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1、(10)授权公告号 CN 101480377 B (45)授权公告日 2011.01.12 CN 101480377 B *CN101480377B* (21)申请号 200910028176.7 (22)申请日 2009.01.16 A61K 9/16(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 南京大学医学院附属鼓楼医院 地址 210008 江苏省南京市中山路 321 号 (72)发明人 刘宝瑞 李茹恬 钱晓萍 (74)专利代理机构 南京中新达专利代理有限公 司 32226 代理。
2、人 孙鸥 吴澄 (54) 发明名称 肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种肿瘤酶靶向纳米载药高分子 微球的制备方法。本发明采用以 - 己内酯为 原料的疏水片段 PCL 的制备及活化、 单甲氧基聚 乙二醇 -N- 羟基琥珀酰亚胺， 与 PEP 的氨基端反 应的亲水片段单甲氧基聚乙二醇与肽链的连接、 亲水片段 mPEG-PEP 和疏水片段 PCL-COOH 的连 接、 载体的制备等构成。本发明解决了抗肿瘤靶 向药物载体、 药物投递体系各自存在的缺陷。本 发明利用肿瘤组织特异性高表达基质金属蛋白 酶-2/9(Matrix metallopeptidase-2/9， M。
3、MP-2/9 的特性， 将 PEP 作为载体亲水段和疏水段的连接， 一旦微球到达肿瘤组织， MMP2/9 即可将该 PEP 水 解， 微球形态发生改变， 疏水部分暴露， 使药物得 以特异性释放或被肿瘤组织摄取。 对于MMP2/9不 表达或低表达的组织， 毒性较小。 (51)Int.Cl. 审查员 马彦冬 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 CN 101480377 B1/1 页 2 1. 肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法， 其步骤如下 ： (1) 疏水片段 PCL 的制备及活化 以 - 己内酯为原料， 采用自由基聚合法。
4、， 合成含有羧基的 PCL-COOH， 然后采用 EDC 将 PCL-COOH 末端氨基化， 合成末端带有活性氨基的 PCL-NH2， 具体反应如下 ： R CH2CH(CH3)2； (2) 亲水片段单甲氧基聚乙二醇与肽链的连接 采用活化的单甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺， 与PEP的氨基端反应， 合成为亲水 片段 mPEG-PEP， 具体反应为 ： (3) 亲水片段 mPEG-PEP 和疏水片段 PCL-COOH 的连接 在 EDC、 DMAP、 NHS 存在的情况下， mPEG-PEP 末端的羧基和 PCL-NH2 末端的氨基反应， 形 成 mPEG-PEP-PCL 两嵌段共聚物 ； 。
5、(4) 载体的制备 将嵌段共聚物溶于等体积比的乙醇和丙酮中， 再将所制得的溶液滴入 25 倍体积的冷 纯水中， 减压抽除有机溶剂， 将溶液冷冻干燥， 即得到载体， -20冷冻保存。 2. 根据权利要求 1 所叙述的肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法， 其特征在于 步骤(1)疏水片段PCL的制备及活化 ； 具体步骤为 ： 将-CL和亮氨酸按设计分子量的比例 混合， 真空下 160反应 24h， 反应产物在二氯甲烷中溶解， 再沉淀于乙醚中， 真空干燥。 3. 根据权利要求 1 所叙述的肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法， 其特征在 于步骤 (2) 亲水片段 mPEG 与肽链 (PEP) 的。
