发明背景
末梢B细胞瘤慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤代表了 最常见的淋巴细胞性白血病。顾名思义，其可以表示为白血病或淋巴 瘤。然而，关于该瘤的两种表现：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和小 淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)在形态学上、显型上以及遗传型上很难区分， 唯一差别在于外周血液淋巴细胞的程度。
CLL是西方国家成年人最常见的白血病。在CLL中，外周血液包 含缺乏细胞质的小而圆的淋巴细胞。在所有采取小淋巴细胞的空隙渗 透形式或非类结核(nonparatubular)聚集形式的CLL和多数SLL的情 形中，都已经观察到骨髓紊乱。CLL和SLL中的肿瘤细胞表达pan B 细胞标记物CD29和CD20。此外，CD5，一种仅仅在在正常B细胞的小 亚型上表达的T细胞标记物，存在于该肿瘤细胞上。CLL细胞的免疫显 型是唯一的。CLL细胞共同表达B淋巴细胞谱系标记物CD19和T淋 巴细胞标记物CD5。CLL细胞还显示出特征水平的免疫球蛋白受体的 表达。通常，肿瘤细胞还具有对带有κ或λ轻链的Ig重链的低水平的 表面表达。
CLL为B淋巴细胞的无性系恶性肿瘤。该疾病通常无痛，并带有 长命的小淋巴细胞(其对抗原刺激缺乏免疫竞争和应答)缓慢的逐渐 累积。CLL不能用常规的细胞毒素化学疗法来治愈(Cheson等，Blood 1996；87：4990-4997；和Keating等，Blood 1993；81：2878-2884)。 CLL的标志是孤立的淋巴细胞增多。白血球量通常大于20,000/μL并可 能显著地升高到几十万。CLL的诊断要求淋巴细胞绝对量大于 4000/mm3。CLL临床表现为淋巴细胞的免疫抑制、骨髓衰竭和器官浸 透。免疫缺陷还涉及由异常B细胞产生的不充分的抗体。随着疾病的 发展，CLL可以通过直接组织渗透而造成损伤。
在某些情况下，患者可以产生皮肤淋巴瘤沉淀-皮肤上的红斑损 伤。该损伤可以包括小而圆的B细胞的非典型淋巴表皮渗透。
概述
已经发现某些小分子免疫应答调节剂(IRMs)具有提高CD5+B 细胞淋巴瘤细胞表面分子表达的用途。因此，某些IRMs可以用于治疗 CD5+B细胞淋巴瘤，例如，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细 胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤或具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤。
因此，本发明提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的方法。通常，该 方法包括对患者给服能有效改善CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种症状或 临床信号的量的IRM化合物。在一些具体实例中，服用IRM化合物可 以导致在两个月内外周血淋巴细胞、淋巴结病或脾肿大减少至少50％。 在另外的具体实例中，给药IRM化合物可以抑制以至预防进行性疾病 的发展，其中进行性疾病(表现)为淋巴细胞循环至少提高50％或发 展至更显著的阶段。在又一个具体实例中，给服IRM化合物可以解决 与CD5+B细胞淋巴瘤相关的结节状的红斑损伤。
另一方面，本发明提供一种提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细 胞表面分子表达的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细 胞与至少一种可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子 表达的IRM接触。在一些具体实例中，该细胞表面分子可以是共同刺 激的分子。
另一方面，本发明还提供一种刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以产生 细胞因子的方法，其通过将CD5+B细胞淋巴瘤细胞与能够有效诱导产 生比由未接触IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞所产生的水平更高水平 细胞因子的IRM接触。在一些具体实例中，细胞因子可以是IL-1β、IL-6、 IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、GM-CSF或其组合。
另一方面，本发明提供一种提高CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒 性T细胞增殖的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞 与可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一种共刺激分子的 表达的IRM接触，随后将CD8+T细胞与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接 触，从而活化CD8+T细胞；其中该活化的T细胞为CD5+B细胞淋巴 瘤特异性细胞毒性T细胞，且与CD5+B细胞淋巴瘤细胞(没有和IRM 接触)接触的T细胞相比，证明可以提高增殖。
在一些具体实例中，CD8+T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异 性的。在其他具体实例中，CD8+T细胞为幼稚细胞。
在一些具体实例中，IRM化合物对被诊断为具有CD5+B细胞淋 巴瘤的患者给药，因此活化的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细 胞为自体同源性的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞。
在一些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂(例如 IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明还提供一种通过细胞毒性T细胞提高杀灭CD5+B细胞淋巴瘤细胞的方法。通常，该方法包括将CD5+B细胞淋巴瘤的 细胞与能够有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一种共刺激 分子表达的IRM接触，随后将CD8+T细胞与CD5+B细胞淋巴瘤的细 胞接触，从而活化CD8+T细胞；其中该活化的T细胞为CD5+B细胞 淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞，且和未与IRM接触的CD5+B细胞淋 巴瘤的细胞接触的T细胞相比，显示出提高了的CD5+B细胞淋巴瘤细 胞的杀灭。
在一些具体实例中，CD8+T细胞为CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异 性的。在其他具体实例中，CD8+T细胞为幼稚细胞。
在一些具体实例中，IRM化合物对被诊断为具有CD5+B细胞淋 巴瘤的患者给药，从而活化的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细 胞为自体同源的CD5+B细胞淋巴瘤特异性细胞毒性T细胞。
