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1、10申请公布号CN104152578A43申请公布日20141119CN104152578A21申请号201310217682722申请日20130603C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12R1/9320060171申请人中国农业科学院上海兽医研究所地址200241上海市闵行区紫月路518号72发明人童光志周艳君吴玉璐74专利代理机构上海序伦律师事务所31276代理人周东萍54发明名称猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒及其应用57摘要本发明公开一种猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245294位核苷酸序列。
2、缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。本发明基于ORF3基因的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页10申请公布号CN104152578ACN104152578A1/1页21一种猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所。
3、述试剂盒包含针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。2根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述上下游引物的序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。3根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ORF3基因第245294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野毒株对照。4根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含ORF3基因第245294位核苷酸序列发生缺失的。
4、PEDV弱毒疫苗株对照。5根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含RTPCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。6根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述引物的使用浓度为25MMOL/L。7根据权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50。8权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。9权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品。
5、中的应用。权利要求书CN104152578A1/7页3猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒及其应用技术领域0001本发明涉及猪流行性腹泻病毒感染检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒及其应用。背景技术0002猪流行性腹泻病PORCINEEPIDEMICDIARRHEA，PED在欧洲和亚洲一些养猪业发达的国家都曾有相关报道，是一种危害较为严重的传染病。最近两年来在我国部分养猪场再度爆发了以未断奶仔猪发生水样腹泻、呕吐和高死亡率为特征仔猪腹泻疫情，该病以7日龄内仔猪发病为主，病程急、传播迅速、仔猪死亡率高，而且在同一猪场易呈反复发作，曾一度造成部分猪场出现阶段性产房。
6、无仔的严重局面，给养猪业带来了重大的经济损失。在对发生仔猪腹泻疫情的临床样品检测时发现猪流行性腹泻病毒PEDV的阳性检出率很高，推测PEDV是此次腹泻疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首选，韩国、日本等已经将弱毒疫苗用于该病的预防控制，国内也有一些猪场在使用弱毒疫苗，在临床上如何区分疫苗免疫与自然感染毒株，对仔猪腹泻疫情进行有效地预警具有重要意义。0003对于PEDV感染的诊断方法已有多种，如对采集的临床样品进行处理后，利用病毒适应性细胞进行病毒分离的方法；利用免疫胶体金试纸条直接检测样品中的病毒抗原；根据PEDV病毒的保守性内部基因设计引物，利用RTPCR的方法对病毒的基因进行检测等方法。
7、。其中，病毒分离不仅耗时耗力，而且由于该病毒的特性难于细胞上进行分离培养，因此不利于对疫情的及时诊断，后两种方法可以实现对病毒的及时、快速诊断，但是却不能很好的满足对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的需求。PEDV的ORF3基因位于S基因与E基因之间，有研究认为冠状病毒ORF3编码的辅助蛋白具有离子通道的特性与病毒的释放有关，ORF3基因沉默可以降低病毒在VERO细胞上的滴度。发明内容0004本发明要解决目前诊断PEDV感染的方法，不能实现对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的技术问题，提供一种猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，该试剂盒特异性强、灵敏性高，可快速、准确地区分自然感染的。