6、连接 ； 具体步骤为 ： 将活化的 mPEG-NHS 和对于 MMP2/9 敏感的肽链按照 1 1.2 的摩尔比溶于含 2三乙胺的 DMF 中， 室温下搅拌反应 3 小时， 将产物置透析袋， 在纯水中透析 24h， 冷冻干燥。 4. 根据权利要求 1 所叙述的肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法， 其特征在于 步骤 (3) 将 PEG-PEP、 PCL-COOH、 DMAP、 EDC、 NHS 按照 1.1 1 1.5 1 1 的摩尔比， 溶 于 DMF 中， 室温反应 18 小时， 产物置透析袋， 在纯水中透析 24h， 冷冻干燥。 权 利 要 求 书 CN 101480377 B1/4 。
7、页 3 肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种药物载体， 特别涉及一种可以在肿瘤组织局部靶向性投递药物的 抗肿瘤的肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备方法。 0002 目前， 肿瘤的内科治疗最主要的手段是化疗。 但是， 化疗药物存在的毒副作用非常 大， 使得化疗的应用受到局限。许多和化疗相关的毒副作用是与化疗药物剂量大小成正相 关关系。降低给化疗药剂量可以减轻毒副作用， 但这同时又会降低抗肿瘤疗效。因此， 在化 疗药物的疗效和毒性之间因此存在着矛盾。 0003 解决这一矛盾的思路， 是采用靶向性的药物载体对药物进行投递， 使其在肿瘤局 部靶向性释放。靶向性药物。
8、投递可以使化疗药物在肿瘤局部达到高浓度， 但在其余正常的 器官组织浓度较低， 既可以提高药物疗效， 又可避免产生严重的毒副作用。 0004 在本发明之前， 已有许多靶向药物载体被报道， 例如热靶向、 即在肿瘤局部进行热 疗， 使得药物在热疗部位靶向性释放， 又如磁靶向， 是在肿瘤部位外加磁场， 使得磁性载体 定向到肿瘤。但上述靶向策略都存在的一个不足是， 由于热靶向和磁靶向都需要外界的热 疗设施或磁场。 在实施时， 病灶的部位必须明确， 因此， 对于病灶不明、 病灶深在或者广泛转 移性的病灶， 就不能充分发挥作用。从手段上来说， 也相对较为复杂。 0005 另外， 已经合成的 PEG-PEP-。
9、 阿霉素和羟乙基淀粉 -PEP-MTX( 甲氨蝶呤 ) 的药物投 递体系， 证明这种体系可以使药物在肿瘤部位特异性释放， 提高疗效， 减少毒副作用。 但是， 这种方法构建的药物投递体系， 牵涉到化学键与药物 ( 比如阿霉素、 MTX) 的结合， 在工艺上 难度大， 而且难以推广到其他的化疗药物。此外， 化疗药物分子上引入新的化学键， 也很有 可能改变化疗药物本身的活性， 影响药物的疗效， 这是它致命的弱点。 发明内容 0006 本发明的目的就在于克服上述缺陷， 研究、 发明一种抗肿瘤纳米酶靶向药物载体 的制备方法。 0007 本发明的技术方案是 ： 0008 肿瘤酶靶向纳米载药高分子微球的制备。
10、方法， 其主要技术步骤如下 ： 0009 (1) 疏水片段 PCL 的制备及活化 0010 以 - 己内酯为原料， 采用自由基聚合法， 合成含有羧基的 PCL-COOH， 然后采用 EDC 将 PCL-COOH 末端氨基化， 合成末端带有活性氨基的 PCL-NH2， 具体反应如下 ： 0011 0012 R CH2CH(CH3)2； 0013 (2) 亲水片段单甲氧基聚乙二醇与肽链的连接 说 明 书 CN 101480377 B2/4 页 4 0014 采用活化的单甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺， 与PEP的氨基端反应， 合成为 亲水片段 mPEG-PEP， 具体反应为 ： 0015 00。