在一些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂(例如 IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤细胞。
另一方面，本发明还提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤患者的方 法，包括对患者给服可以有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞 表面分子表达的IRM。
另一方面，本发明还提供一种疫苗，其包含分离的CD5+B细胞淋 巴瘤细胞或其免疫活性部分，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已 经与可有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子表达的 IRM接触。在某些具体实例中，可以用一种或多种其他的免疫调节剂 (例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触CD5+B细胞淋巴瘤 细胞剂。
另一方面，本发明还提供一种制备疫苗的方法，包括用IRM接触 分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞，以有效提高CD5+B细胞淋巴瘤的至 少一种细胞表面分子的表达。一些具体实例可以包括用一种或多种其 他的免疫调节剂(例如IL-2和/或蛋白激酶C激动剂)进一步接触分离 的CD5+B细胞淋巴瘤细胞。在另外的具体实例中，该分离的CD5+B 细胞淋巴瘤细胞可以来源于被诊断为CLL或SLL的患者。
在一些具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以是慢性淋巴细胞 性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)细胞、套细胞淋 巴瘤细胞、具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤或其组合。
在一些具体实例中，IRM是TLR7激动剂。在一些具体实例中， IRM是TLR8激动剂。在一些具体实例中，IRM是TLR7和TLR8两者 的激动剂。
在一些具体实例中，IRM可以是咪唑并喹啉胺、四氢咪唑并喹啉 胺、咪唑并吡啶胺、1，2-桥接咪唑并喹啉胺、6，7-稠合环烷基咪唑并吡 啶胺、咪唑并萘啶胺、四氢咪唑并萘啶胺、噁唑喹啉胺、噻唑喹啉胺、 噁唑吡啶胺、噻唑吡啶胺、噁唑萘啶胺或噻唑萘啶胺。在某些具体实 例中，IRM为咪唑并喹啉胺，例如1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c] 喹啉-4-胺基。在另外的具体实例中，IRM为四氢咪唑并喹啉胺，例如 4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹 啉-1-乙醇水合物。在另外的具体实例中，IRM为磺酰胺取代的咪唑并 喹啉胺，例如N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基] 甲烷磺酰胺。
在一些具体实例中，表达提高的至少一种细胞表面分子可以是 CD20、CD22或CD23，且该方法进一步包括用治疗剂(其具有提高表 达的细胞表面分子的靶点)对患者给药。在一些具体实例中，可以提 高超过一种细胞表面分子的表达。
在一些具体实例中，表达提高的至少一种共刺激分子可以是 CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、CD25或CD38。在一些具体实 例中，可以提高超过一种共刺激分子的表达。
在一些具体实例中，IRM可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细 胞接触。在另外的具体实例中，IRM可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤 的细胞接触，例如在患者的器官、组织或血液。
比照以下详细说明、实施例、权利要求和附图将很容易明白本发 明的其它多种特性和优点。在整个详细说明的多处由实施例的列表提 供引导。在每个实例中，所列举的列表仅作为代表性的组，并不作为 唯一的列表。
附图说明
图1A-B：通过IRM化合物提高CLL细胞上共刺激分子的表达。
图2A-C：IRM1化合物(有或者没有IL-2)在由CLL细胞表达的 共刺激分子上的效果。
图3A-B：IRM化合物在CLL细胞刺激细胞毒性T细胞增殖效率 上的效果。
图4A-C：在CLL细胞表达的共刺激分子上IRM化合物、IL-2 和PKC激动剂的效果。
图5A-B：通过PKC激动剂、IL-2和IRM诱导T细胞细胞毒性抵 抗自体同源的CLL细胞。
图6A-B：淋巴瘤的皮肤沉淀在治疗前(图6a)和用IRM治疗后 (图6b)的照片。
图7：IRM1在由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
图8A-B：IRM3对于由CLL细胞表达的CD80和CD83上的效果。
图9：在CLL细胞表面分子表达中，IRM3介导的改变。
图10：IRM3+IL-2提高在CLL细胞上CD20的表达。
实施方式
本发明提供一种治疗CD5+B细胞淋巴瘤的方法，例如慢性淋巴细 胞性白血病(CLL)。尽管大量临床观察表明CD5+B细胞淋巴瘤细胞 可以受到T细胞介导的调节免疫识别的影响(参见例如Ribera等Blood Cells 1987；12：471-483；Ziegler-Heitbrock等Blood 1989；73：1426-1430； Wierda等Blood 2000；96：2917-2924；Gitelson等Clin Cancer Res. 2003；99：1656-1665；和Pavletic等Bone Marrow Transplant 2000；25： 717-722)，CD5+B细胞淋巴瘤细胞的弱免疫原性已经限制了基于免疫 治疗方法的发展，并因此促进了疾病发展。
本发明第一次证明将CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与免疫应答调节 剂(IRM)化合物接触可以用于治疗CD5+B细胞淋巴瘤。IRM化合物 似乎由基础免疫系统机制(通称Toll状受体(TLRs))引起某些细胞因 子、趋化因子和共刺激分子选择的生物合成。因此，某些IRM化合物 可以选择性地诱导免疫系统的某些方面或一致免疫系统的其它方面。 特别是，IRM化合物可以提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面分子表达、 增强CD5+B细胞淋巴瘤的细胞免疫原性，并提供一种治疗CD5+B细 胞淋巴瘤的新的免疫治疗方法。在某些情况下，该提高表达的细胞表 面分子可以是共刺激分子。提高共刺激分子的细胞表面的表达可以使 CD5+B细胞淋巴瘤细胞变成有效的抗原递呈细胞(APCs)，并能引发 和/或保持瘤反应性的T细胞活性。
在此使用的以下术语具有下列意义：
“改善”是指表示具体病症的程度、严重性、发生频度和/或症状或 临床征象可能性的任何减少。
“CD5+B细胞淋巴瘤细胞”是指具有独特免疫显型的赘生性细胞， 包括CD19和CD5的共同表达。除表达B淋巴细胞谱系标记物CD19 之外，CD5+B细胞淋巴瘤细胞还表达T淋巴细胞标记物CD5，其通常 仅表达正常B细胞的一个小亚类。CD5+B细胞淋巴瘤细胞包括例如慢 性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)细胞、 套细胞淋巴瘤细胞和具有绒状淋巴细胞的脾淋巴瘤。在一些具体实例 中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞是CLL细胞或SLL细胞。在某些特定的 具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤细胞是CLL细胞。