8、野毒和弱毒疫苗免疫毒株，对于猪流行性腹泻病毒疫情的早期快速诊断、防控、以及流行病学的全面监测具有重要意义。0005为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现0006在本发明的一个方面，提供了一种一种猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含0007针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。0008优选的，所述上下游引物的序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。0009更优选的，所述引物的使用浓度为25MMOL/L。0010所述试剂盒还包含ORF3基因第245294位。
9、核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野说明书CN104152578A2/7页4毒株对照。0011所述试剂盒还包含ORF3基因第245294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒疫苗株对照。0012所述试剂盒还包含RTPCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。0013优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50。0014在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。0015在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。0016本发明基于PEDVORF。
10、3基因的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可应用于猪流行性腹泻病的临床诊断、分子流行病学调查等方面，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。附图说明0017下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。0018图1是本发明实施例1的PEDV流行毒株ORF3基因缺失区域核苷酸序列比较图；0019图2是本发明实施例1的基于ORF3基因序列建立的进化树图；0020图3是本发明实施例2确定RTPCR最佳TM值的结果图；0021图4是本发。
11、明实施例2确定RTPCR最佳引物浓度的结果图；0022图5是本发明实施例3的RTPCR特异性试验结果图；0023图6是本发明实施例4的RTPCR方法敏感性鉴定结果图；0024图7是本发明实施例5临床样品的RTPCR检测结果图。具体实施方式0025下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如分子克隆实验指南萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译分子克隆实验指南，第3版，北京科学出版社，2002中所述的方法进行。0026为了建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒PEDV自然感染与疫苗免疫毒株的方法。本发明根据目前使用的PEDV弱毒疫苗均为ORF3基因存在缺失的毒。
12、株，而能引起自然感染发病的毒株ORF3基因没有发生缺失，研发出一种基于ORF3基因缺失区域的猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断方法与试剂盒。本发明根据GENBANK公布的PEDVORF3基因序列，在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物，对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测，分析流行毒株的ORF3基因，选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RTPCR扩增，优化其反应体系、TM值等条件，进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验，并对大量临床样品进行检测验证。结果是，从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因，序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失，属于自然感染野毒，其与疫苗。
13、株的核苷酸同源性为958971。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基说明书CN104152578A3/7页5因，其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300BP，而弱毒疫苗株则为250BP左右；该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增，其敏感性可达到100TCID50/01ML，对仔猪腹泻临床样品检测结果显示，PEDV自然感染的阳性率为654。因此，本发明基于PEDVORF3基因的RTPCR鉴别诊断方法和试剂盒，可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速、实用的检测方法和检测试剂盒。0027下面通过具体实施例阐述本发。
