技术领域
本发明涉及xCT蛋白及其编码基因在神经变性病中的新用途。
背景技术
小鼠xCT是由Slc7a11基因编码的502个氨基酸组成的具有12个跨膜结构域 的转运蛋白，该基因首次由日本的Sato等(Sato H，Tamba M，Ishii T，et al. Cloning and expression of a plasma membrane cystine/glutamate exchange transporter composed of two distinct proteins.J Biol Chem.1999；274： 11455-11458)于1999年克隆鉴定(GenBank号：AB022345或GI：4689080；提交 日期：13-JAN-1999)。同时发现xCT的C158残基通过形成二硫键与另一亚基4Fhc 相结合，形成蛋白二聚体，共同组成Xc-氨基酸(胱氨酸/谷氨酸)转运系统，专司 胱氨酸从胞外向胞内的运送，同时将谷氨酸转运出细胞外，以1∶1进行交换。
Sut小鼠起源于野生型C3H/HeSnJ的自发突变，已经证实基因组水平只是 Slc7a11基因的改变(Swank RT，Reddington M，Novak EK.Inherited prolonged bleeding time and platelet storage pool deficiency in the subtle gray(sut) mouse.Lab Anim Sci.1996；46：56-60)。2005年，Chintala和Li[李巍]等利 用定位候选克隆方法发现，因编码xCT蛋白的Slc7a11基因的突变，是subtle gray (sut)(纯合性sut/sut小鼠)小鼠的发病原因，subtle gray(sut)小鼠与野 生型C3H/HeSnJ(简写C3H)小鼠相比，只有Slc7a11基因发生突变，其它基因均 正常，结果发表在2005年8月份的美国科学院院刊上(Chintala S，Li W，Lamoreux ML，et al.Slc7a11 controls the production of pheomelanin pigment and the proliferation of cultured cells.Proc Natl Acad Sci USA，2005；102： 10964-10969)。同时李巍等在小鼠脑组织中克隆得到了一条长达9kb以上的 cDNA(GenBank登录号：AY766236或GI：59893993；提交日期：29-SEP-2004；提交 者：Li，W.[李巍]and Swank，R.T.)。Chintala和Li[李巍]等的研究发现(Chintala S，Li W，Lamoreux ML，et al.Slc7a11 controls the production of pheomelanin pigment and the proliferation of cultured cells.Proc Natl Acad Sci USA， 2005；102：10964-10969)，在体外培养细胞中，由于有充足的O2供应，培养基 中所含有的半胱氨酸基本被氧化为胱氨酸。在xCT缺乏的sut小鼠培养的皮肤成 纤维细胞和黑色素细胞不能有效利用培养基中的胱氨酸，导致细胞内GSH减少和 细胞存活度明显下降。同时，这种对细胞存活的影响，通过在培养液中添加一定 浓度的还原剂如β-巯基乙醇(BME)可使细胞生长基本恢复正常。进一步说明xCT 蛋白可能通过调节细胞内半胱氨酸的浓度，影响细胞内谷胱甘肽的合成，参与细 胞的抗氧化损伤作用。但是其确切的引起细胞死亡的机制尚未阐明。
神经变性病是一大类严重危害人类健康的脑疑难疾病，其中以老年性痴呆 (Alzheimer’s disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)最为 常见，具有高发病率、高患病率和高致残率的特点。随着人口老龄化，我国AD或 PD的发病率逐年增高，给家庭和整个社会都带来了沉重的负担。
帕金森病(PD)是一种神经系统退行性疾病，严重影响到患者的健康和生存能 力，主要表现为黑质多巴胺能神经元的丧失，纹状体多巴胺含量严重下降，临床 上以震颤、强直、运动迟缓为主要表现。至今尚无有效的药物能阻止神经元的变 性，使病情逆转。
发明内容
本发明的目的是提供xCT蛋白及其编码基因的新用途。
本发明首次证实Slc7a11基因的突变可以导致神经元变性，证明了Slc7a11 基因是与神经变性病相关的基因。
本发明所提供的xCT蛋白及其编码基因(Slc7a11基因)的新用途是xCT蛋白 及其编码基因在筛选预防和/或治疗神经变性病药物中的应用。
所述神经变性病包括帕金森氏病和老年性痴呆等。
在实际应用中，可以Slc7a11基因(正常基因)或xCT(正常蛋白)为靶标， 筛选可提高Slc7a11基因(正常基因)或xCT(正常蛋白)的表达量的药物，以 提高Slc7a11基因(正常基因)或xCT(正常蛋白)的表达量，增加神经细胞的抗 氧化损伤能力，从而预防或减缓神经变性病的发生。
对于Slc7a11基因(正常基因)或xCT(正常蛋白)的表达量低的神经变性病， 可利用该神经变性病的动物模型筛选可提高Slc7a11基因(正常基因)或xCT(正 常蛋白)的表达量的蛋白质、核酸、有机小分子等，作为治疗神经变性病的候选 药物。
附图说明
图1为纯合性sut/sut小鼠和C3H/HeSnJ小鼠SHIRPA行为测试结果
图2为纯合性sut/sut小鼠脑的TH免疫组化染色和Calbindin免疫组化染色 照片。
图3为纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞在缺乏BME时发生的细胞凋亡照片