11、16 (3) 亲水片段 mPEG-PEP 和疏水片段 PCL-COOH 的连接 0017 在 EDC、 DMAP、 NHS 存在的情况下， mPEG-PEP 末端的羧基和 PCL-NH2 末端的氨基反 应， 形成 mPEG-PEP-PCL 两嵌段共聚物 ； 0018 (4) 载体的制备 0019 将嵌段共聚物溶于等体积比的乙醇和丙酮中， 再将所制得的溶液滴入 25 倍体积 的冷纯水中， 减压抽除有机溶剂， 将溶液冷冻干燥， 即得到载体， -20冷冻保存。 0020 本发明的优点和效果在于能够制备出一种智能型纳米靶向药物载体， 这种载体对 药物的包载为非化学键结合， 其中的亲水片段作为外壳包裹疏。
12、水片段内核形成两亲嵌段共 聚物胶束， 胶束中含有 PEG 亲水嵌段， 因此， 可以保护载体在人体内长循环不被清除。由于 载体中含有肿瘤局部特异性高分泌的酶 ： MMP2/9 的底物肽段， 因此， MMP2/9 可作为载体结 构变化的触发介质。载体在循环到 MMP2/9 高表达的部位时， 便会被 MMP2/9 解离， PEG 段和 PCL 段分离， 使载体的疏水段暴露， 并在肿瘤组织部位聚集， 与周围组织发生作用， 使疏水片 段作为载体所携带的化疗药物在肿瘤组织细胞处释放， 达到靶向释放药物的目的。本发明 制备出的智能型抗肿瘤纳米酶靶向药物载体， 解决了现有化疗药物应用中， 药物在肿瘤组 织分布。
13、不高的缺陷， 减少了化疗药物对人体正常组织和细胞的损害。 0021 本发明利用了肿瘤组织特异性高表达的基质金属蛋白酶 -2/9(Matrixmetallopep tidase-2/9， MMP-2/9， 又称明胶酶、 IV 型胶原酶 ) 的特性， 将 MMP2/9 特异性水解的底物肽 链 ( 下文简称 PEP) 作为载体亲水段和疏水段的连接， 一旦微球到达肿瘤组织， MMP2/9 即可 将该 PEP 水解， 微球形态发生改变， 疏水部分暴露， 使药物得以特异性释放或被肿瘤组织摄 取。对于 MMP2/9 不表达或低表达的组织， 毒性较小。 0022 本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。 附图。
14、说明 0023 图 1- 本发明 MMP2/9 特异性底物肽段序列示意图。 0024 图 2- 本发明中纳米微球水溶液中加入 IV 型胶原酶后的宏观变化示意图。 0025 图3-本发明中纳米微球水溶液中加入不同浓度的IV型胶原酶后的变化示意图。 0026 1.MMP2/9 特异性底物肽段序列 ： H2N-PVGLIG-COOH ； 0027 2. 酶靶向微球和 IV 型胶原酶反应 22 小时后的情况 ： 图 1 中左边仅加入了酶的缓 冲液， 液体为澄清， 并有胶束特有的蓝光 ； 右边加入了 500ug/mL 的 IV 型胶原酶， 液体浑浊， 无胶束特有的蓝光， 并有絮状沉淀。 说 明 书 CN。
15、 101480377 B3/4 页 5 0028 3. 图 2 显示了纳米微球水溶液中， 加入不同浓度的 IV 型胶原酶后的变化， 可以看 出随着时间的变化， 溶液的吸光度逐渐增大， 提示溶液浑浊度增加 ( 即载体团聚、 沉淀 )， IV 型胶原酶浓度越高， 载体形变量越大。 具体实施方式 ： 0029 首先是疏水片段 PCL 的制备及氨基化， 将 -CL， 亮氨酸， 按照设计分子量的比例， 加入反应管， 真空下封管， 160， 搅拌反应 24 小时， 产物溶于二氯甲烷， 除去未反应的小分 子物质， 在冷乙醚中沉淀， 真空干燥， 得到末端羧基化的 PCL， 其反应方程式为 ： 0030 003。
