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1、10申请公布号CN104160015A43申请公布日20141119CN104160015A21申请号201380009522122申请日20130103KCCM11236P20111221KCCM11235P20111221102012000184520120106KRC12N1/21200601C12N15/62200601C12P17/1020060171申请人CJ第一制糖株式会社地址韩国首尔市72发明人申容旭金素影许仁庚金朱恩孙晟光李在熙李沚泫金昌谦74专利代理机构北京英赛嘉华知识产权代理有限责任公司11204代理人王达佐洪欣54发明名称生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产。
2、方法57摘要本发明涉及一种生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法，所述重组微生物表达这样的融合蛋白，其中L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶由接头连接。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014081486PCT国际申请的申请数据PCT/KR2013/0000302013010387PCT国际申请的公布数据WO2013/103246KO2013071183生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书16页序列表95页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书16页序列表95页附图2页10申请公布号CN104160015ACN1041600。
3、15A1/1页21一种生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。2根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶具有分别由SEQIDNO42和SEQIDNO43表示的氨基酸序列。3根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述接头由530个氨基酸组成。4根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述接头具有LAEAAAKNAAAN为15的整数或LGGGSNAAAN为15的整数的氨基酸序列。5根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述接头具有选自SEQIDNO54、55、56、57、58、59和60的氨基酸序列。6根据权利要求1所述的重组微生物。
4、，其中所述融合蛋白具有选自SEQIDNO47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列。7根据权利要求1所述的重组微生物，其中喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性与天然微生物中的内在活性相比被进一步弱化。8根据权利要求7所述的重组微生物，其中所述喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性通过选自以下的方法减弱1编码酶的基因的部分或全部缺失，2对表达调控序列进行修饰以减少所述基因的表达，3对染色体上的所述基因序列进行修饰，以使所述蛋白质的活性减弱，以及4它们的组合。9根据权利要求1所述的重组微生物，其中选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L天冬氨酸转氨酶及所述融合蛋白中的一种或多种蛋白质的活性被进一步增强。10根据权利。
5、要求9所述的重组微生物，其中所述蛋白质活性通过选自以下的方法增强1增加编码所述酶的基因的拷贝数，2对表达调控序列进行修饰以增加所述基因的表达，3对染色体上的所述基因序列进行修饰，以增强所述酶的活性，以及4它们的组合。11根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物选自肠杆菌ENTERBACTERSP、埃希氏菌ESCHERICHIASP、欧文氏菌ERWINIASP、沙雷氏菌SERRATIASP、普罗威登斯菌PROVIDENCIASP、棒状杆菌CORYNEBACTERIUMSP及短杆菌BREVIBACTERIUMSP。12根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物为大肠杆菌ECOLI。13根。
