经生长因子的拮抗剂。
本发明的又一方面提供了用于产生嵌合融合多肽的方法，该嵌合融合多肽包含与犬IgG免疫球蛋白的Fc结构域功能连接的TNF受体多肽的细胞外结构域，所述方法包括：
(i)提供重组宿主细胞，其包含能够表达编码本发明的嵌合融合多肽的多核苷酸的载体；
(ii)在适合表达所述多肽的条件下培养该宿主细胞，以及
(iii)回收该嵌合融合多肽。
在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在某些实施方案中，所述载体为本发明上述的载体。在某些实施方案中，所述多核苷酸为本发明上述的多核苷酸。
根据本发明的又一方面，提供了本发明前述任一方面的嵌合融合多肽，或本发明前述任一方面的药物组合物，或本发明前述任一方面的核酸或包含所述核酸的载体，供用于治疗或预防犬的炎性介导的病症。
本发明的又一方面提供了本发明前述任一方面的嵌合融合多肽，或本发明前述任一方面的药物组合物，或本发明前述任一方面的核酸或包含所述核酸的载体，供用于治疗犬的关节炎，特别是免疫介导的多发性关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎或强直性脊椎炎。
本发明的又一方面提供了本发明前述任一方面的嵌合融合多肽，或本发明前述任一方面的药物组合物，或本发明前述任一方面的核酸或包含所述核酸的载体，在制备用于治疗或预防犬的慢性炎性病症的药物中的用途。
本发明的又一方面提供了本发明前述任一方面的嵌合融合多肽，或本发明前述任一方面的药物组合物，或本发明前述任一方面的核酸或包含所述核酸的载体，在制备用于治疗、抑制、改善或预防犬的风湿性关节炎或骨关节炎的药物中的用途。
在又一方面，提供了产生本发明的嵌合融合多肽的细胞系或其衍生细胞或后代细胞。
本发明的又一方面提供了用于治疗犬的慢性炎性病症，或者用于治 疗与疼痛相关的病症，或者用于治疗、改善或抑制犬中的与骨关节炎或风湿性关节炎相关的疼痛的试剂盒，所述试剂盒包含本发明前述任一方面的嵌合融合多肽，及其使用说明。
在各种其他方面，本发明延及用于纯化本发明的某些嵌合融合多肽的方法。特别是，本发明人已意外地确认，包含犬来源的B型或C型免疫球蛋白重链结构域比A型或D型的纯化得更有效。因此，本发明的嵌合融合多肽的纯化在免疫球蛋白重链结构域为B型或C型时提供较高产率。这有重要意义，因为基于蛋白A基质(matrices)的蛋白质纯化常用于获得用于治疗用途的商业上相关产率的蛋白质。因此，在免疫球蛋白重链结构域为B型或C型时，尤其是免疫球蛋白重链结构域为B型时，使用蛋白A纯化来纯化本发明的嵌合融合多肽提供了较高产率。这一特征结合当施用于犬时观察到所得的纯化蛋白不会募集补体或者介导下游效应子功能这一完全出人意料的现象，提供了可以治疗目的有利地施用于犬的本发明的组合物，特别是提供了相比人源多肽组成的嵌合融合多肽而言出人意料地有利的蛋白治疗剂。
因此，本发明的又一方面提供了用于纯化本发明的嵌合融合多肽、特别是具有B型免疫球蛋白重链的嵌合融合多肽的方法，包括使用蛋白A纯化所述嵌合融合多肽的步骤。在某些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为5。
本发明的又一方面提供了用于纯化本发明的嵌合融合多肽、特别是具有C型免疫球蛋白重链的嵌合融合多肽的方法，包括使用蛋白G纯化所述嵌合融合多肽的步骤。
本发明的又一方面提供了通过在最佳pH下从蛋白A柱洗脱从由CHO细胞表达形成的较高分子量的多聚体选择性纯化本发明的优选二聚体形式的嵌合融合多肽，特别是具有B型免疫球蛋白重链的嵌合融合多肽。
因此，本发明的又一方面提供了纯化本发明的嵌合融合多肽、特别是具有B型免疫球蛋白重链的嵌合融合多肽的方法，该方法包括在pH大于4.7下洗脱所述嵌合融合多肽的步骤。通常，pH为4.7-5.3，更典型地为4.8-5.2，更典型地为4.9-5.1，且最典型地，pH为5.0。通常，所述嵌合融 合多肽通过CHO细胞表达形成。通常，所述嵌合融合多肽从蛋白A，例如蛋白A柱洗脱，洗脱缓冲液的pH为5。
在某些实施方案中，所述嵌合融合多肽包含SEQ ID NO:7或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，所述嵌合融合多肽包含SEQ ID NO:11或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，所述嵌合融合多肽包含SEQ ID NO:16或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列。在某些实施方案中，所述嵌合融合多肽包含SEQ ID NO:20或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的多肽序列。
可应用上述方法作为通过蛋白A层析纯化的标准方法的改进，以从聚集形式的TNFR-Fc融合蛋白纯化出所需的TNFR-Fc融合蛋白二聚体。这有利地产生具有较高特定活性和纯度的产物，此外，去除聚集体降低了免疫原性的可能性。免疫球蛋白的蛋白A纯化的标准流程为在中性pH下结合，并在pH 3下洗脱。
在某些实施方案中，该方法包括在pH为4.5-4.7下洗脱较高分子量的多聚体的步骤。
本发明的另一方面提供了使用本发明的上述方法纯化的嵌合融合多肽及其作为药物在例如本发明的上述治疗方法中的用途。
附图说明
图1示出了犬TNF受体(TNFR)p60细胞外结构域(ECD)片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2示出了犬IgG1免疫球蛋白A型(caHCA)的Fc结构域从铰链区至C末端的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3示出了犬IgG1免疫球蛋白B型(caHCB)的Fc结构域从铰链区至C末端的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4示出了犬IgG1免疫球蛋白C型(caHCC)的Fc结构域从铰链区至C 末端的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5示出了犬IgG1免疫球蛋白D型(caHCD)的Fc结构域从铰链区至C端的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6示出了SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:2的犬IgG HCA Fc结构域的嵌合融合多肽。