14、明。0028材料00291毒株与样品来源0030PEDV毒株HLJ1株和ZJCZ4株以及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSVHUN4株、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪轮状病毒PORV、猪瘟病毒CFSV由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室分离保存，11份已知PEDV阳性仔猪腹泻样品由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室鉴定并保存，26份未知仔猪腹泻样品2013年初采集自上海。00312主要试剂0032TAQDNA聚合酶、DNAMARKER、DNTP、PMD18T载体购自TAKARA公司；RNA提取试剂盒RNEASYPLUSMINIKIT购自QIAGEN公司；单链CDNA合成试剂盒REV。
15、ERTAIDTMFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT购自FERMENTAS公司；感受态菌种DH5由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。0033实施例1仔猪腹泻样品的检测与流行毒株ORF3基因序列的分析00341引物设计0035根据PEDVZJCZ4GENBANK序列号JX524137设计并合成一对扩增ORF3全基因引物ORF3P1/ORF3P2。参考PEDVCV777GENBANK序列号AF353511、ZJCZ4及疫苗株DR13GENBANK序列号EU054930的ORF3基因序列，设计并合成了一对鉴定引物ORF3JD1/ORF3JD2，鉴定引物位于ORF3缺失。
16、区245NT294NT两端的保守区，其扩增范围覆盖整个缺失区域。以上两对引物如表1所示，所有引物由上海英骏生物技术有限公司合成。0036表1扩增PEDVORF3基因引物及鉴定引物003700382样品中RNA提取及反转录0039离心处理本实验室采集并保存的仔猪腹泻样品，取PEDV分离株HLJ1株和ZJCZ4株以及处理好的临床样品各300L，按RNEASYPLUSMINIKIT说明书提取病毒RNA。同时根据REVERTAIDTMFIRSTSTRANDCDNASYNTHESISKIT说明书将样品提取的RNA反转录成说明书CN104152578A4/7页6单链CDNA，即提取的样品总的RNA11L，。
17、随机引物OLIGODT1L，5缓冲液4L，RNASE抑制剂20U/L1L，DNTPMIX10MM2L，MMULV反转录酶200U/L1L，CDNA合成后20保存备用。00403临床样品ORF3基因的扩增、克隆与测序0041从本实验室保存的仔猪腹泻样品中挑选出11个PEDV阳性样品ZZ1，HEB1，FQ15，QZ14，SD2，SD4，SD5，SDXY7B，BJ26，ZJ2，ZJ3，利用ORF3P1/P2引物扩增、克隆ORF3基因，并由INVITROGEN公司测序。应用MEGA41软件，对以上样品毒株的ORF3基因与GENBANK上已发表的PEDVORF3基因参考序列进行比较分析参考株见表2。00。
18、42表2用于ORF3基因序列分析的12个PEDV参考毒株名称和来源0043分离株名称登录号来源CV777AF353511英国分离株首次分离株CV777GU372744中国弱毒疫苗株DR13JQ023161韩国分离株DR13EU054930DR13株致弱株CHINJU99AF237764韩国分离株DBI865GU937797韩国弱毒疫苗株CH/SJN547228中国分离株LZCEF185992中国分离株CH/FJND3/2011JQ282909中国分离株现在流行株ZJCZ4JX524137中国分离株现在流行株AHYSJX910248中国分离株JSTS2010KC161198中国分离株00444结。
19、果流行毒株ORF3基因序列分析0045本发明克隆获得了11份PEDV阳性样品的ORF3基因，测序后运用MEGA41分析了11个样品的ORF3基因序列，结果显示与表2中列出的GENBANK提供的参考序列相比较，11份样品中有9个流行毒株在ORF3基因中没发生基因缺失，另外2株HEB1与SD5则在245NT293NT之间均存在49个碱基的缺失如图1所示，9株未缺失的流行株与现在流行株CHFJND2011JQ282909的核苷酸同源性为966991，与疫苗株DR13EU054930的核苷酸同源性为958971。系统发育树分析表明，9个毒株与我国现在流行株CHFJND2011株以及我国分离株CH/SJ。
20、N547228和韩国分离株说明书CN104152578A5/7页7DR13JQ023161亲缘关系较近，共处于同一分枝，而SD5和HEB1则分别与我国的弱毒疫苗株CV777GU372744以及韩国弱毒疫苗株DR13EU054930和DBI8659GU937797的亲缘关系较近见图2。图2中，“”为本发明获得的毒株序列。0046实施例2RTPCR反应条件的优化00471鉴别诊断RTPCR扩增及最佳TM值的确定0048利用鉴定引物ORF3JD1/JD2对HLJ1株和ZJCZ4株的CDNA进行PCR扩增。PCR反应总体积20L，内含10PCR缓冲液2L、DNTP25MMOL/L15L、上下游引物各0。
21、5L、RTAQDNA聚合酶05L、CDNA2L，加水至20L。PCR程序为95预变性5MIN；94变性1MIN，退火30S，72延伸30S，共进行35个循环；最后72延伸10MIN。其中PCR退火温度设5个梯度，分别是45、48、50、52、55。获得的PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳观察。00492RTPCR最佳引物浓度的确定0050在上述反应条件的基础上，将上、下游鉴定引物浓度分为25MMOL/L、5MMOL/L、25MMOL/L、05MMOL/L、025MMOL/L等5个不同浓度分别进行RTPCR扩增，其PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳观察。00513结果0052分别以ZJCZ4株、HLJ1株为。