6、据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物的识别登录号为KCCM11235P或KCCM11236P。14生产喹啉酸的方法，包括A在含有碳源的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白；以及B回收在所述培养过程中产生的喹啉酸。权利要求书CN104160015A1/16页3生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物的喹啉酸生产方法技术领域0001本发明涉及生产喹啉酸的重组微生物及利用该微生物生产喹啉酸的方法。背景技术0002喹啉酸QUINOLINICACID也被称为2,3吡啶二羧酸，在医药、农药、染料等诸多领域中被用于化学合成物的前体。0003上述喹。
7、啉酸可以通过化学或生物合成方法制备。化学合成方法将来自石油的不可再生NONRENEWABLE材料作为原料使用，因此会受到环境问题和油价或石油提取单位成本的影响。0004作为生物合成方法的代表性的例子，公开了在下述大肠杆菌ECOLI中生产喹啉酸的方法在去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶活性的大肠杆菌中，通过克隆具有编码L天冬氨酸氧化酶NADB和喹啉酸合成酶NADA的基因的不同拷贝数的质粒，使上述两种基因的表达得到增强EURJBIOCHEM175,2212281988,DE3826041。此时，产生的喹啉酸的浓度为500MG/L或以下的非常低的水平。生成如此低浓度的喹啉酸的第一个原因是NADR的转录抑制。
8、，其为编码L天冬氨酸氧化酶的NADB和编码喹啉酸合成酶的NADA的与NAD相关的转录抑制子。第二个原因是NAD导致的L天冬氨酸氧化酶NADB蛋白质的反馈抑制。第三个原因是大肠杆菌中由碳源至L天冬氨酸的生物合成途径变弱。0005为了解决第一个原因，在韩国专利公报第102012008267号中，使用了微生物菌株来将喹啉酸的产量提高到55G/L，其中将在转录阶段受到抑制的喹啉酸生物合成基因L天冬氨酸氧化酶NADB和喹啉酸合成酶NADA的启动子区域替换为组成型启动子CONSTITUTIVEPROMOTER，并增强了L天冬氨酸生物合成路径。0006通过生物合成方法由L天冬氨酸合成喹啉酸的生物合成途径如以。
9、下反应方案所示。00071L天冬氨酸氧化酶NADB0008L天冬氨酸氧过氧化氢亚氨基丁二酸H00092喹啉酸合成酶NADA0010亚氨基丁二酸磷酸二羟丙酮喹啉酸磷酸2H2O0011上述喹啉酸生物合成途径中的中间代谢产物亚氨基丁二酸是一种不稳定的物质，具有在细胞内由天然的脱氨基反应，转化为草酰乙酸酯的特性THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,VOL257,NO2,ISSUEOFJANUARY25PP626632,1982。通常，当不稳定的中间代谢产物被用作基质时，如果上述基质与酶之间的碰撞频率不高，则会生成大量的副产物。但是，目前为止还没有为解决与喹啉酸的生产相关的上述。
10、问题而进行的尝试。0012另一方面，将异种酶或蛋白质通过氨基酸接头连接，使它们表达为一个蛋白质的融合蛋白技术，被用于各种目的，例如将表达量少的蛋白质与表达量多的蛋白质连接，从而说明书CN104160015A2/16页4增加上述蛋白质的表达量，或者制备成与标记TAG连接的融合蛋白，从而提高蛋白质的纯化率等。0013已知接头的设计对于制备融合蛋白是重要的。通常，多使用具有螺旋结构的螺旋形接头或结构上具有柔性FLEXIBILITY的柔性接头，并且例如，根据想要实现的融合蛋白的特性，可通过组合上述两种接头设计和使用各种接头CANCERRES2005；6516AUGUST15,2005。0014公开00。
11、15技术问题0016本发明人尝试通过表达由不同类型的氨基酸接头连接而成的NADB和NADA的融合蛋白，来解决由不稳定的代谢产物导致的反应降低，并发现与现有的生物学生产方法相比，通过表达所述融合蛋白能够以高收率生产喹啉酸，从而完成本发明。0017技术方案0018本发明的目的是提供生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。0019本发明的另一个目的是提供生产喹啉酸的方法，包括培养上述重组微生物的步骤和回收在上述培养过程中产生的喹啉酸的步骤。0020有益效果0021根据本发明，通过提供表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的微生物，能够将现。
12、有生物学生产工序中的亚氨基丁二酸的自然分解反应最小化，由此能够以高产率生产喹啉酸。附图说明0022图1显示了根据本发明一具体实施方案的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的结构。0023图2显示了PPRONBA、PNBHL1A、PNBHL2A、PNBHL3A、PNBHL4A、PNBHL5A、PNBFL3A、PNBFL4A质粒的结构。0024图3显示了表达编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L天冬氨酸转氨酶的基因的质粒PCPA的结构。0025优选实施方案的详述0026作为一个实施方案，本发明提供了生产喹啉酸的重组微生物，其表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白。0027上述L天冬氨。
