技术领域
本发明涉及芦丁新的药物制剂，尤其涉及一种芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微 球及其制备方法。
背景技术
芦丁(rutin)又名芸香苷、紫槲皮苷，为一来源很广的黄酮类化合物。芦丁 广泛存在于植物界，几乎所有的芸香科和石楠科植物中均含有之，尤以芸香科 的芸香草，豆科植物槐的花蕾(槐米)、果实(槐角)、蓼科植物的荞麦、金丝桃 科植物红旱全草、鼠李科植物光枝勾儿茶、大蓟科植物野梧桐叶含量较为丰富， 可以作为提取芦丁的原料。此外，它还存在于冬青科植物毛冬青、木樨科植物 连翘、豆科植物槐角以及烟草、枣、杏、橙皮和番茄等植物中。目前，我国芦 丁生产主要以槐米为原料进行提取。芦丁分子式为C27H30O16·3H2O，分子量为 610.51，其性状为黄色结晶粉末或无晶形粉末，含有三分子的结晶水，有苦味， 熔点为174～178℃。芦丁溶于热水，溶解度1∶200；难溶于冷水，溶解度1∶ 8000；溶于热甲醇，溶解度1∶7；冷甲醇，溶解度1∶100；热乙醇，溶解度1∶ 30；冷乙醇，溶解度1∶300；难溶于乙酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿等非极 性溶剂。易溶于碱液中呈黄色，酸化后又析出。芦丁具有维生素P样作用，能 降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和防止血细胞凝聚，以及抗炎、抗 过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等作用。临床上芦丁主要用于高血压病的辅 助治疗和用于防治因芦丁缺乏所致的其它出血症，同时还用于预防和治疗糖尿 病及合并高血脂症。由此可见芦丁是一种应用非常广泛的常用药物。目前用于 医学抗微生物感染辅助治疗药物的芦丁制剂主要是片剂和注射剂，临床使用片 剂，则由于芦丁上述的在水中的溶解度极差的特性，生物利用度较低，因而影 响其口服吸收，并导致口服吸收不规律。为了加强药效，只有加大剂量，大剂 量片剂的应用对胃肠道及心脏具有毒副作用。芦丁片说明书中注明：芦丁不溶 于水，吸收不规律，疗效不确切，所以芦丁片近年来在临床上几乎不用。
为改善芦丁在水中的溶解性状，增加药理活性，提高生物利用度，已有很 多人作了大量工作，如将芦丁与β-环糊精一起制成包合物；芦丁与其它化合 物结合形成共沉物等。2008年1月23日中国发明专利公开号CN 101108193A公 开了一种水溶性芦丁及其制备方法与口服制剂，是将芦丁溶于有机溶剂中，加 入尿素或聚乙二醇加热回流后制得。该方法确实能有效的提高芦丁在水中的溶 解度，但遗憾的是，上述方法均因成本等问题难于实现工业化生产。
微球是近年发展起来的新型制剂，其除了具有提高药物的稳定性、防止药 物在胃内失活和减少对胃的刺激性外，更具有缓释作用，从而提高疗效，降低 毒副作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种芦丁-阿拉伯胶-明 胶缓释微球及其制备方法。本发明使用缓释微球作为微生物感染的辅助治疗药 物，由于其缓释作用，能明显改善芦丁的生物利用度，从而可提高疗效，降低 毒副作用。
本发明的芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球是以芦丁为主要原料，加入采用天 然高分子材料阿拉伯胶、明胶作为基质骨架制备而成，其重量配比是芦丁∶阿 拉伯胶∶明胶＝1∶3∶3。
具体制备方法步骤如下：
①分别取3份阿拉伯胶与3份明胶，各加蒸馏水97份，置水浴中，使其分 别制成质量比为3％的阿拉伯胶和3％的明胶溶液，置50-70℃水浴中，最佳选50℃ 的水浴，使其温热溶解20分钟，保温，备用；
②另取已研细过200目筛的芦丁1份，准确称重后，加上述明胶溶液，置 50-70℃水浴中混匀，且边搅边加入上述阿拉伯胶溶液，应用滴注器控制加入阿 拉伯胶溶液的速度，控制囊材与囊心物的质量比为4～8∶1，最佳选6∶1，得 混合溶液；所称的囊材为阿拉伯胶和明胶，所称的囊心物是芦丁；
③维持步骤②混合溶液的成囊温度为50℃-70℃，优选为60℃；在搅拌条 件下，以40滴/min的滴加速度加入浓度10％的醋酸溶液，调节混合溶液pH值 至3.5，得凝聚囊液；继续搅拌5分钟后，加入温度为30-40℃的去离子水至凝 聚囊液中，去离子水是该凝聚囊液总体积的2倍量；自水浴中取出凝聚囊液， 不断搅拌，自然冷却得凝聚囊后液；待温度降至32-35℃时，将凝聚囊后液移至 冰浴中，继续搅拌至10℃以下；