22、模板，对RTPCRTM值、引物浓度等反应条件进行优化，结果显示鉴别诊断RTPCR反应体系为20L时模板CDNA2L，10PCR缓冲液2L，DNTP25MMOL/L15L，上、下游引物25MMOL/L各05L，RTAQDNA聚合酶05L，DDH2O13L；反应条件为95/5MIN，94/1MIN，50/30S，72/30S，进行35个循环；最后72/10MIN见图3、图4。图3中，MMAKERDL2000；16以ZJCZ4株为模板，依次为45，48，50，52，55，58；712以HLJ1株为模板，依次为45，48，50，52，55，58；13阴性对照。图4中，MMAKERDL2000；15以Z。
23、JCZ4株为模板；依次为25、5、25、05、025MMOL/L；610以HLJ1株为模板；依次为25、5、25、05、025MMOL/L；11阴性对照。0053实施例3RTPCR特异性鉴定试验0054分别提取本实验室保存的TGEV、PORV、PRRSVHUN4株、CSFV和PEDVHLJ1株和ZJCZ4株的RNA，利用ORF3JD1/JD2引物，进行RTPCR扩增特异性的验证。0055结果显示，只有ZJCZ4株和HLJ1株可以扩增出大小不一的特异性条带，大小分别约为300BP和250BP，而以其它病毒核酸为模板没有特异性条带出现见图5。图5中，MMAKERDL2000；1TGEV；2PORV。
24、；3PRRSVHUN4株；4CSFV；5HLJ1株；6ZJCZ4株；7阴性对照。0056实施例4RTPCR敏感性试验0057将病毒效价已知的PEDVHLJ1株悬液106TCID50/01ML进行10倍倍比稀释，按照实施例1所述的方法提取病毒RNA并反转录，利用ORF3JD1/JD2引物进行RTPCR，检测其敏感性。0058结果显示，该方法最低可以检测出100TCID50/01ML见图6。图6中，MMARKERDL2000；18106TCID5001TCID50，9HLI1对照，10ZJCZ4对照；11阴性对照。0059实施例5猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒的组成及应用该试剂盒对临说明。
25、书CN104152578A6/7页8床样品进行RTPCR检测00601、试剂盒的组成0061将SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的ORF3JD1/JD2引物对、ORF3基因中没发生基因片段缺失的PEDV野毒株对照、ORF3基因中存在基因片段缺失的PEDV弱毒疫苗株对照、RTPCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。00622、本发明试剂盒的应用0063取11份20112012年间已知PEDV阳性样品和2013年初采集的26份未知的仔猪腹泻样品分别经离心处理后，提取样品中的总RNA，利用上述RTPCR鉴别诊断试剂盒进行检测和结果分析。0064对11份已知PED。
26、V阳性的临床样品和26份未知样品进行RTPCR鉴别扩增，结果显示11份样品与此前检测的结果符合率为100，其中11份样品中除了位于9、13泳道的SD5和HEB1这2个样品的扩增片段为250BP外，其它泳道的9个样品的扩增片段大小均一致约为300BP见图7A。对26份未知仔猪腹泻样品检测检测结果显示有17份样品为PEDV阳性，且扩增片段大小与阳性对照ZJCZ4株大小一致见图7B。图7A中MMAKERDL2000；13FQ15，ZZ1，QZ14；4、17ZJCZ4阳性对照；5、16HJL1阳性对照；6、15阴性对照；714SD2，SD4，SD5，SDXY7B，ZJ2，ZJ3，HEB1，BJ26。图。
27、7B1、17ZJCZ4阳性对照；16、32HJL1阳性对照；15、31阴性对照；214SH1SH13；1830SH1426。0065以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。0066序列表0067中国农业科学院上海兽医研究所0068猪流行性腹泻病毒RTPCR鉴别诊断试剂盒及其应用006940070PATENTINVERSION33007110072180073。
28、DNA0074人工序列00750076MISC_FEATURE00771180078引物007910080ATGTTTCTTGGACTTTTT18008120082180083DNA说明书CN104152578A7/7页90084人工序列00850086MISC_FEATURE00871180088引物008920090TCATTCACTAATTGTAGC18009130092200093DNA0094人工序列00950096MISC_FEATURE00971200098引物009930100GACCACTGTTTAAAGCGTCT20010140102200103DNA0104人工序列01050106MISC_FEATURE01071200108引物010940110GCTCAAAAGTGATGTAATGG20说明书CN104152578A1/4页10图1说明书附图CN104152578A102/4页11图2图3说明书附图CN104152578A113/4页12图4图5图6说明书附图CN104152578A124/4页13图7说明书附图CN104152578A13。