13、酸氧化酶以下，称为“NADB”作为具有将L天冬氨酸氧化为亚氨基丁二酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO42表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。0028L天冬氨酸氧化酶的活性0029L天冬氨酸延胡索酸亚氨基丁二酸琥珀酸H，或者，0030L天冬氨酸氧过氧化氢亚氨基丁二酸H0031编码上述酶的基因NADB的序列可以从文献MOLSYSTBIOL2006；220060007EPUB2006FEB21中公开的大肠杆菌ESCHERICHIACOLI的基因组序列说明书CN104160015A3/16页5GIGI89109380或者例如美国国家生物技术信息中心NCBI及日本DNA数据库DDBJ等数据。
14、库中获取。0032上述喹啉酸合成酶以下，称为“NADA”作为具有从亚氨基丁二酸合成喹啉酸的活性的酶，可以具有由SEQIDNO43表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。0033喹啉酸合成酶的活性0034亚氨基丁二酸磷酸二羟丙酮喹啉酸磷酸2H2O0035编码上述酶的基因NADA的序列可以从文献MOLSYSTBIOL2006；220060007EPUB2006FEB21中公开的大肠杆菌的基因组序列GIGI89109380或NCBI及DDBJ等数据库中获取。0036如果增强上述NADB和NADA的活性，则在细胞内作为喹啉酸前体的亚氨基丁二酸的蓄积与从亚氨基丁二酸至喹啉酸的生物合成增加，从而可以。
15、增加喹啉酸的生产量。但是，由于上述亚氨基丁二酸是不稳定的代谢物，尽管上述两种酶NADB及NADA的活性和表达量增加，如果亚氨基丁二酸与NADA的接触频率不高，则会生成大量的副产物，由此无法像期待的那样有效地生产喹啉酸。为了解决这个问题，本发明使NADB及NADA以通过接头相互连接的融合蛋白的形式在菌株中得到表达，从而能够以高收率生产喹啉酸。0037上述NADB及NADA可以具有分别由SEQIDNO42和43表示的氨基酸序列，但根据微生物的种类或菌株，显示上述活性的蛋白质的氨基酸序列可能存在差异，因此不限定于此。即，只要上述NADB及NADA是以通过接头相互连接而制备的融合蛋白形式提供，从而有助。
16、于增加喹啉酸的产率，它们可以是在SEQIDNO42和43的氨基酸序列的一个或多个位置上，具有由一个或多个氨基酸的替换、缺失、插入或添加等而变异的氨基酸序列的突变体或人工变异体。在本文中，“多个”可根据蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的种类或位置而有所不同，具体地可以是220个，优选210个，更优选25个。此外，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位等可以包括基于表达上述多肽的微生物的个体和/或物种的差异性等的天然存在的突变或人工变异。0038只要它们具有上述反应方案所示的NADB及NADA酶促活性，编码上述NADB及NADA酶的多核苷酸可以是编码分别与SEQIDNO42和43的氨基酸序列有80或更。
17、高同源性，优选有90或更高同源性，更优选有95或更高同源性，更加优选有97或更高同源性的蛋白质的多核苷酸。最优选地，所述多核苷酸可具有分别由SEQIDNO27和28表示的多核苷酸序列。0039本发明中的术语“同源性”表示两个氨基酸序列之间的一致性，可通过本领域技术人员公知的方法进行确定，例如计算分数SCORE、一致性IDENTITY、相似性SIMILARITY等参数的BLAST20。0040编码上述NADB及NADA酶的多核苷酸序列可以是SEQIDNO27或SEQIDNO28的多核苷酸序列，或者可以在“严格的条件”下与由上述多核苷酸序列制得的探针杂交，还可以编码功能正常的蛋白质的变异体。004。
18、1在本发明中，术语“严格的条件”指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。在MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL,JSAMBROOKETAL,EDITORS,2NDEDITION,COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,COLDSPRINGHARBOR,NEWYORK,1989说明书CN104160015A4/16页6或CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYFMAUSUBELETAL,EDITORS,JOHNWILEYSONS,INC,NEWYORK中有具体的记载，例如于65下在杂交缓冲液35SSC、002的聚蔗糖。