16、1 然后， 进行亲水片段 mPEG 与肽链 (PEP) 的连接。采用特异性对于 MMP2/9 敏感的 肽链(H2N-PVGLIG-COOH， 图1)， 将活化的mPEG-NHS和肽链以11.2的摩尔比溶于DMF(含 2三乙胺 ) 中， 室温下搅拌反应 3 小时。将产物置透析袋， 在纯水中透析 24h 除去溶剂和 小分子物质， 冷冻干燥， 得到 mPEG-PEP。具体反应方程式为 ： 0032 0033 最后进行共聚物的连接， 将 mPEG-PEP 和 PCL-NH2 按照摩尔比 1 1 溶于 DMF 中， 加入 1.5 倍摩尔量的 DMAP， 1.0 倍摩尔量的 EDC， 1.0 倍摩尔量的 。
17、NHS， 室温下反应 18h， 将反 应后液体置于透析袋， 纯水中透析 24h， 冷冻干燥， 即得产物。 0034 将嵌段共聚物按照 50mg/mL 的浓度溶于等体积比的乙醇和丙酮中， 在将所制得的 溶液滴入 25 倍体积的冷纯水中， 减压抽除有机溶剂。嵌段共聚物在水相中自发形成胶束结 构。将溶液冷冻干燥， 即得到载体， 4保存。 0035 嵌段共聚物由于具有亲水和疏水片段， 很容易在水溶液中自发形成胶束， 其疏水 片段互相缠绕， 形成疏水性 “内核” ， 而亲水片段则环绕在外， 形成柔韧的亲水性 “外壳” 。疏 水性内核作为化疗药物的载体为疏水性化疗药物提供了一个稳定的微环境， 亲水性外壳使。
18、 胶束可以稳定地存在于水溶液或体液中。 0036 mPEG 和 PCL 间的连接肽链， 为 MMP2/9 的特异性底物肽段， 可被这两种酶特异性降 解。体外模拟该过程， 在两份同样的微球中， 一份加入了 IV 型胶原酶， 另一份仅加入酶缓冲 液， 反应 22 小时后， 仅加入了酶的缓冲液的一组， 液体为澄清， 并有胶束特有的蓝光 ； 加入 了500ug/mL的IV型胶原酶的一组， 液体浑浊， 无胶束特有的蓝光， 并有絮状沉淀， 提示载体 中的肽链被水解， 载体发生沉积 ( 图 2)。定量考察这一过程， 可以发现， 在微球中加入不同 浓度的IV型胶原酶后， 随着时间的变化， 溶液的吸光度逐渐增大。
19、， 提示溶液浑浊度增加(即 说 明 书 CN 101480377 B4/4 页 6 载体团聚、 沉淀 )， IV 型胶原酶浓度越高， 载体形变量越大 ( 图 3)。 0037 生理条件下， 水分子与聚合物之间， 通过氢键相互作用， 使聚合物呈伸展状态， 高 亲水性， 可溶于水， 因此亲水片段的聚合物所构成的亲水性外壳使胶束稳定地存在于水溶 液或体液中， 保护载体在体内长期循环而不背集体清除 ； 一旦到达肿瘤组织， 局部微环境内 MMP2/9 高表达， 则亲水和疏水片段间的连接被切断， 聚合物疏水基团之间的作用力占优势， 聚合物链皱缩， 水分子从聚合物中被挤出， 聚合物沉淀， 成为高疏水性， 不。
20、溶于水的物质， 所 载化疗药物得以在肿瘤组织处释放。 此外， 聚合物的疏水段暴露， 则更有利于肿瘤细胞对纳 米微球的胞吞， 二者共同使化疗药物在肿瘤组织局部达到高浓度， 避免了化疗药物对人体 正常组织细胞的损害。 0038 载体的粒径范围在 200nm 以下， 有利于在体内长循环而不被清除。 0039 亲水片段采用分子量 5000 的 mPEG， 以利于人体通过肾脏排出体外。 0040 疏水片段采用的是聚己内酯， 为生物可降解材料， 水解后对人体无毒性， 其他具有 想同或类似特性的物质也可采用。 0041 采用本发明制备的药物载体， 可以输送多种治疗肿瘤的化疗药物 ( 例如紫杉 醇， 多希紫杉醇， 阿霉素 )、 中药单体 ( 例如汉防己甲素， 藤黄酸 ) 和分子靶向药物 ( 例如 C-225)。 0042 本发明请求保护的范围不局限于本具体实施方式的说明。 说 明 书 CN 101480377 B1/1 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 。