图7示出了SEQ ID NO:7的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:3的犬IgG HCB Fc结构域的嵌合融合多肽。
图8示出了SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:4的犬IgG HCC Fc结构域的嵌合融合多肽。
图9示出了SEQ ID NO:9的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:5的犬IgG HCD Fc结构域的嵌合融合多肽。
图10示出了SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:2的非糖基化版本的犬IgG HCA Fc结构域的嵌合融合多肽。
图11示出了SEQ ID NO:11的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:3的非糖基化版本的犬IgG HCB Fc结构域的嵌合融合多肽。
图12示出了SEQ ID NO:12的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:4的非糖基化版本的犬IgG HCC Fc结构域的嵌合融合多肽。
图13示出了SEQ ID NO:13的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:1的犬TNFR序列和SEQ ID NO:5的非糖基化版本的犬IgG HCD Fc结构域的嵌合融合多肽。
图14示出了犬TNF受体(TNFR)p80细胞外结构域(ECD)片段的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。
图15示出了SEQ ID NO:15的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:2的犬IgG HCA Fc结构域的嵌合融合多肽。
图16示出了SEQ ID NO:16的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的 犬TNFR序列和SEQ ID NO:3的犬IgG HCB Fc结构域的嵌合融合多肽。
图17示出了SEQ ID NO:17的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:4的犬IgG HCC Fc结构域的嵌合融合多肽。
图18示出了SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:5的犬IgG HCD Fc结构域的嵌合融合多肽。
图19示出了SEQ ID NO:19的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:2的非糖基化版本的犬IgG HCA Fc结构域的嵌合融合多肽。
图20示出了SEQ ID NO:20的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:3的非糖基化版本的犬IgG HCB Fc结构域的嵌合融合多肽。
图21示出了SEQ ID NO:21的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:4的非糖基化版本的犬IgG HCC Fc结构域的嵌合融合多肽。
图22示出了SEQ ID NO:22的氨基酸序列，其为包含SEQ ID NO:14的犬TNFR序列和SEQ ID NO:5的非糖基化版本的犬IgG HCD Fc结构域的嵌合融合多肽。
图23显示了使用二级抗犬IgG多克隆抗体-HRP缀合物检测的表达的犬TNFT-Fc融合蛋白上清液的犬TNF的结合的ELISA结果。用编码SEQ ID NO:6(HCA)、SEQ ID NO:7(HCB)、SEQ ID NO:8(HCC)和SEQ ID NO:9(HCD)的表达质粒转染CHO细胞，产生所测试的各种上清液，将其和与SEQ ID NO:7类似的融合物中在N端与犬HCB铰链-CH2-CH3融合的等价的人TNFR-Fc细胞外结构域进行比较。
图24示出了在串联蛋白A和蛋白G琼脂糖凝胶柱上亲和捕获后，纯化的犬TNFR-Fc融合蛋白的结合的ELISA结果。从该图可见，HCB和HCC形式的犬TNF受体融合蛋白被蛋白A或蛋白G有效地捕获，而HCA和HCD形式的融合蛋白捕获不佳。进一步的分析(未示出)证明，犬TNFR-HCB被蛋白A有效捕获，而HCC形式被蛋白G捕获。
图25示出了串联蛋白A和蛋白G亲和层析的产物的非还原性SDSPAGE凝胶法的结果，证实了犬TNFR融合蛋白的HCA(SEQ ID NO:6)和HCD(SEQ ID NO:9)同种型的回收不佳。
图26和27显示了使用NFkB-EGFP报告子构建体pTRH1(Vince et al,Cell131,682,2007)转染的293-HEK细胞抑制犬TNF-α(R&D systems,1ng/ml)生物活性的结果。这些细胞通过荧光响应犬TNF。犬TNFR融合蛋白的犬TNFR-HCB(SEQ ID NO:7)(图26)和犬TNFR-HCC(SEQ ID NO:8)(图27)同种型抑制TNF诱导的荧光，同样地，人TNFR-犬HCB对照融合蛋白也如此(在图27中量化)。用于该测试的IC50为1ng/ml。
图28示出补体C1q结合的ELISA结果。用预涂覆犬TNF(4μg/ml)的平板孵育犬TNFR-HCB、犬TNFR-HCC和人TNFR-犬HCB融合蛋白。为进行比较，用涂覆有神经生长因子(NGF)的平板孵育对NGF具有特异性的犬源化单克隆抗体(MAb，犬同种型HCB)。冲洗平板，并用作为补体来源的正常的或加热灭活的人血清来孵育该平板。使用C1q反应性多克隆抗体-HRP缀合物检测补体C1q的结合。从结果可以看出，尽管犬HCB MAb能够募集补体，但令人惊讶的是，无论是犬或人TNFR-HCB融合蛋白，还是犬TNFR-HCC融合蛋白均不能募集补体(在其他实验中，抗NGF单克隆抗体的HCC同种型结合C1q；数据未示出)。
图29示出了通过在pH5下选择性洗脱，将犬TNFR-HCB(SEQ ID NO:7)多肽融合蛋白二聚体从该融合蛋白的较高分子量聚集体中优化纯化的结果。
图30示出了新的犬TNFR p80细胞外结构域氨基酸序列(SEQ ID NO:14)的衍生。
发明详述
本发明人提供了用于治疗和预防犬的TNF介导的病症的组合物与方法。特别是，本发明的组合物和方法用于全身或在特定解剖位置降低TNF的水平。