19、、002的聚乙烯吡咯烷酮、002的牛血清白蛋白、25MM的NAH2PO4PH7、05的SDS、2MM的EDTA中的杂交。SSC是PH7的015M氯化钠/015M柠檬酸钠。杂交后，在室温下用2SSC清洗已转移有DNA的膜，并在68的温度下用0105SSC/01SDS清洗。0042本发明的融合蛋白是将显示不同活性的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶通过氨基酸接头互相连接而成的多肽，具有下述反应方案中所示的由L天冬氨酸生物合成喹啉酸的活性。0043融合蛋白的活性0044L天冬氨酸氧磷酸二羟丙酮喹啉酸磷酸2H2O过氧化氢0045如果增强上述融合蛋白的活性，则会提高作为中间代谢产物的亚氨基丁二酸至喹啉酸的转。
20、化率，从而与独立地增强NADB及NADA活性的情况相比，能够以更高的产率生产喹啉酸。0046上述融合蛋白可以是通过接头将L天冬氨酸氧化酶的N端和喹啉酸合成酶的C端连接而成的多肽，或者是通过接头将L天冬氨酸氧化酶的C端和喹啉酸合成酶的N端连接而成的多肽，优选是选自SEQIDNO47、48、49、50、51、52及53中的氨基酸序列。0047上述接头位于NADB和NADA多肽之间或者编码这些多肽的基因之间，其可以是螺旋形接头或柔性接头。此外，可以单独地或组合使用螺旋形接头或柔性接头作为上述接头，可以使用“EAAAK”或“EAAAR”作为上述螺旋形接头，可以使用“GGSGGS”、“GGGS”、“GG。
21、SG”或“GS”作为柔性接头，但其不限于此。0048上述接头可由530个氨基酸序列组成，并且可以将螺旋形接头或柔性接头单独地或重复地连接使用。0049根据一个具体的实施方案，含有上述螺旋形接头的接头可以是LAEAAAKNAAA，含有上述柔性接头的接头可以是LGGGSNAAA。优选地，上述N可以是15的整数。0050根据一个具体的实施方案，上述接头可以具有选自SEQIDNO54、55、56、57、58、59及60中的氨基酸序列，或者与它们有高同源性的氨基酸序列，但不限定于此。0051本发明的“生产喹啉酸的重组微生物”是能够从培养基中的碳源生产并蓄积喹啉酸，并表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉。
22、酸合成酶的融合蛋白，从而能够以高产率生产喹啉酸的微生物。0052通过导入编码上述融合蛋白的多核苷酸，可以制备本发明的重组微生物以表达融合蛋白。0053根据一个具体的实施方案，本发明的重组微生物可以通过将含有编码上述融合蛋白的多核苷酸的重组载体转化到该重组微生物中来制备。0054本发明中，术语“转化”是指将基因导入宿主细胞内，使其能在宿主细胞内表达。只要被转化的基因能够在宿主细胞内表达，其可以位于任何位置而不受限制，不论是被插入染色体内还是位于染色体外。此外，只要上述基因能够导入宿主细胞内表达，其可以任何形式导入。例如，上述基因可以以含有上述基因自我表达所需要的所有要素的多核苷酸结构的表达盒EX。
23、PRESSIONCASSETTE形式导入宿主细胞内。上述表达盒通常包括与上述基因说明书CN104160015A5/16页7可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点及翻译终止信号。上述表达盒可以是能够进行自我复制的表达载体形式。此外，上述基因可以以多核苷酸结构或其自身的形式导入宿主细胞中，且能够可操作地与宿主细胞中进行表达所需要的序列连接。0055上述重组载体是一种通过将DNA导入宿主细胞来制备制备表达本发明的融合蛋白的微生物，以表达融合蛋白的方式，可以使用质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体等公知的表达载体，并且本领域技术人员可根据使用DNA重组技术的任意公知方法容易地制备载体。0056优。
24、选地，上述重组载体可以是具有图2所示的切割图的PNBHL1A、PNBHL2A、PNBHL3A、PNBHL4A、PNBHL5A、PNBFL3A或PNBFL4A质粒载体，更优选地，上述质粒载体可以分别含有SEQIDNO34、35、36、37、38、39和40的核苷酸序列。0057根据一个具体实施方案，生产喹啉酸的微生物可以是属于肠杆菌ENTERBACTERSP、埃希氏菌ESCHERICHIASP、欧文氏菌ERWINIASP、沙雷氏菌SERRATIASP、普罗威登斯菌PROVIDENCIASP、棒状杆菌CORYNEBACTERIUMSP或短杆菌BREVIBACTERIUMSP的微生物，优选属于埃希氏。
25、菌的微生物，更优选为大肠杆菌，但不限定于此。0058与内源性活性相比，本发明的微生物的喹啉酸磷酸核糖基转移酶NADC的活性会进一步减弱。本文的术语“内源性活性”是指天然微生物所具有的喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性。0059上述NADC具有将喹啉酸转化为烟酸单核苷酸的活性，且可以具有SEQIDNO44的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。编码上述酶的基因NADC的序列可以从文献MOLSYSTBIOL2006；220060007EPUB2006FEB21中公开的大肠杆菌的基因组序列GI89106990或NCBI、DDBJ等数据库中获取。0060喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性00615磷基D核糖1二。