图4为流式细胞术检测不加BME的纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞的凋亡率 结果
图5为Western-Blot检测纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞的 caspase-3，caspase-9被活化和剪切、JNK被磷酸化情况
具体实施方式
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1.Slc7a11基因是与神经变性病相关的基因
对9-14周龄的subtle gray(sut/sut)小鼠(购自美国The Jackson Laboratory)和C3H/HeSnJ小鼠(购自美国The Jackson Laboratory)进行了SHIRPA (“一种综合表型评估体系”，详见网址： http：//www.mgu.har.mrc.ac.uk/facilities/mutagenesis/mutabase/shirpa_su mmary.html)行为测试，结果表明，第一批筛选实验(primary screen)中的有10 个实验，结果中两组出现差异，表明sut小鼠表现出明显的中枢性共济失调样运 动障碍(图1，C3H表示C3H/HeSnJ小鼠)。提示在sut小鼠(sut/sut)中， 那些对xCT摄取胱氨酸的依赖性大，用以抵抗氧化应激损伤的运动神经细胞，因 xCT缺乏后表现为存活障碍，引起神经变性样改变，导致相应的症状。
对野生型C3H/HeSnJ小鼠、杂合性sut/+小鼠(将野生型C3H/HeSnJ小鼠和纯 合性sut/sut小鼠杂交得到的F1代小鼠)和纯合性sut/sut小鼠(购自美国The Jackson Laboratory)脑组织进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色和钙结合蛋白 calbindin免疫组化染色，结果如图2所示，表明sut小鼠与运动功能有关的黑质 (图2中左侧图片)中的TH染色阳性多巴胺能神经元和与运动功能有关的小脑(图 2中右侧图片)中Calbindin染色阳性的Purkinje细胞数目明显减少。说明在sut 小鼠中，xCT的缺乏导致了神经细胞的死亡。图2中，最上面的两张图片为野生型 C3H/HeSnJ小鼠；中间的两张图片为杂合性sut/+小鼠；下面的两张图片为纯合性 sut/sut小鼠。
为了弄清楚xCT缺乏导致神经细胞死亡的确切机制，纯合性sut/sut小鼠黑 色素细胞(从英国伦敦St.George医院M.Lynn Lamoreux实验室获得)分别在 添加β-巯基乙醇(+BME)，使其终浓度为100μmol/L或不加β-巯基乙醇(- BME)的RPMI1640培养基(美国GIBCO公司产品)中分别培养72和96小时后， 用Hoechst33342和PI(propidium iodide)双荧光染色观察细胞核，结果如图3 (Hoechst33342染色为蓝色，PI染色为红色)所示，表明随着培养时间的增加， 细胞凋亡发生率增加。
纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞分别在添加β-巯基乙醇(终浓度为 100μmol/L)或不加β-巯基乙醇的RPMI1640培养基中分别培养60、72和96小时 后，培养细胞经0.25％胰蛋白酶消化处理后，用70％乙醇固定，PI(propidium iodide)染色后，在美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪上进行测定，得到与 图3相似的结果，即随着培养时间的增加，不加BME的sut黑色素细胞的PI染色 阳性细胞凋亡发生率相应增加，在96h时超过10％，对照组为加BME培养96h，凋 亡率为1.71％(图4)。图4中，百分数表示凋亡率。
将培养24小时、48小时和72小时的纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞，分别 设立加BME(终浓度为100μmol/L)或不加BME两组，另外用来源于野生型C57BL/6J 小鼠的mela a黑色素细胞系(从英国伦敦St.George医院M.Lynn Lamoreux实 验室获得)培养72小时加BME(终浓度为100μmol/L)为对照，收集细胞蛋白后， 按常规方法(电泳、转膜、杂交、显色等)进行蛋白质Western印迹实验，所用 的剪切caspase-3抗体，caspase-9抗体(caspase-3抗体只检测其剪切体， caspase-9抗体可检测出未剪切和剪切体两种)和磷酸化JNK抗体均购自美国Cell Signal公司，所用的上样对照的actin抗体为美国Sigma公司产品。结果检测到 培养48到72小时的不加BME的纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞中，反映细胞凋 亡发生的生化指标如caspase-3，caspase-9被活化和剪切，72小时较48小时更明 显，表明xCT缺乏后引起的细胞凋亡是通过caspase-9和caspase-3的通路而引 发。同时在培养48到72小时的不加BME的纯合性sut/sut小鼠黑色素细胞中， 检测到磷酸化JNK(p-JNK)，同样，72小时较48小时更明显，表明caspase-9 和caspase-3上游的JNK信号转导途径被激活(图5)。这些体外实验的结果说明 了xCT缺乏细胞的死亡是由于细胞凋亡所引起，并明确了发生细胞凋亡的通路。 图5中，“+”表示加β-巯基乙醇，“-”表示未加β-巯基乙醇。