“细胞表面分子”是指一种分子，其在细胞表面上表达并可以用来 测定该细胞的谱系或用来区别细胞或与其它细胞的类型。
“病者”或“患者”包括例如动物，例如但不限于人类、非人类灵长 类、啮齿类、犬、猫、马、猪、绵羊、山羊或牛。
“病征”或“临床征象”是指与能够被除该患者外的个体发现的特定 状况相关的客观物理发现。
“症状”是指疾病或患者状况的任何主观证据。
除非另作说明、“一种”、“一个”、“该”和“至少一个”可交替使用并 且意思是一个或更多个。
某些IRM化合物(例如TLR7和/或TLR8的激动剂)可以提高提 高CD5+B细胞淋巴瘤的大量细胞表面分子(包括例如，共刺激分子) 的表达，这能导致更有效提高抗CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫反应。 因此，提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面分子的表达可以用于治疗减缓 或终止该疾病的发展。在某些具体实例中，治疗可以逆转该疾病的病 程，在某些情形中甚至达到完全解决的程度，即治愈该疾病。
除具有治疗效用外，已提高一种或多种共刺激分子和/或其它细胞 表面分子的表达的CD5+B细胞淋巴瘤细胞可以具有诊断或研究的效 用。
在幼稚T细胞中诱导细胞增殖和产生细胞因子需要两个信号。第 一信号是外来抗原，其通过存在于抗原递呈细胞(APC)的表面的自身 主要组织相容性复合体(MHC)。抗原肽-MHC复合体在幼稚T细胞表 面与T细胞受体(TCR)相互作用，从而对免疫反应提供特异性抗原。 第二信号是“共同刺激”信号。共同刺激信号是抗原非依赖性的，并通过 促进例如T细胞存活、无性系膨胀、细胞因子分泌和效应物功能的特 异性受体-配体相互作用由APC提供给幼稚T细胞细胞因子。
在两个信号的共同存在下，可以产生一个适合的免疫应答。然而， 在缺乏共同刺激信号的情况下，淋巴细胞可能无法对抗原刺激有效应 答。免疫系统的这种无应答可以导致免疫耐受性。
因此，此处使用的“共刺激分子”是指细胞表面分子亚类的一员， (除介绍的MHCI分子外)，以产生生产性的免疫反应，但其表达不足 以独立地产生生产性的免疫反应。共刺激分子的实例包括但不局限于 B7族成员(包括例如，B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS-L(B7RP1) 和PDL-1)、Ig超级族的其它分子(包括例如，CD2和OX2)、缺乏死 亡域的TNF:TNFR亚族分子(包括例如，CD40、OX40、CD27、4-1BB 和CD30)和一些整联蛋白(包括例如，VLA-4、ICAM-1和ICAM-3)。
可以使用很多已知的方法提高一种或多种细胞表面分子的表达， 包括在此描述的任何方法。例如，该方法包括但不局限于，流式细胞 术、免疫组织相容、逆录酶聚合酶连锁反应(RT-PCR)包括连续变异 RT-PCR、和RNA印迹分析。
在一些具体实例中，可以刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以提高 CD20、CD22、CD23、CD25、CD38、CD40、CD54、CD80、CD83或 CD86中一种或多种的表达。
在某些的具体实例中，可以刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以提高治 疗剂靶点的细胞表面分子的表达，治疗剂例如为与细胞表面分子特异 性结合的单克隆抗体。这样，提高细胞表面分子的表达可以用于靶点 是细胞表面分子的治疗。例如，Rituximab(美罗华)是一种以单CD20 为靶点的单克隆抗体，并已经证明有效治疗非霍奇金淋巴瘤。Rituximab 结合表达CD20的B细胞，从而表记那些用于通过免疫系统消除的 Rituximab标记的细胞。因此，一种治疗包括，例如(a)提高CD5+B 细胞淋巴瘤细胞上的CD20的表达，以及随后(b)给服Rituximab可 使得Rituximab与CD5+B细胞淋巴瘤细胞粘合，从而对用于通过免疫 系统消除的CD5+B细胞淋巴瘤进行标记，并从而使得Rituximab能够 有效治疗CD5+B细胞淋巴瘤。其它在CD5+B细胞淋巴瘤细胞中提高 表达且可以作为治疗剂靶点的细胞表面分子包括例如CD22和CD23。
在一些具体实例中，可以通过将CD5+B细胞淋巴瘤细胞与能够有 效产生大于没有接触IRM的CD5+B细胞淋巴瘤细胞所产生的细因子 的IRM接触，刺激CD5+B细胞淋巴瘤细胞以产生细胞因子。在一些 具体实例中，IRM化合物可以是一种或多种TLRs激动剂，例如TLR7 激动剂、TLR8激动剂或TLR7和TLR8激动剂。产生的细胞因子可以 包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α、GM-CSF和 其组合。
在一些具体实例中，IRM化合物可以在体外与CD5+B细胞淋巴 瘤的细胞接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，IRM化合 物可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴 瘤细胞和IRM化合物在器官、组织或血液里接触。在此情况下，可以 通过例如给对被诊断为CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服IRM化合物， 可以使CD5+B细胞淋巴瘤的细胞在患者体内与IRM化合物接触。直 接给患者给服IRM使得CD5+B细胞淋巴瘤细胞在与IRM接触之后， 活化自体同源的T细胞(即患者自身的T细胞)，从而产生对抗CD5+B 细胞淋巴瘤的细胞的T细胞依赖性的免疫反应。通过使用患者自身T 细胞群产生对CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫反应，也许可以减少甚至 消除与涉及给服异源的生物试样治疗相关的某些风险(例如炎症、排 异等)。
IRM化合物可以经由任何合适的方法给药，包括例如，非肠道给 药、皮下给药、鼻内给药和口服。下面详细描述了IRM化合物给药的 合适的制剂。
在一些具体实例中，可以给患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服临 床有效量的、可有效提高在CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面上的至少一 种共刺激分子表达的IRM。此处使用的“临床有效量”是显示出一种或 多种临床迹象有效改善的量。该临床改善迹象可以包括任何用于医疗 实践或实验室研究的度量。参考，例如Cheson等，National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia：revised guidelines for diagnosis and treatment.Blood.1996；87： 4990-4997。例如，临床有效量可以是得到部分反应(PR)的有效量。 此处使用的“部分反应”是至少两个月，外周血淋巴细胞、淋巴结病和/ 或脾肿大减少至少约50％。临床有效量可以是得到完全反应(CR)的 有效量。此处使用的“完全反应”指没有检查出白血病或淋巴瘤细胞。临 床有效量可以是预防进行性疾病(PD)的有效量。此处使用的“进行性 疾病”指通过已知的病理标准测定的淋巴细胞循环至少提高约50％或 组织发展为更加严重性的。临床有效量可以是提高长期生存可能性或 程度的有效量。可选择地，临床有效量可以是减少或改善至少一种与 CD5+B细胞淋巴瘤相关的症状或临床征象的量。例如，临床有效量可 以是足以减少严重性、程度或皮肤淋巴瘤沉淀的数量的量。