26、磷酸喹啉酸2HCO2二磷酸烟酸单核苷酸0062通过减弱上述NADC的活性，可以增加细胞内喹啉酸的蓄积。可通过选自以下的方法实现酶活性的减弱1编码上述酶的基因的部分或全部缺失，2对表达调控序列进行修饰以减少基因的表达例如，将上述基因的内源启动子替换为较弱的启动子，3对染色体上的上述基因序列进行修饰，以减弱上述酶的活性，及4它们的组合。在本发明的具体实施例中，通过同源重组的方式，将NADC从微生物的基因组中去除。0063此外，可进一步修饰本发明的微生物，以增强选自磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L天冬氨酸转氨酶及本发明的融合蛋白中的一种或多种蛋白质的活性，以增强磷酸烯醇式丙酮酸至L天冬氨酸的生物合成途径。。
27、0064上述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC及L天冬氨酸转氨酶ASPC具有从磷酸烯醇式丙酮酸合成L天冬氨酸的活性，且可以具有分别由SEQIDNO45和46表示的氨基酸序列或与之有高同源性的氨基酸序列。编码上述酶的基因PPC或ASPC的序列可以从文献MOLSYSTBIOL2006；220060007EPUB2006FEB21中公开的大肠杆菌的基因组序列GIGI89110074,GI89107778或NCBI、DDBJ等数据库中获取。0065磷酸烯醇丙酮酸羧基酶的活性0066磷酸烯醇式丙酮酸CO2草酰乙酸磷酸说明书CN104160015A6/16页80067L天冬氨酸转氨酶的活性0068草酰乙酸谷氨酸。
28、L天冬氨酸2酮戊二酸0069因此，如果增强PPC和ASPC的活性，则可以增加细胞内作为喹啉酸前体的L天冬氨酸的生产量，从而能够增加喹啉酸的生产量。0070上述酶活性的增强可通过选自以下的方法实现1增加编码上述酶的基因的拷贝数的方法，2对表达调控序列进行修饰以增加基因表达的方法，3对染色体上的上述基因序列进行修饰，以增强上述酶的活性的方法，及4它们的组合。在本发明的具体实施例中，构建了含有编码上述酶的基因的质粒，并将其导入生产喹啉酸的微生物中，以增加上述基因的拷贝数，从而诱导活性的增强。0071可以使用将编码上述融合蛋白的基因的内源性启动子替换为活性增强的启动子，或者诱发启动子突变以增强启动子的。
29、活性，或者增加上述基因的拷贝数等方法，以增强上述融合蛋白的活性。通常可以使用PTAC、PTRC、PPRO、PR、PL、PCJ1、PCYSK等作为上述活性增强的启动子。0072在本发明的具体实施例中，将NADB和NADA的启动子取代为组成型启动子PPROSEQIDNO32，以将组成型表达的NADB和NADA基因制备成质粒形式，所述组成型表达的NADB和NADA基因在转录抑制因子NADR以细胞内NAD浓度来抑制NADB及NADA的表达时不受抑制，并将质粒导入微生物中以诱导天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的过度表达。此外，本发明的具体实施例中，将编码NADBLNADA的基因的启动子取代为PPRO启动子，。
30、从而诱导NADBLNADA的过度表达。在这一点上，PPRO启动子仅作为抵抗细胞内的反馈抑制并提高蛋白质的表达的一个实例，本发明中所使用的启动子不限于此。0073在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产喹啉酸的方法，包括A在含有碳源的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表达由接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白；及B回收在上述培养过程中产生的喹啉酸。0074上述重组微生物可以在本领域公知的适宜的培养条件下于合适的培养基中进行培养。本领域技术人员可以使用此类培养方案并可根据所选择的微生物容易地进行调整。培养方法包括分批式、连续式和流加式培养，但不限定于此。微生物的各种培养方法公开在。
31、例如，“BIOCHEMICALENGINEERING”,JAMESMLEE,PRENTICEHALLINTERNATIONALEDITIONS,PP138176。0075培养所使用的培养基必须以适当的方式满足特定微生物的需求。多种微生物的培养基公开在例如文献“MANUALOFMETHODSFORGENERALBACTERIOLOGY”,AMERICANSOCIETYFORBACTERIOLOGY美国细菌学学会,WASHINGTONDC,USA,1981。上述培养基含有各种碳源、氮源及微量元素。0076可用于培养微生物的培养基中的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素等碳水化合物。