特别是，本文已证明，尽管犬免疫球蛋白重链恒定结构域的补体募集品种与犬TNF受体细胞外结构域融合，本发明所得的嵌合融合多肽也以高特异性结合犬TNF，并且还不募集补体C1q。此外，通过抑制犬TNF与细胞膜表达的TNF受体的结合，结合阻隔了犬TNF的生物活性。这进而会防止或降低犬中TNF介导的炎性介导的疾病如关节炎的诱导、发展、进行的发生，而没有通过诱导补体级联伴随的损伤。
本发明的受体融合蛋白使用重组DNA方法产生，并且当施用于犬宿主时，显示出对犬TNF的结合特异性，同时还具有降低其免疫原性的犬恒定结构域序列。结果，使异种抗体诱导的风险最小化。
本发明提供了重组融合蛋白，其包含与犬IgG免疫球蛋白同种型的Fc结构域结合的犬TNF受体p60(caTNFRp60)的细胞外结构域。本发明还延及重组融合蛋白，其包含与犬IgG免疫球蛋白同种型的Fc结构域结合的犬TNF受体p80(caTNFRp80)的细胞外结构域。所得二聚多肽是嵌合Fc融合蛋白。本发明人已证明，caTNFRp60:Fc融合蛋白具有犬TNF结合特异性，并用作TNF拮抗剂。TNF拮抗剂的使用已显示出逆转TNF介导的炎性疾病的发展以及其他TNF介导的病症的效果。
本发明的融合蛋白组合物通常是外源给药，例如通过静脉内给药或皮下给药。然而，在某些实施方案中，载体可用于递送编码本发明的嵌合融合多肽的多核苷酸。因此，本发明提供了用于有效且连续治疗TNF介导的炎性疾病和其他TNF相关病症和紊乱的方法。
经过大量实验，本发明人已获得与人TNF受体细胞外结构域相似的犬蛋白序列(登录号AAD01516,Campbell,et al.2001,Vet Immuno Immunopath78,207-214)，人TNF受体是以前未知具有犬TNF结合特异性的受体，并且本发明人出人意料地使用所述犬蛋白序列作为基础产生拮抗性受体-免疫球蛋白融合蛋白(融合多肽)，该融合蛋白特异性结合犬TNF-α，并且仍不会募集补体C1q。
所得的非免疫原性受体融合蛋白经证明表现对犬TNF的高亲和性结合。最具体地，受体融合蛋白通过抑制TNF与细胞膜相关受体TNFR1结 合，中和犬的TNF生物功能。此外，融合蛋白也已设计成使恒定区仅包括存在于犬IgG分子的残基，从而在施用于犬时，不会产生针对它们的异种抗体。因此，本发明的犬源化受体融合蛋白适合长期施用，以治疗犬的慢性炎性疾病。
本发明人在第一时间出人意料地通过将NCBI基因组参考克隆XP_544562.2的预测的羧基端残基(本发明人已鉴定为其包括犬p80的错误的预测信号序列和氨基端残基)与部分犬cDNA克隆DN368636的正确信号序列和氨基端残基结合，鉴别出作为整体的完整的犬p80TNF受体细胞外结构域。这个新的犬p80细胞外结构域序列(图30)在本文中显示为SEQ ID NO:14。结果，可以合成正确的完整犬p80细胞外结构域，其适当的氨基端残基是完整无损的，并因此，当施用于犬个体时，不会具有免疫原性。通过比较，来自克隆XP_544562.2的序列会产生外来的免疫原性氨基端，当施用于犬时，会产生针对该氨基端的中和抗体。同样，使用本文确认的正确的p80氨基端氨基酸序列(本文的SEQ ID NO:15-22)可提供犬TNF受体p80-免疫球蛋白Fc结构域融合蛋白。
本发明人所采用的产生本发明的受体融合蛋白的方法呈现了受体细胞外结构域，基于发明人的分析，所述受体细胞外结构域将保持受体的构型，因此，保持结合特异性和亲和力，并将受体尺寸提高到大于在肾脏中被排除的尺寸，同时降低了免疫原性表位的存在，如果其以非变化形式施用于犬时，所述免疫原性表位可能会导致针对受体产生的中和抗体(特别是异种抗体)。
另外，融合蛋白的Fc结构域组分包含从犬源抗体获得的IgG免疫球蛋白重链恒定区，犬是施用本发明的融合蛋白的靶物种。选择或者修饰免疫球蛋白重链恒定结构域，使其不介导下游效应子功能。而且，在以不影响受体结构域的三维构造的方式进行受体细胞外结构域与免疫球蛋白重链恒定结构域的融合时，对期望的靶标的结合特异性将不会改变。
在人类和小鼠中存在四种主要的IgG同种型，虽然术语是类似的，但它们在行为和功能上是不同的，包括对细菌产物例如蛋白Α和蛋白G的亲 和性，激活补体依赖性细胞溶解(CDC)的能力以及通过抗体依赖性细胞毒性(ΑDCC)诱导杀死靶细胞的能力。当将抗体设计为清除携带它们的同源抗原的靶细胞时，具有CDC和ΑDCC活性或“防护的”恒定结构域IgG同种型的选择在临床上被认为是有益的，例如在肿瘤学或感染控制方面(例如，为了上述目的，在人类医学应用中优选人IgG1同种型)。相比之下，在其他情况中，例如缓解炎症、疼痛或自身免疫中，激活免疫系统被认为是不可取的，因此优选具有最小CDC和ΑDCC活性的人IgG同种型(例如，在这种人类医学应用中，常常优选IgG4同种型)。已经描述了犬免疫系统中的四个不同的免疫球蛋白γ(IgG)重链恒定结构域同种型(美国专利号5852183，Tang L.et al.2001.Veterinary Immunology and Immunopathology,80.259-270)以及单个κ和λ恒定结构域序列。并没有按照由其介导的免疫系统功能活性来表征四种犬重链恒定结构域Α、B、C和D。不管与IgG家族的总体同源性如何，与来自其它物种的家族成员相比，编码犬IgG的蛋白彼此更相关，因此如果将任一种认为是四种犬同种型的每一种，那么仅通过同源性来限定是上述哪种功能是不可能的。然而，本发明人出人意料地鉴别出犬IgG亚型B和C不介导下游效应子功能，特别是补体结合，并且因此，在本发明的嵌合融合多肽中，衍生自犬IgG亚型B和C的多肽片段是优选的。
在某些实施方案中，所产生的受体融合蛋白包含糖基化模式(pattern)已改变的Fc结构域组分。在某些实施方案中，可以改变本发明的TNF受体-Fc融合蛋白，以提高或降低Fc部分糖基化的程度。多肽的糖基化通常是N连接或O连接。N连接指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任一氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列任意一个的存在均产生了潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但是还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
在某些其他实施方案中，通过将本发明的抗犬TNF受体融合蛋白与聚乙二醇(PEG)衍生物反应使其聚乙二醇化(PEGylated)。在某些实施方案中，所述受体融合蛋白是去海藻糖基的(defucosylated)，因此其缺乏海藻糖残基。