④取浓度37％的甲醛溶液一次性加入冰浴中的凝聚囊后液里，控制甲醛加入 量占凝聚囊后液总体积量的0.25％；搅拌，固化，保持0.5～1.5h后从冰浴中 取出；静置，待微囊沉降后弃上清液，过滤，用蒸馏水洗至无甲醛气味，再过 滤，用异丙醇脱水，继续过滤得小颗粒，再用少量无水乙醇洗涤，35-50℃干燥，， 即得黄色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊；
⑤黄色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊经真空干燥、或喷雾干燥、或冻干， 优选真空干燥；采用粉碎，或压榨，或研磨的方法制成微粒，然后过筛得到芦 丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球。
所述的芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球中的芦丁成分优选后的包封率为 41.4％-42.7％。
所述的包封率＝(微囊中所含药物的质量/系统中的总药量)×100％。
所述的去离子水是经离子交换柱过滤，软化的自来水。
本发明与传统“片剂、胶囊、注射液”等药物制剂相比，存在着本质区别。 本发明所得芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球能保持较好的稳定性；微球状物的总 表面积增大，表面活性好，可防止药物在胃内失活和减少对胃的刺激性，更具 有缓释作用，并能使药物有效成分与胃肠道粘膜表面充分接触；通过粘膜上皮 细胞稳定吸收；可使药物运行至肠液中，使药物易溶于碱性肠液中而易于吸收。 故本法制得的芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球有效地避免了芦丁在水中的溶解度 极差的特性。从而具有起效迅速，生物利用度高，毒副作用小，用药方便等特 点。
附图说明
图1：芦丁的标准曲线；
图2：自制微球粒径分布图；
图3：不同实验条件对芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球载药量的影响；
图4：不同实验条件对芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球包封率的影响；
图5：自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球的粒径分布；
图6：芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球与普通芦丁累积释放度的比较；
图7：普通芦丁与芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球对大肠杆菌的生长抑制作 用。
具体实施方式
实施例1
芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球制备方法的实施研究
1、实施方法
(1)仪器：定时电动搅拌器，恒温水浴锅，干燥箱，紫外分光光度计，显微 镜，电子天平，电磁炉等。
(2)试剂：芦丁，芦丁标准品，明胶，阿拉伯胶，醋酸，甲醛，无水乙醇等。
(3)因素与水平：为了优化制备工艺，根据预试验结果，确定囊材与囊心物 的质量比、成囊pH值、成囊温度和固化时间为影响微囊成囊和包封率的主要因 素，故各取3水平，按正交试验三水平表L9(34)进行实验，以包封率作为评价指 标，来筛选制备芦丁微囊的最佳条件。
(4)芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球的制备方法：
具体制备方法步骤如下：
①分别取3份阿拉伯胶与3份明胶，各加蒸馏水97份，置水浴中，使其分 别制成质量比为3％的阿拉伯胶和3％的明胶溶液，置50℃水浴中，使其温热溶解 20分钟，保温，备用；
②另取已研细过200目筛的芦丁1份，准确称重后，加上述明胶溶液，置 50-70℃水浴中混匀，且边搅边加入上述阿拉伯胶溶液，应用滴注器控制加入阿 拉伯胶溶液的速度，控制囊材与囊心物的质量比，最佳选6∶1，得混合溶液； 所称的囊材为阿拉伯胶和明胶，所称的囊心物是芦丁；
③调整水浴的温度，使步骤②的混合溶液维持在成囊温度为50℃-70℃，优 选为60℃；在搅拌条件下，以40滴/min的滴加速度加入浓度10％的醋酸溶液， 调节混合溶液pH值至3.5，得凝聚囊液；继续搅拌5分钟后，加入此时凝聚囊 液总体积的2倍量，温度为30-40℃的去离子水至凝聚囊液中；自水浴中取出凝 聚囊液，不断搅拌，自然冷却得凝聚囊后液；待温度降至32-35℃时，将凝聚囊 后液移至冰浴中，继续搅拌至10℃以下；
