草乌叶提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种草乌叶提取物，属于中药制剂领域。
背景技术
草乌叶是毛茛科植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥叶。夏季叶 茂盛花未开时采收，除去杂质，及时干燥。《中国药典》2005版中，规定有小毒。为 蒙古族习用药材。因其溶出速度快，容易加工，在临床主要入丸散。草乌叶中总碱含 量较高，双酯性生物碱含量较低，在止痛效果上接近草乌的水平，但毒性较小，而且 其有较好的清热解毒的作用，从来源上都为北乌头。因此，需要解决同时协调草乌叶 的毒性和疗效问题，又方便临床使用的制剂。
发明内容
本发明的技术方案在于提供一种草乌叶提取物，本发明的另一技术方案是提供含 有该草乌叶提取物的药物组合物及其制备方法。
本发明提供了一种草乌叶提取物，它是由草乌Radix Aconiti Kusnezoffii的叶 为原料制备而成的提取物，其中，每克提取物中含双酯性生物碱，照异肟羟酸铁法测 定，以乌头碱C34H47NO11计在0.125mg～0.25mg；含总生物碱，照滴定法测定，以乌头碱 C34H47NO11计在0.6～0.9mg。
以乌头碱为指标成分，测定本发明提取物中双酯性生物碱及总生碱的含量，因为 生物碱类成分既是本发明提取物的活性成分，也是毒性成分，因此，对生物碱类成分 的质量控制非常重要，直接影响了药物的有效、安全。只有在上述质量控制的范围内 的药物才能满足安全、有效，才能便于临床使用。
进一步地，它是由草乌叶为原料，加水或有机溶剂提取而得。
其中，本发明提取物是由如下方法制备：称取草乌叶，第一次加9～11倍量水， 浸泡20-40分钟，煎煮1.5～2.5小时，第2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小时， 滤过，合并滤液浓缩，干燥即得。
进一步地，它是由如下方法制备：
称取草乌叶，加10倍量水，浸泡30分钟，煎煮2次，每次2小时，滤过，滤液， 浓缩，干燥即得。
本发明还提供了一种药物组合物，它是含有草乌叶提取物为活性成分，加上药学 上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
其中，所述的药剂是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、合剂。
本发明还提供了该药物组合物的制备方法，它包括如下步骤：
a、称取草乌叶，第一次加9～11倍量水，浸泡30分钟，煎煮1.5～2.5小时，第 2次加7～9倍量水，煎煮1.5～2.5小时，滤过，合并滤液浓缩，干燥；
b、将a步骤的干燥物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
其中，步骤a中煎煮2次，每次加10倍量水，每次2小时，滤过，滤液浓缩，干 燥即得。
其中，所述浓缩是将滤液减压浓缩至相对密度1.02～1.05，60℃；所述干燥方法 为一步制粒法，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65℃。
本发明药物解决了患者使用不便和安全性的问题，通过对本发明药物进行质量控 制，解决了草乌在临床上使用的安全性问题，扩大了药源；且本发明药物制备方法操 作简单，节约了炮制成本、治疗成本，有非常好的应用和经济价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱 离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
原料购自成都荷花池市场，经成都中医药大学生药鉴定教研室鉴定为北乌头 Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥叶，当年采收。
实施例1草乌叶水提取物的制备
取草乌叶药材12.50kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取 煮沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02~1.05 (60℃)，干燥即得2.15Kg提取物，进风温度为90～100℃，出风温度为：60～65℃。
实施例2草乌叶水提取物的制备
取草乌叶药材11.50kg，以水浸泡40min，加至11倍量水煎煮，煎煮时间分别取 煮沸后2.5h，第2次加9倍量水，煎煮2.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02~1.05 (60℃)，干燥即得1.98Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65 ℃。
实施例3本发明药物颗粒剂的制备