在某些实施方案中，可以通过选择影响以下方面的取代来完成对蛋白生物学特性的修饰：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如片层或螺旋构象；(b)靶位点的分子的电荷或疏水性；或者(c)侧链的体积。根据其侧链性质的相似性可以将氨基酸分组(Α.L.Lehninger,in Biochemistry,2nd Ed.,73-75,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非极性的：Ala(A)、VaI(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)无电荷极性的：GIy(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性的：Asp(D)、GIu(E)；和(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，基于侧链的共有性质，可将天然存在的残基分组：(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Αla、VaI、Leu、Ile；(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Αsn、GIn；(3)酸性的：Αsp、GIu；(4)碱性的：His、Lys、Αrg；(5)影响链方向的残基：GIy、Pro；(6)芳香的：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将使得这些类之一的成员取代为另一类。还可以将这类取代的残基引入到保守取代位点或者引入到剩余的(例如，非保守的)位点。
可以完全或部分地通过化学合成产生本发明的受体融合蛋白和结合成员。例如，可以通过本领域技术人员熟知的技术来制备本发明的犬TNF受体融合蛋白和结合成员，例如标准液相肽合成或固相肽合成方法。可选地，可以使用液相肽合成技术或者进一步通过固相、液相和溶液化学的组合在溶液中制备融合蛋白。
本发明进一步延及通过在合适的表达系统中表达编码所述嵌合融合多肽或其组分的多核苷酸来产生本发明的受体融合蛋白或结合成员。
熟练技术人员可以利用本领域技术人员熟知的技术容易地制备编码本发明的受体融合蛋白的核酸序列，例如Sambrook et al.“Molecular Cloning”,A laboratory manual(分子克隆:实验室手册),cold Spring Harbor  Laboratory Press,Volumes 1-3,2001(ISBN-0879695773)，和Ausubel et al.Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的小方法).John Wiley and Sons,4th Edition,1999(ISBN–0471250929)中所描述的方法。
可以以包含至少一种核酸的质粒、载体、转录盒或表达盒形式的构建体，提供编码本发明的受体融合蛋白的核酸序列。构建体可以包含在包含一个或多个构建体的重组宿主细胞内。可以通过在合适的条件下培养含有合适的核酸序列的重组宿主细胞来便利地实现表达。表达后，可以使用任何合适的技术将受体融合蛋白或受体融合蛋白片段分离和/或纯化，然后视情况使用。
用于在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、昆虫和杆状病毒系统。本领域用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、海拉细胞(HeLa cell)、仓鼠崽肾细胞和NS0小鼠骨髓瘤细胞。常用的优选细菌宿主是大肠杆菌(E.coli.)。在本领域中已完全建立了在原核细胞例如E.coli.中表达受体融合蛋白和受体融合蛋白片段。作为产生多肽的选项，在培养的真核细胞中表达对本领域技术人员而言也是可用的。
本发明的受体融合蛋白通过重组方式不但可以直接产生而且可以作为与异源多肽融合的多肽产生，异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特异性切割位点的其他多肽。所选的异源信号序列优选为可被宿主细胞识别和加工的(即被信号肽酶切割的)序列。对于不识别和加工天然受体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp(复合天然氨基酸)和热稳定肠毒素II前导序列(heat-stable enterotoxin II leaders)的原核信号序列取代。
提及本发明的受体融合蛋白或者由其衍生的结合成员或编码其的多核苷酸时，所用的术语“分离的”是指所述受体融合蛋白或多核苷酸以分离形式和/或纯化形式提供的状态，也就是说将它们从其天然环境中隔离、分离或纯化，并且它们以基本纯或均质的形式提供，或者在核酸的情况下，以没有或基本上没有除编码具有所需功能的多肽的序列外的起 源的核酸或基因的方式提供。因此，这类分离的受体融合蛋白和分离的核酸将没有或基本上没有与其天然联系的材料，例如当这种制备是在体外或体内通过重组DNΑ技术实施时，在它们的天然环境或制备环境(例如细胞培养物)中发现的其他多肽或核酸。
受体融合蛋白与核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且出于实际目的，其仍视为以分离的形式提供。例如，如果用于在免疫测定中涂覆微量滴定板，可以将受体融合蛋白与明胶或其他载体混合，或者当用于诊断或治疗时，将其与药学上可接受的载体或稀释剂混合。可以天然地或通过异源真核细胞(例如CHO或NSO细胞)系统使受体融合蛋白糖基化，或者受体融合蛋白可以是非糖基化的(例如，如果通过在原核细胞中表达来产生时)。
包含抗犬TNF受体融合蛋白分子的异源制剂也构成本发明的一部分。例如，这种制剂可以是受体融合蛋白与具有缺少C端赖氨酸的、具有不同糖基化程度和/或具有衍生氨基酸(例如N端谷氨酸环化以形成焦谷氨酸残基)的受体融合蛋白的混合物。
通常可以将本发明的药物组合物配制成液体制剂、冻干制剂，可以作为液体或气雾制剂重构的冻干制剂。在某些实施方案中，制剂中受体融合蛋白的浓度为约0.5mg/ml至约250mg/ml，约0.5mg/ml至约45mg/ml，约0.5mg/ml至约100mg/ml，约100mg/ml至约200mg/ml，或者约50mg/ml至约250mg/ml。