④取浓度37％的甲醛溶液一次性加入冰浴中的凝聚囊后液里，控制甲醛加入 量占凝聚囊后液总体积量的0.25％；搅拌，固化，保持0.5～1.5h后从冰浴中 取出；静置，待微囊沉降后弃上清液，过滤，用蒸馏水洗至无甲醛气味，再过 滤，用异丙醇脱水，继续过滤得小颗粒，再用少量无水乙醇洗涤，35℃干燥， 即得黄色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊。
⑤黄色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊经真空干燥、或喷雾干燥、或冻干， 优选真空干燥；采用粉碎，或压榨，或研磨的方法制成微粒，然后过筛得到芦 丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球。
(5)芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊的质量评价：
①芦丁标准曲线的制定；
②微囊的形态；
③微囊的粒径分布；
④芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊包封率的测定：
精密称取适量载药微囊，加入到0.1mol·L-1 HCl介质中搅拌3h，再用 0.10mg·ml-1 NaOH溶液调节pH值至6.8，继续快速搅拌3h后得到澄清透明 黄色溶液。将该溶液用蒸馏水稀释至适当浓度，滤膜滤过，可见光分光光度法 测定(在500nm处测定吸光度A)芦丁-阿拉伯胶-明胶微囊中芦丁含量，计算 载药率(载药率＝微囊中所含药物质量/微囊的总质量×100％)。
⑤芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊载药量的测定：
精密称取适量载药微囊，加入到0.1mol·L-1 HCl介质中搅拌3h，再用 0.10mg·ml-1 NaOH溶液调节pH值至6.8，继续快速搅拌3h后得到澄清透明 黄色溶液。将该溶液用蒸馏水稀释至适当浓度，滤膜滤过，可见光分光光度法 测定(在500nm处测定吸光度A)芦丁-阿拉伯胶-明胶微囊中芦丁含量，计算 包封率(包封率＝微囊中所含药物的质量/系统中的总药量×100％)。
2、实施分析
(1)标准曲线的制定：以芦丁对照品的质量浓度(C)为横坐标，吸收度(A)为 纵坐标，得吸光度-浓度回归方程为Y＝10.41667x+0.00771(R＝0.99995)，表明芦 丁在0-0.072mg·ml-1范围内线性关系良好。(见图1)
(2)微囊的形态：用优化后制备工艺制备的微囊，取微囊少许，轻涂于载玻 片上，在光学显微镜下观察微囊的形态。可见微囊呈黄褐色，外形完整，分散 性好，表面较光滑，不黏结，大小分布均匀。
(3)微囊的粒径分布：最佳制备条件为囊材与囊心物的质量比为6∶1、成囊 pH值为3.5、成囊温度为60℃和固化时间为1.5h所制备的微囊79.5％分布在 30μm-40μm。(见图2)
(4)芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊的包封率：通过实验研究发现，A组、B 组、C组、D组、E组、F组、G组、H组、I组的载药量呈波动变化，其中以D 组的包封率最大，包封率为41.9％。(见图3)
(5)芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊的载药量：通过实验研究发现，A组、B 组、C组、D组、E组、F组、G组、H组、I组的载药量呈波动变化，其中以G 组芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊的载药量最大。(见图4)
对正交试验进行方差分析，可得出囊材与囊心物的质量比对包封率的影响 最大，其次是固化时间，再次是成囊温度，最后是成囊PH值。最优制备条件为 囊材与囊心物的质量比为6∶1、成囊pH值为3.5、成囊温度为60℃和固化时间 为1.5h。
3、芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球的制备及质量评价
(1)芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊，经干燥后，采用粉碎、压榨、研磨、过 筛等方法得到芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球。
(2)自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球与普通芦丁累积释放度的测定：按中 国药典2005年版二部附录XC测定溶出度，以磷酸盐溶液为释放介质，用转篮 法(篮周围包一绸布以防微球漏出)测定自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球和 普通芦丁中芦丁的累积释放度。