取草乌叶药材10.50kg，以水浸泡20min，加至9倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮 沸后1.5h，第2次加7倍量水，煎煮1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02~1.05 (60℃)，干燥即得1.75Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65 ℃，制备的提取物制颗粒、整粒，制成颗粒剂。
实施例4本发明药物片剂的制备
取草乌叶药材12.30kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取 煮沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02~1.05 (60℃)，干燥即得2.12Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65 ℃，制备的提取物制颗粒、整粒，压片，制成片剂。
实施例5本发明药物胶囊剂的制备
取草乌叶药材13.5kg，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮 沸后2h，第2次加8倍量水，煎煮2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至1.02~1.05 (60℃)，干燥即得2.25Kg提取物，进风温度为：90～100℃，出风温度为：60～65 ℃。制备的提取物制颗粒、装胶囊，得胶囊剂。
实施例6质量控制方法
【限量检查】照分光光度法(《中国药典》2000年版一部附录VA)测定。
分别精密称取实施例1制备的草乌叶颗粒10g，加氨试液2ml，用乙醚50ml连续 振摇1小时，冷浸过夜，再用乙醚50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液和洗液，低温 蒸干，加乙醚5ml溶解，挥干，加乙醇2.5ml溶解，置25ml容量瓶中，精密加入碱性 盐酸羟胺试液1.5ml，于60~65℃中水浴10分钟，取出，放冷，加入13ml高氯酸铁试 液，摇匀，放置5分钟，精密加入高氯酸试液8ml，摇匀，用高氯酸铁试液定容至刻度。 以空白做参比，在520nm下测定其吸光度(标准曲线按《中国药典》2000年制川乌项 下操作)
颗粒剂每袋4g草乌叶颗粒剂，相当于草乌叶药材5g，含双酯性生物碱以乌头碱 (C34H47NO11)计在0.5～1.0mg间。
【含量测定】照滴定法测定。
分别精密称取草乌叶颗粒20g，加氨试液4ml，加氨试液4ml，用乙醚：氯仿(3： 1)混合液50ml超声提取45分钟，再用混合液50ml分3次洗涤，滤过，合并滤液 和洗液，低温蒸干，滤过，滤液，低温蒸干，残渣加混合液5ml使溶解并蒸干，再加 乙醇5ml使溶解，精密加入硫酸滴定液(0.01mol/L)15ml、水15ml与甲基红指示液3 滴，用氢氧化钠滴定液(0.02mol/L)滴定至黄色。每1ml硫酸滴定液(0.01mol)相当于 12.9mg的乌头碱(C34H47NO11)。
颗粒剂每袋4g，相当于草乌叶药材5g，含总生物碱以乌头碱(C34H47NO11)计在2.4～ 3.6mg间。
以下通过药效试验的方法对本发明的有益效果做进一步详述。
试验例1本发明草乌叶提取物提取工艺不同参数的筛选试验
1、实验材料
1.1药物
原料购自成都荷花池市场，经成都中医药大学生药鉴定教研室鉴定为北乌头 Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥叶，当年采收。以加水浸泡30min后，加至10 倍量水煎煮，煎煮时间分别取煮沸后15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h 7个时间点， 煎煮完毕均减压浓缩为每ml含原生药1g。根据均匀设计表，草乌叶煎煮15min、30min、 1h、2h、3h、4h、6h 7个时间点的给药剂量分别取临床剂量(1.2g/60kg.d-1)的24 倍、3倍、48倍、12倍、1倍、36倍和6倍。临用时用蒸馏水分别配制成4.8％、0.6 ％、9.6％、2.4％、0.2％、7.2％、1.2％的草乌叶药液备用。
萘普生：阳性药物，成都锦华药业有限责任公司生产。批准文号：国药准字 H51020774。生产批号：040707。规格：0.1g×100片/瓶。实验时用蒸馏水配制成2 ％的药液备用。
1.2动物
SD大鼠，雌雄不拘，体重180-220g。由成都中医药大学实验动物研究中心提供， 实验动物生产许可证号：04-11。检疫后备用。
2、实验方法