在某些实施方案中，制剂还包含缓冲剂。通常，制剂的pH为约pH5.5至约pH6.5。在某些实施方案中，缓冲剂可以包含约4mM至约60mM的组氨酸缓冲剂，约5mM至约25mM的琥珀酸盐缓冲剂，或者约5mM至25mM的醋酸盐缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂包含浓度为约10mM至300mM、通常约125mM的氯化钠，和浓度为约5mM至50mM、通常约25mM的柠檬酸钠。在某些实施方案中，制剂还可以包含浓度仅为大于0％至约0.2％的表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自下组，但不限于：聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇 酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85及其组合。在优选的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯-20，并且可以进一步包含浓度约为125mM的氯化钠和浓度约为25mM的柠檬酸钠。
本发明的受体融合蛋白可以单独施用，但是优选作为药物组合物施用，所述药物组合物通常将包含根据既定给药途径选择的合适的药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药用载体的实例包括水、甘油、乙醇等。
可以将本发明的受体融合蛋白或结合成员从外部或通过任何其他合适的途径施用于需要治疗的犬。通常，可以将组合物通过注射或输注以非肠道的方式施用。用于非肠道给药的优选途径的实例包括但不限于：静脉给药、腹腔给药、肌内给药、皮下给药或跨粘膜给药。给药途径还可以包括局部给药和肠内给药，例如粘膜(包括肺粘膜)给药、口服给药、鼻部给药或直肠给药。
在组合物作为可注射组合物递送的实施方案中，例如静脉内、皮肤内或皮下的应用中，活性成分可以是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性的非肠道可接受的水溶液形式。本领域相关技术人员完全能使用例如等渗媒介如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer’s injection)或乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer’s injection)制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。还可以通过微球、脂质体、其他微粒物递送系统或置于某些组织包括血液中的缓释剂来施用组合物。
以上提及的技术和方案(protocol)以及对于本发明可以使用的其他技术和方案的实例可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(霍明顿药物学，第18版,Gennaro,Α.R.,Lippincott Williams&Wilkins)、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型和药物递送系统，第20版ISBN0-912734-04-3)和Αnsel,H.C.et al.(第7版ISBN 0-683305-72-7)中找到。
通常以“治疗有效量”将本发明的受体融合蛋白和组合物施用于个 体，该治疗有效量是对施用了该组合物的个体足以显示益处的量。施用的实际剂量、给药频率(rate)和时间进程应取决于以下因素，并适当参考以下因素来确定：被治疗的病症的性质和严重性，和被治疗的个体的诸如年龄、性别和体重的因素以及给药途径。应当进一步适当考虑组合物的性质，例如结合活性和体内血浆寿命、制剂中受体融合蛋白或结合成员的浓度，以及递送的途径、位置和频率。
剂量给药方案可以包括本发明的受体融合蛋白或组合物的单一给药，或者受体融合蛋白或组合物的多剂量给药。受体融合蛋白或含有受体融合蛋白的组合物可以进一步与其他抗炎组合物或TNF拮抗剂组合物序贯给药、同时给药或单独给药。
可以施用于个体的剂量给药方案的实例选自但不限于：1μg/kg/天至20mg/kg/天、1μg/kg/天至10mg/kg/天和10μg/kg/天至1mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量使得获得的抗体血浆浓度为1μg/ml至100μg/ml。然而，所施用的组合物的实际剂量、给药频率和时间进程应取决于被治疗的病症的性质和严重性。治疗的药方例如剂量决定等最终属于兽医从业人员和其他兽医的责任与判定内，通常考虑待治疗的病症、各个患者的病症、递送位置、给药方法和从业人员已知的其他因素。
定义
除非另有限定，本文使用的所有技术术语和科学术语都具有本发明的领域内本领域技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清楚，然而，在发生任何歧义的情况下，本文给出的定义优先于任何字典或外在的定义。
在全文中，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”或“包括(include)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”、“包括(includes)”或“包括(including)”应理解为表示包含所述整数或整数组，但并不排除任何其他的整数或整数组。
如本文所使用的，除非文中明确要求，诸如“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”的术语包括单数或复数情况。因此，例如，提到“一种活性 剂(an active agent)”或“一种药学活性剂”包括单一的活性剂和两种或以上不同的活性剂组合，而提到“载体”，其包括两种或以上载体的混合物以及单一载体等。而且，除非文中另有要求，单数的术语包括复数并且复数的术语应包括单数。
通常，本发明的嵌合融合多肽是中和受体融合蛋白。如本文所限定的，术语“中和受体融合蛋白”描述了能够中和TNF的生物活性和信号传导的受体融合蛋白。中和受体融合蛋白也可以称为TNF拮抗剂融合蛋白、拮抗性受体融合蛋白或阻断受体融合蛋白，其特异性且优选选择性地结合TNF，并抑制TNF的一种或多种生物活性。例如，中和受体融合蛋白可以抑制TNF与其靶受体的结合，例如结合细胞膜的TNF受体1(TNFR1)受体(CD120α)。
本文所用术语“生物活性”指分子的任何一种或多种固有的生物学特性(无论是体内发现天然存在的还是通过重组方法给予或激活的)。生物学特性包括但不限于受体结合和/或激活、诱导细胞信号传导或细胞增殖、抑制细胞生长、诱导细胞因子产生、诱导细胞凋亡和酶活性。