在一些具体实例中，用CD5+B细胞淋巴瘤细胞接触一种或多种 IRMs的效果可以通过用一种或多种另外的免疫调节剂进一步接触 CD5+B细胞淋巴瘤细胞来增强。在这种具体实例中，IRM与一种或多 种另外的免疫调节剂可以是一种组合，例如一种治疗的组合。如果该 成分以这样的形式提供：允许CD5+B细胞淋巴瘤细胞与一个成分接触 的生物效应持续不变至少直到该CD5+B细胞淋巴瘤细胞与另一个成分 接触，则该组合的成分据信可以彼此“组合”的方式递送。因此，即使该 成分以单独的制剂提供、经由不同的给药途径传递和/或不同时期给药， 它们也可以彼此结合递送。
适合的免疫调节药剂可以包括，例如：白介素-2(“IL-2”)。IL-2 是一种抗原刺激T淋巴细胞的生长因子，并在抗原识别后导致T细胞 无性系膨胀。IL-2可以从许多已知的来源获得。例如，临床级IL-2可 以商业购买，例如从ChironCorporation，San Francisco，CA购买。
在一些具体实例中，IL-2可以在体外与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞 接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，IL-2可以在体内与 CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴瘤细胞和IL-2在 器官、组织或血液里接触。在此情况下，例如用IL-2对患有CD5+B细 胞淋巴瘤的患者给药，可以使IL-2在患者体内与CD5+B细胞淋巴瘤的 细胞接触。IL-2可以经由任何合适的方法给药，包括例如，非肠道、 皮下、鼻内和口服。下面详细描写给药了IL-2的合适的制剂。
用于任何具体实例的IL-2的精确量可以根据该领域已知的因素来 改变，包括但不限于，IL-2的物理和化学性质、与IL-2组合提供的IRM 或IRMs的物理和化学性质、预期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例 如抑制的、失能的、刺激的)、PKC激动剂给药方法、是否有任何其它 免疫调节药剂与PKC激动剂联合给药、以及所给药的物种。因此，指 定PKC激动剂所有可能的有效量通常是不切实际的。然而，本领域熟 练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适用量。 例如，IL-2可以根据类似与这样的(Rosenberg等通过给服IL-2以治疗 黑素瘤和肾细胞恶性肿瘤)步骤对患者给药。Rosenberg等，JAMA， 1994；271：907-913。
另一个适合的免疫调节药剂可以包括，例如蛋白激酶C(PKC) 激动剂。PKC激动剂的实例包括但不限于佛波醇酯(Totterman等， Nature，1980；288：176-178)和苔藓虫素(bryostatin)-1(Drexler 等，Blood，1989；74：1747-1757)。淋巴瘤细胞表面分子的生理性配 体通过由细胞表面分子的诱导信号转导还可以作为PKC激动剂，并导 致蛋白质的PKC族成员的活化。例如，抗淋巴瘤细胞表面某些分子的 抗体还可以作为PKC激动剂。该抗体包括，例如抗MHC I级分子的抗 体和表面Ig抗体。
在一些具体实例中，PKC激动剂可以在体外与CD5+B细胞淋巴 瘤的细胞接触，例如在细胞培养中。在另外的具体实例中，PKC激动 剂可以在体内与CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触，即CD5+B细胞淋巴 瘤细胞和PKC激动剂在器官、组织或血液里接触。在此情况下，例如 给患有CD5+B细胞淋巴瘤的患者给服PKC激动剂，可使PKC激动剂 与患者的CD5+B细胞淋巴瘤的细胞接触。PKC激动剂可以经由任何合 适的方法给药，包括例如，非肠道给药、皮下给药、鼻内给药和口服。 下面详细描述了PKC激动剂给药的合适的制剂。
用于任何一个具体实例的PKC激动剂的精确量可以根据该领域已 知的因素来改变，包括但不限于，PKC激动剂的物理和化学性质、与 PKC激动剂组合提供的IRM或IRMs的物理和化学性质、预期的剂量 服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、PKC激 动剂的给药方法、是否有任何其它免疫调节药剂正在结合PKC激动剂 给药、以及所给药的制剂种类。因此，指定PKC激动剂所有可能的有 效量通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑 这些因素后可以很容易决定其合适用量。
在某些具体实例中，CD5+B细胞淋巴瘤的细胞可以与(a)一种 或多种IRMs接触，以有效提高至少一个共同刺激分子的表达，(b)IL-2 和(c)PKC激动剂接触。当CD5+B细胞淋巴瘤的细胞与IRM、IL-2 和PKC激动剂的组合接触时，可以以包含该成分的单个制剂提供该组 合的每个成分。可选则地，由两种或多种制剂提供该组合，其每个可 以单独包含(或连同其它一个或其它两个)该组合的成分。如果用多 种制剂提供该组合，该多种制剂可以为相似的或不同的组合物。此外， 每个制剂可以为相似或不同的形式(例如气雾剂、凝胶剂、霜剂、溶 液等)并可以经由相似或不同的给药途径(例如注射、皮下、静脉内)。 同时，如果用多种制剂提供该组合的成分，CD5+B细胞淋巴瘤的细胞 可以以任何次序接触该多种成分。
在一些具体实例中，提高CD5+B细胞淋巴瘤的细胞表面的至少一 种共刺激分子的表达的结果可以包括提高增殖(即膨胀)CD5+B细胞 淋巴瘤细胞特异性(下文“淋巴瘤细胞特异性”)细胞毒性T细胞 (CTLs)。用已经提高共刺激分子的表面表达的CD5+B细胞淋巴瘤细 胞接触淋巴瘤细胞特异性CD8+T细胞得到淋巴瘤细胞特异性CTLs的 增殖。可以通过任何适合的方法(包括例如一种或多种以上描述的方 法)提高CD5+B细胞淋巴瘤细胞表面的共刺激分子的表达。
在一些具体实例中，CD8+T细胞是CD5+B细胞淋巴瘤细胞特异 性的，即，CD5+B细胞淋巴瘤细胞对CD8+T细胞或CD8+T细胞后代 特异性抗原已经预先存在。在其他具体实例中，CD8+T细胞是幼稚的， 即，对CD8+T细胞或CD8+T细胞后代没有预先的抗原(CD5+B细胞 淋巴瘤特异性或相反的)。
与用CD5+B细胞淋巴瘤细胞(其不显示提高一种或多种共刺激分 子的表达)接触的活化淋巴瘤细胞特异性CTLs相比，用CD5+B细胞 淋巴瘤细胞(已经提高至少一种共刺激分子的表达)接触的活化淋巴 瘤细胞特异性CTLs可以显示例如更大的增殖。
另一方面，本发明还提供疫苗、制备疫苗的方法和通过疫苗给药 对患者进行治疗的方法。该疫苗包括分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞或 其免疫活性部分，其中该分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞已经与可有效 提高CD5+B细胞淋巴瘤的至少一种细胞表面分子的表达的IRM接触。 分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞也可以和IL-2、PKC激动剂或IL-2与 PKC激动剂的组合接触。CD5+B细胞淋巴瘤细胞的免疫活性部分可以 包括但不局限于，来自分离的CD5+B细胞淋巴瘤细胞的蛋白质标本和 /或细胞膜制剂。因此，例如膜制剂可以包括来自CD5+B细胞淋巴瘤细 胞和例如蛋白质嵌入其中的细胞膜部分。可以根据制备基于细胞免疫 的多种方法来制备疫苗。例如，可以使用类似于用于制备基于细胞疫 苗抗黑素瘤(参考例如Wu等，J Interferon Cytokine Res.2001 Dec；21 (12)：1117-27)、肾癌细胞(参考例如Vieweg等，Urol.Clin.North Am. 2003 Aug；30(3)：633-43)或脑肿瘤(参考例如Fecci等，J.Neurooncol. 2003 Aug-Sep；64(1-2)：161-76)的方法。