32、；大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油等油类；棕榈酸、硬脂酸和亚油酸等脂肪酸类；甘油和乙醇等醇类；乙酸等有机酸，但不限定于此。碳源可以单独或组合使用。0077可用于培养微生物的培养基中的氮源包括胨类、酵母提取物、肉汁、麦精、玉米浸渍液CSL及大豆粉等有机氮源；尿素；硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵等无机氮源，但不限定于此。氮源可以单独或组合使用。说明书CN104160015A7/16页90078可用于培养微生物的培养基的磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及相应的钠盐。此外，还可以包括硫酸镁或硫酸铁等金属盐。此外，上述培养基中还可以含有氨基酸、维生素及适宜的前体等。微生物培养用培养基或个别成分可。
33、以分批式或连续式方式添加。0079此外，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸及硫酸等化合物以适宜的方式添加到微生物培养基中，从而控制发酵液的PH值。此外，在培养中可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制气泡生成。为了维持培养液的好氧状态，可以向发酵液中注入氧气或含氧气的气体例如，空气。发酵液的温度通常可以是2045，优选2540。培养期可以持续到获得期待量的喹啉酸为止，优选10160小时。0080本发明的具体实施例中，将表达质粒转化到去除了喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性的W3110NADC菌株后，确认从这些菌株由天冬氨酸生产喹啉酸的生物合成能力，所述表达质粒包含编码由各种接头连接而成的NADBLNA。
34、DA融合蛋白的基因。结果发现，与这些酶单独的表达相比，当L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶以融合蛋白表达时，能够以更高的收率生产喹啉酸表2。0081此外，以包含编码上述融合蛋白的基因的表达质粒转化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和L天冬氨酸转氨酶的活性得到增强并且喹啉酸磷酸核糖基转移酶的活性被去除的大肠杆菌后，确认了这些菌株CV010600、CV010601、CV010602、CV010603、CV010604、CV010605、CV010606及CV010607的喹啉酸产率。结果发现，通过L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的表达，能够以高收率生产喹啉酸，并且在以融合蛋白形式表达的同时，通过喹啉酸磷酸。
35、核糖基转移酶活性的去除及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L天冬氨酸转氨酶的表达增强的组合，能够以比现有菌株更高的收率生产喹啉酸表5。0082于2011年12月21日，根据布达佩斯条约将上述生产喹啉酸的菌株大肠杆菌CV010604及CV010605保存在韩国微生物保存中心KCCM,位于韩国首尔市西大门区弘济1洞，登录号为KCCM11235P及KCCM11236P。即，上述寄存是寄存在布达佩斯条约下的国际保存单位。实施例0083下文将参照实施例和实验实例对本发明进行更加详细地说明。但是，下述实施例只是举例说明本发明，本发明的内容并不限定于下述实施例。0084实施例1生产喹啉酸的菌株的制备0085表达L天冬。
36、氨酸氧化酶的质粒的制备0086通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR，获得了编码L天冬氨酸氧化酶的基因NADB。基于从美国国立卫生研究院的基因库NIHGENBANK获得的SEQIDNO27的NADB基因的核苷酸序列NCBI登记号“GI89109380”，可以对NADB基因的含有ATG至TAA部分的ORF部分进行扩增，并合成了具有限制性内切酶NDEI和BAMHI的识别位点的SEQIDNO1和2的引物。0087以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，使用SEQIDNO1和2的寡核苷酸作为引物，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复。
37、30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸2分钟。由此，获得了约19KB扩增的基因，所述基因均含有NADB基因和限制性内切酶NDEI和BAMHI说明书CN104160015A8/16页10的识别位点。0088对上述通过PCR获得的NADB基因用限制性内切酶NDEI和BAMHI进行处理，所述NADB基因通过连接LIGATION到用限制性内切酶NDEI和BAMHI处理过的PPROLARCLONETECH载体而被克隆，最终制得克隆有NADB基因的PPRONADB重组载体，而NADB基因的表达受到作为组成型启动子的PPRO启动子的调控。0089表达L天冬氨酸氧化酶。