如本文所使用的，术语“恒定区(CR)”指抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，恒定区通常指犬的恒定区，也就是说，指恒定区来自犬的免疫球蛋白。
本文所用的术语“免疫原性”指当施用于接受者时对蛋白或治疗部分引起免疫反应(体液反应或细胞反应)的能力的衡量。优选本发明的嵌合融合多肽不具有免疫原性，也就是说，当施用于犬时，将不会产生针对它们的异种抗体。
本文所用的术语“同一性”或“序列同一性”或“同源性”指，在比对的序列的任何特定的氨基酸残基位置处，氨基酸残基在比对的序列间是相同的。本文所用的术语“相似性”或“序列相似性”表示，在比对的序列的任何特定的位置，氨基酸残基在序列之间具有相似的类型。例如，亮氨酸可以被异亮氨酸或缬氨酸残基取代。这可以被称为保守取代。优选地，当本发明的氨基酸序列通过其中包含的任何氨基酸残基的 保守取代来修饰时，与未修饰的受体融合蛋白相比，这些变化对所产生的受体融合蛋白的结合特异性或功能活性没有影响。
关于本发明的(天然)多肽及其功能衍生物的序列同一性涉及，在比对序列并且在必要时引入缺口以实现最大百分比同源性且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与对应的天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。不管是N端或C端的延长，还是插入，都不应该解释为降低序列同一性或同源性。用于实施两条或以上氨基酸序列的比对和用于确定它们的序列同一性或同源性的方法和计算机程序，是本领域技术人员熟知的。例如，使用算法例如BLΑST(Αltschul et al.1990)、FΑSTΑ(Pearson&Lipman 1988)或Smith-Waterman algorithm(史密斯-沃特曼算法，Smith&Waterman 1981)可以容易地计算两条氨基酸序列的同一性或相似性的百分比。本发明延及与本文所鉴定的序列具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或序列同源性的序列，并延及其在本发明所述方法中的用途。
本文所用的术语“基本组成为(consists essentially of)”或“基本组成为(consisting essentially of)”表示，多肽可以具有除所描述的以外的其他特征或元素，条件是这样的额外特征或元素并不会实质性地影响受体融合蛋白或受体融合蛋白片段具有特异性结合犬TNF的能力。也就是说，包含多肽的受体融合蛋白或受体融合蛋白片段可以具有不干扰受体融合蛋白或受体融合蛋白片段结合犬TNF的能力和不抵消犬TNF功能活性的能力的其他特征或元素。可以将这样的修饰引入氨基酸序列中，从而降低受体融合蛋白的免疫原性。例如，基本上由特定序列组成的多肽在该序列的一端或两端可含有一个、两个、三个、四个、五个或更多个添加、缺失或取代的氨基酸，条件是这些氨基酸并不干扰、抑制、阻断或中断受体融合蛋白或片段结合犬TNF和隔离其生物功能的作用。同样，有助于本发明的犬TNF拮抗性受体融合蛋白的多肽分子可以被一个或多个官能团进行化学修饰，条件是这类官能团不干扰受体融合蛋白或受体融合蛋白片段结合犬TNF并抵消其功能的能力。
本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”指抑制犬TNF结合TNFR1受体所需的本发明的融合蛋白的量，和/或足以引起有益或期望的临床结果的本发明的嵌合融合多肽的量。有效量可以以一次或多次给药来施用。出于本发明的目的，“有效量”是实现以下的至少一方面的量：降低TNF水平、降低炎性反应或者降低、预防或改善TNF介导的疾病或病症。
本文所用的术语“嵌合多肽”、“融合多肽”、“融合蛋白”或“二聚体多肽”，是包含衍生自不同蛋白的至少两个结构域的多肽。通常由于p60犬TNF受体(p60TNFR)或p80犬TNF受体(p80TNFR)的细胞外结构域或其片段与衍生自犬IgG免疫球蛋白重链恒定区的全部或部分Fc结构域的结合所致，这些结构域集合于嵌合蛋白、二聚体蛋白或融合蛋白中，从而形成新的蛋白。
本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”或“蛋白”表示通过相邻残基的α氨基和羧基之间的肽键相互连接的一系列线性氨基酸残基。氨基酸残基通常是天然的“L”同分异构形式。然而，只要通过多肽保留期望的功能特性，“D”同分异构形式的残基也可以用来取代任何L-氨基酸残基。
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指核苷酸的任意长度的聚合形式。术语多核苷酸也可互换地指双链和单链分子。
如本文所限定的，“犬”还可以指“狗”。犬可以被归类为属于学名为家犬(Canis familiaris domesticus)或澳洲野犬(Canis lupus dingo)的亚种。犬包括任何种类的狗，并且包括野生品种和宠物品种，宠物品种还被称为伴侣动物。
短语“特异性结合”指抗体或蛋白与存在于异源蛋白群中的特定蛋白或靶的结合。因此，当存在于特定免疫测定条件时，蛋白结合特定蛋白(在该情况下是犬TNF)，并且不会大量结合样品中存在的其他蛋白。
如本文所限定的，术语“异种抗体”指由宿主产生的针对对宿主而言是外来的表位的抗体。
现将参考以下实施例描述本发明，所提供的实施例用于说明的目的， 并非意图视为限制本发明。除非另有指明，通常根据本领域熟知的常规方法和本发明引用和讨论的各种一般文献和更详细的参考文献中所描述的方法来实施本发明的方法和技术。
实施例
实施例1-编码抗犬TNF受体融合蛋白的DNA的表达
进行ELISA以测定使用二级抗犬IgG多克隆抗体-HRP缀合物检测的表达的犬TNFT-Fc融合蛋白上清液对犬TNF的结合。结果示于图23中。
用编码SEQ ID NO:6(HCA(caTNFRp50:ca IgGHCA Fc))、SEQ ID NO:7(HCB(caTNFRp50:ca IgGHCB Fc))、SEQ ID NO:8(HCC(caTNFRp50:ca IgGHCC Fc))和SEQ ID NO:9(HCD(caTNFRp50:ca IgGHCD Fc))的表达质粒转染CHO细胞，产生所测试的各种上清液，将其与包含人TNFR细胞外结构域的等价的人TNFR-Fc进行对比，所述人TNFR细胞外结构域在与SEQ ID NO:7类似的融合物中在N末端与犬HCB铰链-CH2-CH3融合。