4、实施结果
(1)自制微球的形态：所制得的微球呈黄色粉末状颗粒，在光学显微镜下观 察微球呈球形，无粘连，药粉分布均匀。微球粒径在100μm-120μm范围内的 占82.7％。(见图5)
(2)自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球与普通芦丁累积释放度的比较：
自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球在8h内释药速率比较平缓；而普通芦 丁在8h内释放度几乎达到100％，且释药速率在6h内特别快，与自制芦丁-阿 拉伯胶-明胶-缓释微球比较不具有缓释效应。(见图6)
5、细胞实验
(1)实验方法
将大肠杆菌制成浓度为1.0×106/ml的菌液，在无菌室里向5个三角瓶中分 别加入大肠杆菌菌液0.1ml，随后加入自制芦丁微球溶液使终浓度分别为0.2 mg·ml-1、0.4mg·ml-1、0.6mg·ml-1、0.8mg·ml-1、1.0mg·ml-1；另设无药 培养组作对照。分别在0h、2h、4h、6h、8h在600nm处测定培养液的OD 值，并绘制大肠杆菌的生长曲线。
(2)细胞实验效果
自制芦丁微球对大肠杆菌具有一定的生长抑制作用，芦丁微球的浓度小于 0.4mg·ml-1时对大肠杆菌的生长抑制作用不强，而浓度在0.6-1.0mg·ml-1之 间有很强的抑制作用，且浓度在1.0mg·ml-1时几乎完全抑制大肠杆菌的生长。 由此可知芦丁微球对大肠杆菌的生长抑制具有剂量-反应关系，所以本实验所制 备的芦丁微球具有药理学活性。自制芦丁微球可作为制剂中间体。(见图7)
(3)结论
①芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球最优制备条件为：囊材与囊心物的质量比 为6∶1、成囊pH值为3.5、成囊温度为60℃和固化时间为1.5h。
②芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球在6h内释药速率比较平缓。
③芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球对大肠杆菌的生长抑制具有剂量-反应关 系，可作为制剂中间体。
实施例2
芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球的制备方法：
①分别取3g阿拉伯胶与3g明胶，各加蒸馏水97g，置水浴中，使其分别制 成质量比为3％的阿拉伯胶和3％的明胶溶液，置50℃水浴中，使其温热溶解20 分钟，保温，备用；
②另取已研细过200目筛的芦丁1g，准确称重后，加上述明胶溶液，置50℃ 水浴中混匀，且边搅拌边加入上述阿拉伯胶溶液，应用滴注器控制加入阿拉伯 胶溶液的速度，控制囊材与囊心物的质量比，最佳选6∶1，得混合溶液；所称 的囊材为阿拉伯胶和明胶，所称的囊心物是芦丁；
③调整水浴的温度，使步骤②的混合溶液维持在成囊温度为60℃；在搅拌 条件下，以40滴/min的滴加速度加入浓度10％的醋酸溶液，调节混合溶液pH 值至3.5，得凝聚囊液；继续搅拌5分钟后，加入此时凝聚囊液总体积的2倍量， 温度为30-40℃的去离子水至凝聚囊液中；自水浴中取出凝聚囊液，不断搅拌， 自然冷却得凝聚囊后液；待温度降至32-35℃时，将凝聚囊后液移至冰浴中，继 续搅拌至10℃以下；
④取浓度37％的甲醛溶液一次性加入冰浴中的凝聚囊后液里，控制甲醛加入 量占凝聚囊后液总体积量的0.25％；搅拌，固化，保持1.5h后从冰浴中取出； 静置，待微囊沉降后弃上清液，过滤，用蒸馏水洗至无甲醛气味，再过滤，用 异丙醇脱水，继续过滤得小颗粒，再用少量无水乙醇洗涤，35℃干燥，即得黄 色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊。
⑤黄色芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微囊经真空干燥；采用粉碎，或压榨，或 研磨的方法制成微粒，然后过筛得到芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球。
将本实施例得到的芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微球分别用于累积释放度的测 定和大肠杆菌生长抑制试验。试验结果表明，自制芦丁-阿拉伯胶-明胶缓释微 球与普通芦丁相比较在8h内释药速率比较平缓，具有缓释效应；自制芦丁-阿 拉伯胶-明胶缓释微球对大肠杆菌的生长抑制具有剂量-反应关系，可作为制剂 中间体。