38、及喹啉酸合成酶的质粒的制备0090通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR，获得编码喹啉酸合成酶的基因NADA。基于从美国国立卫生研究院的基因库NIHGENBANK获得的SEQIDNO28的NADA基因的碱基序列数据NCBI登记号“GI89107601”，可以对NADA基因的含有ATG至TAA部分的ORF部分进行扩增，并且合成具有限制性内切酶APAI和NOTI的识别位点的SEQIDNO3和4的引物。0091以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，使用上述SEQIDNO3和4的寡核苷酸作为引物，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重。
39、复30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸2分钟。由此，获得了约10KB扩增的基因，所述基因含有NADA基因和限制性内切酶APAI和NOTI的识别位点。0092此外，通过将PPROLARCLONETECH载体的染色体DNA作为模板的PCR，获得了PRO启动子。基于从CLONETECH公司获得的PRO启动子的碱基序列数据SEQIDNO32，合成了具有限制性内切酶BAMHI和APAI的识别位点的SEQIDNO5和6的引物，以连接PPRO启动子和上述扩增的NADA基因。0093以大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板，使用SEQIDNO5和6的寡核苷酸作为引物。
40、，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸1分钟。由此，获得了约0135KB扩增的基因，所述基因含有PPRO启动子和限制性内切酶BAMHI和APAI的识别位点。0094用限制性内切酶APAI和NOTI对上述通过PCR获得的NADA基因进行处理，并且用APAI和BAMHI对扩增的PPRO启动子片段进行处理。用限制性内切酶处理过的NADA及PPRO启动子片段通过连接到用限制性内切酶NOTI和BAMHI处理过的上述中获得的PPRONADB而被克隆，最终制得57KB的PPRO。
41、NBA重组载体，所述PPRONBA重组载体克隆有表达受到作为组成型启动子的PPRO启动子的调控的NADB基因和表达受到PPRO启动子调控的NADA基因。制得的PPRONBA具有SEQIDNO33的序列。图2显示了质粒PPRONBA的结构，所述质粒表达编码L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的基因。0095表达NADBLNADA的质粒的制备0096为了制备表达含有接头的NADBLNADA的质粒，使用上述中制得的PPRONBASEQIDNO33作为模板，使用SEQIDNO7和8的寡核苷酸作为引物，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR。
42、，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸2分钟。由此，获得了含有PPRO启动子和限制性内切酶的位点XHOI和位于NADB基因末端的接头的约18KB扩增的基因。说明书CN104160015A109/16页110097此外，为了扩增NADA基因片段，将PPRONBA作为模板，使用SEQIDNO15和16的寡核苷酸作为引物，实施PCR，所述NADA基因片段与上述的约18KB扩增的基因末端具有序列同源性，其具有限制性内切酶位点XHOI，含有PPRO启动子及位于NADB基因末端的接头，并且在NADA基因末端含有限制性内切酶位点NOTI。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATA。
43、GENE作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸2分钟。由此，获得了约11KB扩增的基因，其可通过同源性连接与接头相连，并且在NADA基因的末端含有限制性内切酶位点NOTI。0098将上述制得的“含有PPRO启动子、限制性内切酶位点XHOI及位于NADB基因末端的接头的约18KB扩增的基因”和“与上述约18KB扩增的基因的末端具有序列同源性，并且在NADA基因的末端含有限制性内切酶的位点NOTI的NADA基因片段”进行混合，并实施拼接SEWINGPCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复10次。
44、循环进行PCR，每个循环包括96下变性60秒、50下退火60秒及72下延伸1分钟。将SEQIDNO7和16的寡核苷酸添加到PCR反应液中，进一步实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复20次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸3分钟。由此，获得了含有“限制性内切酶XHOI_PPRO启动子_NADB_接头_NADA_限制性内切酶NOTI”的约29KB扩增的融合蛋白基因。0099用限制性内切酶XHOI和NOTI对通过上述PCR获得的“限制性内切酶XHOI_PPRO启动子_NADB_接头_NADA_限制性内切酶NO。
45、TI”基因片段进行处理。用限制性内切酶处理过的“PPRO启动子_NADB_接头_NADA基因片段”通过连接到用限制性内切酶XHOI和NOTI处理过的PPROLARCLONETECH载体上而被克隆，最终制得表达受到作为组成型启动子的PPRO启动子的调控、NADB基因和NADA基因由接头克隆成单一融合蛋白的PNBHL1A重组载体。本实施例中使用的接头由530个氨基酸组成，并具有分别由SEQIDNO54、55、56、57、58、59和60表示的氨基酸序列。0100通过将含有接头的SEQIDNO8的寡核苷酸替换为SEQIDNO9、10、11、12、13或14的寡核苷酸来扩增NADB基因片段的方法，扩增。
46、含有各种接头的基因，其每个含有PPRO启动子和位于NADB基因末端的接头，并使用与上述相同的方法制备PNBHL2A、PNBHL3A、PNBHL4A、PNBHL5A、PNBFL3A及PNBFL4A重组载体。制得的PNBHL1A、PNBHL2A、PNBHL3A、PNBHL4A、PNBHL5A、PNBFL3A及PNBFL4A分别具有SEQIDNO34、35、36、37、38、39及40的核苷酸序列。此外，如此制得的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白分别具有SEQIDNO47、48、49、50、51、52及53的氨基酸序列。图2显示了质粒PNBHL1A、PNBHL2A、PNBHL3A、PNBHL。
47、4A、PNBHL5A、PNBFL3A及PNBFL4A的结构，所述质粒表达编码由多种接头连接的L天冬氨酸氧化酶和喹啉酸合成酶的融合蛋白的基因。0101表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及L天冬氨酸转氨酶的质粒的制备0102通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR，获得了编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶进行编码的基因PPC。基于从美国国立卫生研究院的基因库NIHGENBANK获得的SEQIDNO29的PPC基因的碱基序列NCBI登记号“GI89110074”，可以对PPC基因的含有启动子至终止子的部分进行扩增，并合成具有限制性内切酶HINDIII和BAMHI的识别位点的SEQIDNO17和18的引。
48、物。0103将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，使用SEQIDNO17和18的寡核苷酸说明书CN104160015A1110/16页12作为引物，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸4分钟。由此，获得了含有PPC基因和限制性内切酶HINDIII和BAMHI的识别位点的约31KB扩增的基因。0104用限制性内切酶HINDIII和BAMHI对通过上述PCR获得的PPC基因进行处理，然后通过连接在用限制性内切酶HINDIII和BAMHI处理过的PCL1920AB。
49、236930载体上将其克隆，最终制得克隆有PPC基因的PCP重组载体。0105为了在克隆有PPC基因的PCP重组载体上克隆ASPC基因，通过将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板的PCR，获得了编码L天冬氨酸转氨酶的基因ASPC。基于从美国国立卫生研究院的基因库NIHGENBANK获得的SEQIDNO30的ASPC基因的碱基序列NCBI登记号“GI89107778”，可以对ASPC基因的含有启动子至终止子的部分进行扩增，并合成了具有限制性内切酶BAMHI和KPNI的识别位点的SEQIDNO19和20的引物。0106将大肠杆菌W3110的染色体DNA作为模板，使用SEQIDNO19和20的寡核苷酸作为引物，实施PCR。使用PFUULTRATMDNA聚合酶STRATAGENE作为聚合酶，通过重复30次循环进行PCR，每个循环包括96下变性30秒、50下退火30秒及72下延伸2分钟。由此，获得了含有ASPC基因和限制性内切酶BAMHI和KPNI的识别位点的约15KB扩增的基因。0107对通过上述PCR获得的ASPC基因用限制性内切酶BAMHI和KPNI进行处理，然后通过连接在用限制性内切酶BAMHI和KPNI处理过的PCP载体上而被克隆，最终制得同。