图24示出了在串联蛋白A和蛋白G琼脂糖凝胶柱上亲和捕获后，纯化的犬TNFR-Fc融合蛋白的结合的ELISA结果。从该图可以看出，HCB和HCC形式的犬TNF受体融合蛋白被蛋白A或蛋白G有效捕获，而HCA和HCD形式的融合蛋白捕获不佳。进一步的分析(未示出)证明，犬TNFR-HCB被蛋白A有效捕获，而犬TNFR-HCC形式能够被蛋白G捕获。
图25示出了串联蛋白A和蛋白G亲和层析的产物的非还原性SDS-PAGE凝胶法的结果，证实了犬TNFR融合蛋白的HCA(SEQ ID NO:6)和HCD(SEQ ID NO:9)同种型的回收不佳。
实施例2-犬TNF活性的抑制
该实验评价了本发明的融合多肽是否可用作TNF生物活性的拮抗剂。图26和27显示了使用NF-kB-EGFP报告子构建体pTRH1(Vince et al.,Cell131,682,2007)转染的293-HEK细胞抑制犬TNF-α(R&D systems,1ng/ml)生物活性的结果。这些细胞通过荧光响应犬TNF。犬TNFR融合蛋 白的犬TNFR-HCB(SEQ ID NO:7)(图26)和犬TNFR-HCC(SEQ ID NO:8)(图27)同种型都抑制TNF诱导的荧光，同样地，人TNFR-犬HCB对照融合蛋白也如此(在图27中量化)。用于该测试的IC50为约1 ng/ml。
实施例3-TNF受体融合蛋白缺乏补体活性
图28示出补体C1q结合的ELISA的结果。用预涂覆犬TNF(4μg/ml)的平板孵育犬TNFR-HCB、犬TNFR-HCC和人TNFR-犬HCB融合蛋白。为进行比较，用涂覆有神经生长因子(NGF)的平板孵育对NGF具有特异性的犬源化单克隆抗体(MAb，犬同种型HCB)。冲洗平板，并用作为补体来源的正常的或加热灭活的人血清来孵育该平板。使用C1q反应性多克隆抗体-HRP缀合物检测补体C1q的结合。从结果可以看出，尽管犬HCB单克隆抗体能够募集补体，但令人惊讶的是，无论完全的犬TNFR-犬HCB融合蛋白或嵌合的人TNFR-HCB融合蛋白还是犬TNFR-HCC融合蛋白均不能募集补体(在其他实验中，抗NGF MAb的HCC同种型结合C1q；数据未示出)。
这些结果共同显示，经ELISΑ和抑制试验，本发明的犬TNF受体融合蛋白和人TNFR-犬Fc嵌合构建体结合犬TNF，且两者效果相当，这表明融合方法产生了完全活化的犬版本的TNF受体融合蛋白。
此外，这些结果显示，通过简单地将任何犬IgG重链恒定结构域与犬TNFR细胞外结构域融合无法实现通过蛋白A和蛋白G的纯化，因为，出乎意料的是，犬IgG HCA和HCD恒定结构域均不能给予结合这些有益的纯化材料的能力。因此，HCB和HCC IgG恒定结构域是用于制备TNFR-Fc融合蛋白(或任何其他的犬受体Fc融合蛋白)的所需的融合伴侣(partner)，所述融合伴侣可以有效地大规模纯化，供在兽医临床上用于治疗狗的疾病。
图28显示，出人意料地，犬TNF受体融合蛋白的HCB和HCC同种型的设计导致缺少募集补体的能力。因此，犬TNF受体融合蛋白显示了出人意料的组合，即对犬TNF的强烈结合与令人期望的缺少补体募集对TNF炎性活性位点损害的组合，所述强烈结合相当于人TNF受体与犬TNF结 合。因此，本发明的犬TNF受体融合蛋白出乎意料可用于治疗由犬TNF介导的犬疾病。
图29示出了通过在pH5下选择性洗脱，将犬TNFR-HCB(SEQ ID NO:7)多肽融合蛋白二聚体从该融合蛋白的较高分子量聚集体中优化纯化的结果。免疫球蛋白的蛋白A纯化的标准流程为在中性pH下结合，并在pH3下洗脱。按该方法可以捕获并洗脱犬TNFR-HCB融合蛋白(SEQ ID NO:7)，但大部分的CHO细胞产物是高分子量的聚集体形式(图29B，第1泳道；还有图25，HCB泳道，在图的顶部仅仅进入凝胶)。这种聚集体可以是免疫原性的，并且需要将其除去。令人意外的是，通过将洗脱缓冲液的pH变为较高pH，可以将高分子量的聚集体从优选的二聚体形式的犬TNFR-HCB融合蛋白中纯化。在图29A中，通过表达SEQ ID NO:7在CHO细胞中产生的犬TNFR-HCB蛋白在pH7下结合蛋白A柱，然后用pH 5的缓冲液洗脱，从而特异性地洗脱犬TNFR-HCB融合蛋白二聚体。随后，在pH4.5-4.7下洗脱犬TNFR-HCB的较高分子量的聚集体。通过SDS-PAGE将所述级分与CHO细胞表达的TNFR-HCB蛋白进行比较(图29B)。通过标准pH3洗脱纯化的含有二聚体和较高分子量聚集体的原始TNFR-HCB制剂显示于第1泳道和第4泳道。根据本发明制备的含有纯化的二聚体的pH5洗出液(图29A中的从25-45mL的跑胶体积中收集)显示于第2泳道和第5泳道，而在较低pH下洗脱的聚集形式(图29A中的从50-60mL的跑胶体积中收集)显示于第3泳道和第6泳道。通过在还原条件下观察到的相同结合模式(pattern)，证实较高分子量聚集体是犬TNFR-HCB融合蛋白。通过第1泳道和第2泳道的比较，明显看出犬TNFR-HCB融合蛋白二聚体的纯度的提高。因此，本发明的新的pH5蛋白A洗脱条件可用于制备适合用作治疗剂的较高纯度的犬TNFR-HCB融合蛋白。
实施例4-新的犬TNFR p80细胞外结构域蛋白序列
图30示出了新的犬TNFR p80细胞外结构域氨基酸序列的衍生。通过与人p80细胞外结构域序列(P20333，其中加下划线的是信号序列)进行比较，犬TNFR p80的两个带注释的变体的衍生序列即克隆XP_544562.2和 DN368636被鉴定为不完整版本的TNFR p80，两者均不编码能够在哺乳动物细胞中表达的完整的犬TNFR p80细胞外结构域序列，克隆XP_544562.2(图30中直到跨膜结构域，显示为翻译的)是由于其缺少信号序列并失去N端序列VPG，而克隆DN368636是由于其缺少膜近端细胞外结构域序列和C端序列(TRRH)不正确。这两个序列的结合产生了新的用于犬TNFR p80ECD的序列，其显示为SEQ ID NO:14。
通过引用的方式将本文说明书中提及的所有文献并入本文中。在不背离本发明的范围的情况下，对本发明记载的实施方案进行各种修改和变化对本领域技术人员是显而易见的。虽然结合具体优选的实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，请求保护的本发明不应该不适当地限制为这些具体的实施方案。事实上，本发明意图涵盖对本领域技术人员显而易见的所记载的实施本发明的方式的各种修改。
序列表
SEQ ID NO:1(犬TNFR p60信号序列和ECD)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGST
SEQ ID NO:2(犬IgG HCA重链-铰链CH2、CH3)
FNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