IRMs包括具有有效的免疫调制活性(包括但不限于抗病毒和抗癌 活性)的化合物。某些IRMs调节细胞因子的产生和分泌。例如某些IRM 化合物诱导细胞因子的产生和分泌，例如，I类干扰素、TNF-α、IL-1、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、MIP-1和/或MCP-1。作为另一个实例，某 些IRM化合物可以抑制某些TH2细胞因子的产生和分泌，例如IL-4、 IL-5。此外，据报道一些IRM化合物抑制IL-1和TNF(美国专利US 6,518,265)。
某些IRMs为小的有机分子(相对于大的生物分子例如蛋白质、 肽等的例如分子量小于约1000道尔顿，优选小于约500道尔顿)例如 公布于美国专利US 4,689,338；4,929,624；4,988,815；5,037,986； 5,175,296；5,238,944；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784； 5,367,076；5,389,640；5,395,937；5,446,153；5,482,936；5,693,811； 5,741,908；5,756,747；5,939,090；6,039,969；6,083,505；6,110,929； 6,194,425；6,245,776；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064； 6,541,485；6,545,016；6,545,017；6,558,951；6,573,273；6,656,938； 6,660,735；6,660,747；6,664,260；6,664,264；6,664,265；6,667,312； 6,670,372；6,677,347；6,677,348；6,677,349；6,683,088；6,756,382； 欧洲专利EP 0 394 026；美国专利申请公开文本US 2002/0016332； 2002/0055517；2002/0110840；2003/0133913；2003/0199538和 2004/0014779；和国际专利公开文本WO 01/74343；WO 02/46749；WO 02/102377；WO 03/020889；WO 03/043572；WO 03/045391；WO 03/103584和WO 04/058759。
小分子IRMs的其他的实例包括某些嘌呤衍生物(例如美国专利 6,376,501和6,028,076中描述的)、某些咪唑并喹啉酰胺衍生物(例如 美国专利6,069,149中描述的)、某些咪唑并并吡啶衍生物(例如美国 专利6,518,265中描述的)、某些苯并咪唑并衍生物(例如美国专利6, 387,938中描述的)、某些4-胺基嘧啶稠合五元含氮杂环的衍生物(例 如在美国专利6,376,501；6,028,076和6,329,381和国际专利公开文 本WO 02/08905中描述的腺嘌呤衍生物)和某些3-β-D-呋喃核糖基噻 唑并[4，5-d]嘧啶衍生物(例如美国公开2003/0199461中描述的)。
其它IRMs包括大的生物分子，例如低聚核苷酸序列。例如在美 国专利6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068和6,406,705中 描述的一些IRM低聚核苷酸序列包括胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)。 例如美国专利6,426,334和6,476,000中描述的一些含低聚核苷酸的 CpG可以包括合成的免疫调节剂构造图式。例如国际专利公开文本WO 00/75304中描述的其它缺乏CpG的IRM核苷酸序列序列。
例如美国专利6,113,918；6,303,347；6,525,028和6,649,172中 描述的其它IRMs包括生物分子，例如氨烷基氨基葡糖苷磷酸(AGPs)。
可以用任何合适的IRM化合物实施本发明。除非另有说明，所涉 及的化合物可以包括该化合物任何药物可接受的形式，包括任何异构 体(例如非对映体或对映体)、盐、溶剂化物、多晶型物等。特别是， 如果化合物是旋光性的，该化合物所涉及的可以包括每个该化合物的 对映体以及该对映体的外消旋混合物。
在一些具体实例中，适合的IRM化合物可以是，例如上述之一的 小分子IRM化合物。适合的小分子IRM化合物包括含有2-胺基吡啶稠 合到五元含氮杂环的化合物，例如咪唑并喹啉胺包括但不限于酰胺取 代的咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、脲取代的咪唑并喹 啉胺、芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、杂环基醚取代的咪唑并喹啉胺、 酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺、砜酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺、脲 取代咪唑并喹啉醚、硫醚取代咪唑并喹啉胺和6-、7-、8-、或9-芳基或 杂芳基取代的咪唑并喹啉胺；四氢咪唑并喹啉胺包括但不限于酰胺取 代的四氢咪唑并喹啉胺、磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的 四氢咪唑并喹啉胺、芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、杂环基醚取代 的四氢咪唑并喹啉胺、胺基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、氨磺酰基醚 取代的四氢咪唑并喹啉胺、脲取代的四氢咪唑并喹啉醚和硫醚的取代 四氢咪唑并喹啉胺；咪唑并并吡啶胺包括但不限于酰胺取代的咪唑并 并吡啶胺、氨磺酰基取代的咪唑并并吡啶胺、脲取代的咪唑并并吡啶 胺、芳基醚取代的咪唑并并吡啶胺、杂环基醚取代的咪唑并并吡啶胺、 酰胺基醚取代的咪唑并并吡啶胺、氨磺酰基醚取代的咪唑并并吡啶胺、 脲取代的咪唑并并吡啶醚和硫醚取代的咪唑并并吡啶胺；1，2-桥接咪唑 并喹啉胺；6，7-稠合环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶吡啶胺；四氢咪 唑并萘啶吡啶胺；噁唑喹啉胺；噻唑喹啉胺；噁唑吡啶胺；噻唑吡啶 胺；噁唑萘啶吡啶胺；噻唑萘啶吡啶胺；和1H-咪唑并并二聚体稠合吡 啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺。
在某些具体实例中，IRM化合物可以是四氢咪唑并喹啉胺，例如 4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹 啉-1-乙醇。在另外的具体实例中，IRM化合物可以是咪唑并喹啉胺。 在某些特定具体实例中，IRM可以是1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c] 喹啉-4-胺基。在另外的具体实例中，IRM化合物可以是氨磺酰取代的 咪唑并喹啉胺，例如N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基) 丁基]甲烷磺酰胺。如果需要可以使用多种IRMs的组合。
IRM化合物或组合(例如IRM与IL-2和/或PKC激动剂)的每个 成分可以以任何适合的制剂对患者给药。适合的制剂种类描述在，例 如美国专利US 5,736,553；美国专利5,238,944；美国专利5,939,090； 美国专利6,365,166；美国专利6,245,776；美国专利6,486,186；欧 洲专利EP号EP 0394026和美国专利申请公开文本2003/0199538。 该化合物(IRM化合物、IL-2或PKC激动剂)可以是任何适合的形态 包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂或任何混合物形态。该化合物可以 与任何药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物为制剂给药。例如该化 合物可以是适用于局部给药的制剂。某些局部给药的IRM化合物制剂 的合适的种类表述，例如在国际专利公开文本WO 03/045391。该制剂 可以以任何常规的剂型(包括但不限于霜剂、膏剂、气雾剂、非气溶 胶喷射、凝胶、洗液、片剂、锭剂、酏剂等)给药。该制剂还可以包 括一种或多种添加剂，包括但不限于辅助剂、皮肤渗透增强剂、着色 剂、香料、湿润剂、增稠剂等。
用于实施本发明的制剂组合物可以根据该领域已知的因素来改 变，包括但不限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、预期的 剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、IRM 化合物的给药方法、是否有一种或多种其它药剂正在结合IRM化合物 给药、和给药的物种。因此，对所有可能的应用和本发明所有可能具 体实例指定组合物的有效制剂通常是不切实际的。然而，本领域熟练 的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定其合适制剂。
在一些具体实例中，本发明的方法包括以IRM化合物制剂对患者 给药，例如约0.0001％～约10％(除非另有说明，所有在此提到的百 分数是重量/总制剂的重量)对患者给药，尽管在一些具体实例中，可 以使用IRM化合物制剂(提供该范围以外浓度的IRM化合物)对患者 给药。在某些具体实例中，该方法包括以约0.01％～约5％IRM的化 合物制剂对患者给药，例如，一种包括约5％IRM化合物的制剂。
用于实施本发明的IRM化合物的有效量可根据该领域已知的因素 来改变，包括但不限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、预 期的剂量服法、患者免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、 IRM化合物的给药方法、是否有一种或多种其它药剂正在结合IRM化 合物给药、和正在给药的制剂种类。因此，对所有可能的应用和本发 明所有可能具体实例制定IRM化合物的有效量通常是不切实际的。然 而，本领域熟练的普通技术人员适当考虑这些因素后可以很容易决定 其合适用量。
在一些具体实例中，本发明的方法包括以足够的IRM化合物剂量 对患者给药，例如约100ng/kg～约50mg/kg对患者给药，尽管在一些 具体实例中，该方法可以使用该范围以外剂量的IRM化合物对患者给 药。在一些该具体实例中，该方法包括以约10μg/kg～约5mg/kg足够 剂量的IRM化合物对患者给药，例如约100μg/kg～约1mg/kg的剂量。
该剂量服法至少可能依赖该领域已知的许多部分因素，包括但不 限于IRM化合物的物理和化学性质、载体性质、IRM的给药量、患者 免疫系统的状态(例如抑制的、失能的、刺激的)、IRM化合物的给药 方法、是否有一种或多种其它药剂结合IRM化合物给药、和给药的物 种。因此，对所有可能的应用和本发明所有可能具体实例制定有效的 剂量服法通常是不切实际的。然而，本领域熟练的普通技术人员适当 考虑这些因素后可以很容易决定其合适的剂量服法。
在本发明的一些具体实例中，IRM化合物可以例如每天从单一剂 量到多剂量给药。在某些具体实例中，IRM化合物可以从大约每周三 次到大约每天一次给药。在特殊实例中，IRM化合物每天一次给药。
实施例
下列选取的实施例仅进一步说明本发明的特征、优点和其它细节。 然而，当实施例是该目的时很清楚的知道：其特殊材料和用量以及其 它条件和细节不能理解为非正常限制本发明范围的理由。
用于实施例的化合物列在表格1中。
表1 化合物 化学名称 参考 IRM1 4-胺基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢- 1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇 水合物 U.S.5,352,784 实施例91 IRM2 1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺基 U.S.4,689,338 实施例99 IRM3 N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基) 丁基]甲烷磺酰胺 U.S.6,677,349 实施例236 负对照 (Neg.) 4-羟基-1-异丁基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉 U.S.4,698,348的 实施例71
材料和方法
血液标本：收集同意的CLL患者的肝素化血液(30-40mL)(通 过CD19+CD5+IgMIO囊依赖性淋巴细胞继续升高来诊断(Rozman和 Montserrat，New Engl.J Med.1995；333：1052-1057))。在分析时所有 的患者之前不曾治疗。方案由有关制度审查委员会(Institutional Reviw Board)批准。
表2 材料 商业来源 脂多糖(LPS) Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO 佛波醇二磷酸钠(PDB) Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO 临床等级IL-2 Chiron Corporation，San Francisco，CA 干扰素-α2b Schering Cahada，Pointe-Claire，Quebec 地塞米松 Pharmascience，Inc.，Montreal，Quebec Bryostatin-1 ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH 聚(I:C) Amersham Pharmacia Biotech，Inc.， Piscataway，NJ SB203580 Calbiochem(San Diego，CA
抗体：藻红蛋白或FITC标记的CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、 CD54(ICAM-1)、CD83、4-1BB配体(4-1BBL)、CD5和CD19抗体， 其可以从BD Pharmingen购买(San Francisco，CA)。藻红蛋白标记的 ICOS-L和PDL-1(B7-H1)抗体，其可以从eBioscience(San Diego， CA)购得。
材料的制备和方法：在DMSO中制备PDB(5mg/mL)储液。在 DMSO中制备SB203580(25mg/mL)储液，选择性的应力-活化蛋白 激酶抑制剂(SAPK)(p38)(Lee等，Pharmacol Ther.1999；82： 389-397)。由3M药剂(St.Paul，MN)提供IRM1和负对照(Neg.)化 合物。该化合物溶入1.3mg/mL的AIM-V培养基(GibcoBRL，Grand Isaland，NY)(用33％DMSO)并于4℃存储。同样由3M药剂提供5 ％的IRM2乳膏(在市场上购买ALDARA)。
细胞纯化：如Gitelson等(Gitelson等Clin.CancerRes.2003；99： 1656-1665)所述，通过负选择(RosetteSep，StemCell Technologies， Vancouver，BC)从新鲜血液中分离CLL和T细胞。
CLL细胞的活化：纯化的CLL细胞(1.5×106细胞/mL)在6或 24孔平皿(Becton-Dickinson Labware，Franklin Lake，NJ)中在无血 清AIM-V培养基加2-巯基乙醇(2-ME，5×10-5M)(Sigma Chemical Co.) 里在37℃5％CO2中培养3-4天。通过加入负对照化合物(1μg/mL)、 IRM1(1μg/mL)、IL-2(5000U/mL)、PDB(100ng/mL)或bryostatin (20nmol)酌情活化CLL细胞。该负对照组化合物对CLL细胞不具 备可测量的影响，因此单独使用AIM-V培养基作为大多数实验的对照 组。
混合淋巴细胞应答(MLRs)：从CLL患者分离出T细胞并在AIM-V 培养基中调整至5×105细胞/mL。活化的CLL细胞洗涤至少4次以除 去剩余的免疫调节剂，照射(2500cGy)并以5×105细胞/mL(或更低 浓度)悬浮于AIM-V培养基中。应答剂和刺激物以1∶1(体积比)混 合且无需另外的细胞因子或血清在96孔圆底平皿(Becton Dickinson Labware，Franklin Lake，NJ)中培养。4～6天后用比色定量(Gitelson 等，Clin CancerRes.2003；99：1656-1665；和Ahmed等，J.Immunol. Methods.1994；170：211-224)测量增殖。
流式细胞计数法：按照如Gitelson(Gitelson等，Clin.Cancer Res. 2003；99：1656-1665)等所述的方法进行细胞的染色。
细胞因子测量：通过多重分析荧光珠测定系统(可从Luminex公 司、Atin、TX以商品名LUMINEX-100系统购得)得出在上层清液(来 自48小时后活化的CLL细胞)中培养的细胞因子水平。根据制造商的 指导(R & D系统，Minneapolis，MN)使用测量IFN-γ、IL-2、IL-4、 IL-10和TNF-α的5-plex人类细胞因子的工具。利用软件(购自BioRad、 Mississauga、Ontario以商品名BIO-PLEX 2.0)从标准曲线得到各种细 胞因子浓度。
统计分析：Student t检验用于测定样本平均值之间差额的p值。 通过最小二乘回归法得到最佳拟合曲线。
实施例1：IRM1对于由CLL细胞表达的共刺激分子上的效果。
将来自标值患者的CLL细胞在IRM1(1μg/mL)中培养3～4天， 然后用于测定在图1的x轴上所标记的共刺激分子的表达的测试(强 度大于第一个对数荧光的十倍)。通过流式细胞计数器测定表达各个共 刺激分子的细胞百分比与表达的平均荧光强度(MFI)。然后由该这些 测定的比率到百分比以及未使用活化剂培养的对照细胞培养计算得出 “成倍提高”。共刺激分子表达的相对提高的平均值和标准误差如图1A 所示。
在IRM1提高CD54、CD80和CD86在CLL细胞(来自所有研究 患者n＝31)的表达中，IRM1对于CD80、CD86和CD54表达具有特 别强的影响。对于CD80的影响大于CD86(比较图1和2)。IRM1还 提高CD83、4-1BBL和PDL-1的表达，但对于ICOS-L的表达几乎没 有影响(图1A)。
来自标值患者的CLL细胞在IRM1、LPS(100μg/mL)、聚(I:C) (100μg/mL)和IFN-γ2B(500U/mL)中培养48小时。如图1A所述 计算得出CD80和CD86表达的相对提高，并在图1B中显示。
通过其它TLR激动剂以同样的方式，对CLL细胞没有影响。TLR2 和TLR4由细菌LPSs活化，而TLR3通过病毒双链RNA和聚(I:C) 活化(Gordon，Cell.2002；111：927-930)。然而LPS或聚(I:C)很 少影响由CLL细胞表达的共刺激分子(图1B)。虽然IRM1是IRMs 类之一(已知其促进DCs或单核细胞分泌IFN-α(Gibson等，Cell Immunol.2002；218：74-86))，但是既然用IFN-γ2B直接刺激后，由 CLL细胞表达的共刺激分子没有重要的变化，IRM1的效果不可能由该 细胞因子间接地介导(图1B)。
实施例2：IL-2和IRM1在由CLL细胞表达的共刺激分子上的效 果。
分离CLL细胞并单独或与IL-2(5000U/mL)、IRM1(1μg/mL) 或IL-2与IRM1共同的培养3～4天。然后通过流式细胞计数器测定 CD80、CD86、CD54和CD83的表达。图2A显示了一个特征实例。在 上下行的点图中的数字是分别是CD80+和CD86+CLL细胞的百分比。 图2B是表达图中所示数量患者的不同的共刺激分子(通过使用染色强 度高于上述第一个十个对数荧光的细胞的百分数测定的)的CLL细胞 百分比的图解表示。图中显示了每次测量的平均和标准误差。双箭头 的数字表示样本平均值之间差额的p值。图2C是表达图中所示数量患 者的不同的共刺激分子(用于CLL细胞测定)的平均荧光指数(MFI) 的图解表示。图中显示了每次测量的平均和标准误差。因为基本上所 有的CLL细胞表达该分子，(所以)仅仅显示了CD54表达(除以10) 的MFI。双箭头的数字表示样本平均值之间差额的p值。
IL-2和IRM1都能够提高CLL细胞(其表达CD80和CD86)的 百分比，同时能够提高这些分子表达的平均荧光强度(MFI)(图2)。 作为单一药剂，IRM1似乎比IL-2在这方面更有效。IL-2和IRM1在添 加剂表达的共刺激分子上的效果(图2A、右边点图和图2B、C)，这 表明其通过不同的机制介导。图2C中显示的共刺激分子CD80、CD86、 CD54和CD83的MFI表明IRM1提高所有这四种共刺激分子在CLL 细胞的表达。IRM1结合IL-2尤其提高了CD80表达的数量。
IL-2和IRM1稍微提高了4-1BBL和PDL-1的表达，但不如CD80、 CD86和CD54多(图1A)。ICOS-L基于许多CLL细胞但其表达似乎 相对独立于IL-2和介导的IRM1信号。
实施例3：PKC在对IL-2和IRM1活化的CLL细胞的共同刺激显 型上和T细胞刺激能力的活化效果。
从个体患者提纯的CLL细胞并单独或与IL-2、IRM1、IL-2和 IRM1、PDB、PDB和IL-2、PDB和IRM1、或者PDB和IL-2和IRM1 培养。3～4天后获得这些细胞，完全洗涤，照射(2500cGy)并用于 刺激CLL患者5～6天培养后的异源的或自体同源的T细胞(在CLL 细胞的同时获得并放置培养直到加入到混合淋巴细胞应答(MLR)试 验)，加入Alamar Blue并在波长540(对比态)和595(氧化态)的光 密度比色微板读数器中测量增殖。该读数之间的差异用于测量培养的 活细胞数量。结果如图3A所示。从各个个体试验显示出最大刺激(在 减去未活化的CLL细胞刺激物引起的增殖之后)的T细胞所得到的结 果被用来产生平均增殖且来自患者数量的标准误差显示在X轴上。
图3B是CD83表达与T细胞刺激素效率相关的图解表示。CLL 细胞用IL-2和IRM1处理4～5天。然后通过流式细胞计数器测定表达 CD83的细胞百分比和CD83表达的MFI。然后照射该活化的CLL细胞 并在MLRs中用于刺激自体同源的或异源的T细胞。来自19个不同患 者的CD83+CLL细胞的初始百分比(左边图形)和CD83表达的MFI (右边图形)在MLRs中与标准的增殖关联起来。最佳直线截距为 10.692且斜率为0.0598；其关联的p值为0.0153。
图4A显示来自典型患者的CLL细胞单独(左边图形)或与IRM1、 IL-2和PDB(右边图形)培养3天。然后通过流式细胞计数器测定CD80、 CD83、CD54和CD86表达。在点图中的百分比涉及CD80(上象限的 左右之和)(上方图片)和CD86(上下象限的右部之和)(下方图片)。 图4B是表达CD80、CD83、CD54和CD86(和MFI的表达)的CLL 细胞(来自图例中标值患者，单独或与PDB、PDB和IL-2、PDB和IRM1、 或者PDB和IL-2和IRM1培养后)的流动血细胞计数器的测定结果的 摘要。并显示其平均和标准误差。因为基本上所有的CLL细胞表达该 分子，所以仅仅显示了CD54表达的MFI。图4C是ICOS-L、4-1BBL 和PDL-1表达的类似流动血细胞计数器的测定的摘要。双箭头的数字 表示样本平均值之间差额的p值。
单独用佛波醇二磷酸钠(PDB)治疗，导致90％的CLL细胞表达 CD83(图4B，无色条)。PDB还提高CD80+和CD86+CLL细胞的数量 (后者超过前者)，而且还提高4-1BBL和PDL-1的表达(图4C，无色 条)。通过PDB没有对CD54和ICOS-L的表达产生明显的影响(图4B 和图4C)。
用PDB活化CLL细胞期间加入IL-2主要提高CD80+细胞数量和 CD80的MFI和CD54表达(图4B；水平条)。当用PDB和IRM1一 起活化CLL细胞时得到CD80+细胞稍微提高的百分比(图4B；竖条)。 向IRM1和PDB加入IL-2显著提高CD80(尤其与CD86相比(图4B)) 和CD54的表达，并引起基本上全部的CLL细胞带来一种 CD83hiCD80hiCD86hiCD54hi细胞表面显型(图4A和图4B，斜纹条)。
图4中的结果指出PDB和IRM1的组合引起CLL细胞对CD80、 CD86和CD83几乎100％的表达。加入IL-2主要影响CD80和CD54 表达的数量。PDB(有或没有IL-2)和/或IRM1提高4-1BBL和PDL-1 的表达，但与CD80、CD86、CD54和CD83的程度不同。
通过CLL细胞活化(用PDB、IL-2和IRM1)的共刺激分子的强 烈表达反应了这些细胞对刺激T细胞增殖的效率(图3A)。用PDB(没 有IL-2)刺激的CLL细胞是T细胞增殖的弱刺激物(图3A)。
实施例4：在IRM1的存在下通过自体同源的T细胞消除CLL细 胞。
从CLL患者离析出CLL细胞和T细胞，悬浮于106细胞/mL的 浓度并以1∶1比率混合。该细胞混合物单独或在IL-2、IL-2和IRM1、 bryostatin、bryostatin和IL-2、bryostatin和IRM1、或者bryostatin和IL-2 和IRM1的存在下培养。在图5A中，5天后，通过流式细胞计数器测 定CD5+CD19+肿瘤细胞(显示在点图中的右边上象限的数字)和 CD5+CD19-T细胞的百分比。在图5B中，这些百分比和活细胞总数 (在血球计中通过手工计数测定)用于计算培养的CLL细胞剩余的绝 对数。
IRM1(单独，或与IL-2和/或bryostatin结合)引起自体同源的T 细胞在体外杀灭CLL细胞。IRM1、IL-2和bryostatin的组合使得自体 同源的T细胞能够在5天内100％清除CLL细胞。
实施例5：
对慢性淋巴细胞性白血病有关的淋巴瘤皮肤沉淀以IRM化合物给 药的临床效果
一个71岁的白人男性，通过流式细胞计数器测定其循环单克隆 CD19+CD5+IgMIO淋巴细胞的量持续升高，据此诊断为Rai阶段0CLL。 通过45％循环CLL细胞表达CD38。在一开始和用IRM2治疗结束后 的白血球量分别是36×106细胞/mL和45×106细胞/mL。没有预先使用 其它全身性的化学疗法、类固醇或辐射。
此外，患者报告其手和手臂上大约8年有反复发生的结节状的红 斑损伤。通常用液氮治疗消除该损伤。但是他被诊断为CLL，其上背 和手臂上有几个这样的损伤(图8A)。检测到一个损伤并发现其包含 扩散非典型的含许多小而圆的淋巴细胞的淋巴表皮渗透，且没有嗜表 皮性。在石蜡免疫过氧化物酶染色上，淋巴滤液具有主要的CD20+显 型。在嵌入组织的石蜡的分子类型分析证明了单克隆的B细胞群与B 细胞淋巴瘤一致。
在受影响区域使用IRM2的5％霜剂每周三次。八周后，治疗损伤 的尺寸没有明显的变化，但形成了色素沉着不足的面积，这使人想起 一个晕轮痣环绕着退还的黑素瘤沉淀。
使用IRM2的5％霜剂提高到每天一次。六周的治疗后该损伤消失 (图6B)且停止治疗3个月后没有复发。该治疗过程既没有未治疗的 淋巴瘤损伤，也没有循环白血球量的明显变化。
在Gitelson等Clin.Can.Res.，9：1656-1665(2003)中描述了通过 负选择(RosetteSep，StemCell Technologies，Inc.，Vancouver，BC)从新 鲜血液中分离CLL细胞。纯化的CLL细胞(1.5×106细胞/mL)在自由 血清AIM-V培养基(GibcoBRL)中培养3天。在最终浓度为1μg/mL 时使用IRM1和负对照化合物。
细胞用之前用优化量的CD80-PE和CD83-FITC或CD54-PE和 CD86-FITC抗体培养20分钟，洗涤，然后用流式细胞计数器分析。负 对照与不相干的抗体同型匹配。通过开启前向和侧面的散射特性来对 有核细胞染色。用FAC扫描流动血细胞计数器使用CELLQUEST软件 (BD Immunocytometry Systems，San Jose，CA)分析一万个活菌计数。 该流动血细胞计数器用spheroparticles使之标准化(Spherotech，Inc.， Chicago，IL)。通过比较同型标记对照细胞计算得出CD80+、CD86+和 CD83+细胞的百分比。结果如图7所示。
实施例6：对CLL细胞标记的共同刺激标记物有影响的IRM3的 剂量反应。
来自8位不同患者的CLL细胞纯化并与0.001μg/mL、0.01μg/mL、 0.1μg/mL或1.0μg/mL的IRM3培养3天。通过如上所述的流式细胞 计数器测定CD80和CD83的表达。通过从没有加入IRM3的对照CLL 培养中分别减去CD80和CD83的表达，得到CD80和CD83表达的提 高。结果如图8所示。
实施例7：介导的IRM3在CLL细胞表面分子的改变。
从患者收集的CLL细胞用IRM3(1μg/mL)培养2～3天且没有 (对照)。通过流式细胞计数器测定表达CD80、CD83、CD86和CD38 的细胞的百分比。由于几乎所有CLL细胞表达这些分子，测定CD54 和CD25的表达的MFI。表达特殊细胞表面分子的细胞百分比的表达 MFI的改变是通过用IRM3的细胞培养中得到的值减去对照组培养中 得到的值而得到。结果如图9所示。
实施例8：IRM3介导的CLL细胞表达的CD20的提高
纯化CLL细胞或者没有(对照)或者与IRM3(1μg/mL)和IL-2 (5000U/mL)一起培养。48小时后，通过流式细胞计数器测定CD20 表达的MFI。结果如图10所示。
此处所引用的专利、专利文献和出版物中的全部公开内容各自通 过引用的方式全文包含在本申请中。在存在相互矛盾的情况下，以本 申请的说明书(包括定义)为准。在不背离本发明的精神和范围的前 提下，对本发明所进行的各种修改和改变对本领域技术人员来说将是 显而易见的。说明性的具体实例和实施例仅作为实例提供，且不试图 限制本发明的范围。本发明的范围仅由以下权利要求的限制。