取SD大鼠90只，以WMZ-03型电子温度计测定大鼠肛温作为基础体温，测量时将 大鼠仰位固定于鼠板上，待其稳定后，在肛温计顶端涂少许液体石蜡，轻缓送入肛门 2cm，放置30秒待电子肛温计指针稳定后读数。按基础体温高低随机分为模型对照组 (N＝10)、阳性对照组(N＝10)、草乌叶15min组(N＝10)、30min组(N＝10)、1h 组(N＝10)、2h组(N＝10)、3h组(N＝10)、4h组(N＝10)、6h组(N＝10)，按组 分别灌胃蒸馏水、2％萘普生药液、4.8％、0.6％、9.6％、2.4％、0.2％、7.2％、1.2 ％的草乌叶药液。给药1小时后，于大鼠背部皮下注射0.25％2，4-二硝基苯酚溶液 10ml/kg(精密称取2，4-二硝基苯酚150mg，置于80ml生理盐水中，滴加5mol/L的 NaOH溶液，不断搅拌，待药液澄明变为亮黄色，再加入生理盐水至100ml)，分别测定 造模后30min、60min、90min、120min、150min、180min的肛温，以给药前后温度之 差进行组间比较。实验数据用SPSS11.0统计软件处理，回归分析采用均匀设计1.0专 用软件处理。
3、实验结果
模型组2，4-二硝基苯酚造模后，30min体温即显著升高，120min组达高峰，持 续3小时。草乌叶除1小时组外，其余各给药组体温均明显降低，尤以6h组显著，各 时间段与模型组比较均有显著或极显著性差异。经回归分析，草乌叶除30min发挥药 效的最优条件为6h，21.12倍外，60min、90min、120min、150min、180min发挥药效 的最优条件均为6h，48倍。结果详见表1及回归分析。
表1 草乌叶对2，4-二硝基苯酚致热大鼠体温的影响
组别 动物(只) 剂量(g/kg) 30min(℃) 60min(℃) 模型组 阳性组 15min 30min 草1h 乌2h 叶3h 4h 6h 10 10 10 10 10 10 10 10 10 蒸馏水 0.2 0.48 0.06 0.96 0.24 0.02 0.72 0.12 1.19±0.89 0.15±0.48**0.50±0.32*0.47±0.75 1.10±0.59 0.67±0.55 0.76±0.69 0.71±0.58 0.32±0.84* 1.40±0.94 0.40±0.79* 0.88±0.63 0.33±1.20* 0.87±0.67 0.58±0.85 0.83±1.00 0.37±0.91* 0.30±1.02* 90min(℃) 120min(℃) 150min(℃) 180min(℃) 1.95±1.12 0.30±1.00** 0.89±0.76* 0.45±1.33* 1.43±0.99 0.89±0.83* 0.84±0.81* 0.92±0.81* 0.49±0.89** 2.09±0.86 0.52±0.66*** 0.81±0.95** 0.40±1.14** 1.31±1.10 1.34±0.69* 1.08±0.85* 0.97±0.86** 0.61±0.58*** 1.64±0.86 0.48±0.53** 0.99±0.98 0.39±1.13* 1.30±1.01 0.76±0.73* 0.90±0.82 0.84±1.22 0.70±0.48** 1.56±0.76 0.30±0.49*** 0.93±0.90 0.42±1.02* 1.21±0.99 0.67±0.69* 0.85±0.64* 1.07±1.34 0.79±0.69*
注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
回归分析：
0.5h：Y＝1.99-0.547X1+0.0356X2+0.0933X22-2.66×10-5X23
R＝0.9948 a＝0.05
最优条件：X1＝6h，X2＝21.12倍 预期试验结果：Y＝2.57
1h：Y＝1.78+1.41X1-0.0264X2-0.808X12+0.0945X13+0.00502X12X2
R＝1.0000 a＝0.01
最优条件：X1＝6h，X2＝48倍 预期试验结果：Y＝8.99
1.5h：Y＝2.71-0.0407X1 X2+0.00954X12X2
R＝0.9823 a＝0.05
最优条件：X1＝6h，X2＝48倍 预期试验结果：Y＝7.46
2h：Y＝4.57-1.36X1-0.0519X2+0.232X12+3.69×10-4X1X22
R＝0.9961 a＝0.05
最优条件：X1＝6h，X2＝48倍 预期试验结果：Y＝7.38
2.5h：Y＝2.47+1.45X1-0.0527X2-0.824X12+0.0972X13+0.00401 X12X2
R＝0.9982 a＝0.15
最优条件：X1＝6h，X2＝48倍 预期试验结果：Y＝6.86
3h：Y＝2.65-0.189X1+0.134X2-0.0107X22+0.00204X12X2+1.5×10-4X23
R＝0.9991 a＝0.15
最优条件：X1＝6h，X2＝48倍 预期试验结果：Y＝3.37
上述药效试验证明，以水浸泡30min，加至10倍量水煎煮15min、30min、1h、2h、 3h、4h、6h均能发挥药效作用，6h较优；15min、30min、4h、6h条件下制备的本发 明药物是最佳药物。
试验例2本发明草乌叶提取物提取工艺不同参数的安全性试验
1.实验材料
1.1.药物
草乌叶各时间点水煎液，受试药物，按实施例1-3所述的方法制备，分别含生药 量为15min、30min、1h、2h、3h、4h及6h均为3.33g/ml；由成都中医药大学药学院 提供，试验批号：050625，用各水煎液灌胃小鼠。
1.2.动物
SPF小鼠，雌雄各半，体重18-21g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供， 合格证号：川实动管质04-11，检疫后备用。
2.实验方法
预试：取SPF小鼠，雌雄各半，禁食不禁水12hr，通过试验测得15min、30min、 1h的全死、全活量，做LD50；2h、3h、4h及6h以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W 的剂量灌胃，24h连续给药3次。连续观察3d，记录动物有无毒性反应以及实验前后 体重变化，以不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。
取SPF小鼠150只，雌雄各半，禁食不禁水12hr， 按体重随机分为15组，每组 10只。在15min、30min、1h的全死全活量之间再设定3个剂量组，分别灌胃相应浓 度的药液；连续观察7天，记录动物死亡只数，求其LD50。
取SPF小鼠100只，雌雄各半，禁食不禁水12hr，按体重随机分为5组，每组 20只。即空白对照组(N＝20)、2h组(N＝20)、3h组(N＝20)、4h组(N＝20)及 6h组(N＝20)。以小鼠耐受的最大容积0.4ml/10g.B.W的剂量分别灌胃相应浓度的药 液，24h连续给药3次；连续观察7天，记录动物有无毒性反应以及实验前后体重变 化，以不产生死亡的剂量为最大耐受量(MTD)。
以上结果均用SPSS12.0统计软件处理。
3.实验结果
3.1草乌叶15min时间点药液结果
SPF小鼠灌胃草乌叶15min时间点药液后，均出现行动迟缓、神情淡漠、等不同程 度的中毒反应，死亡多发生在给药后24小时内死亡。动物死亡情况详见表3。
Y＝-4.532+0.0473X r＝0.344
LD50＝95.84g/kg。
表3 15min草乌叶灌胃给药对动物死亡的影响
组别 动物(只) 剂量(g/kg) 死亡数(只) 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 58.28 71.61 88.16 108.44 132.20 0 2 4 6 10
3.2草乌叶30min时间点药液结果
SPF小鼠灌胃草乌叶30min时间点药液后，均出现行动迟缓、神情淡漠等不同程度 的中毒反应，死亡多发生在给药后24小时内死亡。动物死亡情况详见表4。
Y＝-9.659+0.099X r＝0.740
LD50＝97.09g/kg。
表4 30min草乌叶灌胃给药对动物死亡的影响
组别 动物(只) 剂量(g/kg) 死亡数(只) 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 83.25 90.74 98.91 107.81 116.55 1 3 6 8 10
3.2草乌叶1h时间点药液结果
SPF小鼠灌胃草乌叶1h时间点药液后，均出现行动迟缓、神情淡漠等不同程度的 中毒反应，死亡多发生在给药后24小时内死亡。动物死亡情况详见表5。
Y＝-14.797+0.1209X r＝0.657
LD50＝122.35g/kg。
表5 30min草乌叶灌胃给药对动物死亡的影响
组别 动物(只) 剂量(g/kg) 死亡数(只) 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 108.23 113.64 119.32 125.28 133.20 0 2 4 6 9
3.3草乌叶2h、3h、4h及6h时间点药液结果
SPF小鼠灌胃草乌叶2h、3h、4h及6h时间点药液后，发育健康，肌肉丰满，被 毛浓密而有光泽、紧贴其身，眼睛明亮而灵活、无异常的分泌物，肛周洁净，摄食正 常，四肢健壮，自发活动正常，体重逐渐增加。7d内未内动物死亡及毒副反应。实验 结束时肉眼尸解未见明显病理改变。
4.实验结论
SPF小鼠灌胃草乌叶各时间点水煎液结果：草乌叶：15分钟LD50为95.84g原生药 /kg(约相当于人用量的4792倍)；30分钟LD50为97.09g原生药/kg(约相当于人用 量的4855倍)；1h LD50为122.35g原生药/kg(约相当于人用量的6118倍)、2h、3h、 4h及6h MTD为399.6g原生药/kg(约相当于人用量的19980倍)。
草乌叶煎煮15min、30min、1h无明显毒性，煎煮时间2h以上基本无毒性。
上述实验说明本发明草乌提取物煎煮时间2h以上安全。
上述药效学试验证明，采用本发明所述的方法制备的产品，在质量控制的标准范围 内，达到了安全、有效，为临床提供了一种新的选择。