SEQ ID NO:3(犬IgG HCB重链-铰链CH2、CH3)
PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHN HYTQESLSHSPGK
SEQ ID NO:4(犬IgG HCC重链-铰链CH2、CH3)
AKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK
SEQ ID NO:5(犬IgG HCD重链-铰链CH2、CH3)
PKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
SEQ ID NO:6(caTNFrecp60-HCA)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:7(caTNFrecp60-HCB)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
SEQ ID NO:8(caTNFrecp60-HCC)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
SEQ ID NO:9(caTNFrecp60-HCD)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:10(caTNFrecp60-非糖基化HCA)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFAGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:11(caTNFrecp60-非糖基化HCB)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCH AGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
SEQ ID NO:12(caTNFrecp60-非糖基化HCC)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSAGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
SEQ ID NO:13(caTNFrecp60-非糖基化HCD)
MGLPTVPGLLLPLVLLALLLEIYPISVTALVPHPRNRVKRAILCPQGKYIHPQDDSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGLDTDCRECENGTFTASENHLRQCLSCSKCRKEMNQVEISPCTVYRDTVCGCRKNQYRFYWSETLFQCNNCSLCLNGTVQISCQEKQNTICTCHAGFFLREHECVSCVNCKKNTECGKLCLPPVETVKVPQDPGSTPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFASTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:14(犬TNFR p80信号序列和ECD)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGD
SEQ ID NO:15(caTNFrecp80-HCA)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQM CCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:16(caTNFrecp80-HCB)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
SEQ ID NO:17(caTNFrecp80-HCC)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
SEQ ID NO:18(caTNFrecp80-HCD)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVET QACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:19(caTNFrecp80-非糖基化HCA)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFAGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK**
SEQ ID NO:20(caTNFrecp80-非糖基化HCB)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
SEQ ID NO:21(caTNFrecp80-非糖基化HCC)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCA PCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDAKECECKCNCNNCPCPGCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSAGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQISLSHSPGK**
SEQ ID NO:22(caTNFrecp80-非糖基化HCD)
MAPAALWALLAAGLQLWGAGRAVPGQATQLPYVPDPELGSSCQQSEYFDQRTQMCCSMCPPGSHARLFCTKTSNTVCARCENSTYTQLWNWVPECLSCGSRCGADQVETQACTREQNRICSCKSGWYCTLRRQGGCRLCAPLRRCRPGFGVAKPGTATSDVVCAPCAPGTFSNTTSSTDTCRPHRICSSVAVPGNASVDAVCSPAPPTVRTAPRPASTRQPGSTQPRPAEPTPGPSTPPRTSVLFPAVPSPPAEGLSTGDPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFASTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK**