HIV膜融合抑制剂.pdf

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1、10申请公布号CN104159914A43申请公布日20141119CN104159914A21申请号201280062599022申请日2012121811194340320111219EPC07K14/005200601C07K14/1620060171申请人爱尔兰詹森研发公司地址爱尔兰科克县申请人佩普斯甘系统有限公司72发明人BA马科姆JWJ图林格CFRN布克WBG舍彭斯MAJ克立伊克WMM沙亚佩JW斯鲁特斯拉P蒂梅曼74专利代理机构中国专利代理香港有限公司72001代理人林毅斌李进54发明名称HIV膜融合抑制剂57摘要本发明涉及人类免疫缺陷病毒HIV与一种宿主细胞相融合的一种抑制剂或H。

2、IV进入该宿主细胞的抑制剂，该抑制剂包括至少24个、但是优选是26个连续的氨基酸；本发明还涉及一种包括所述氨基酸的药物组合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014061886PCT国际申请的申请数据PCT/EP2012/0759562012121887PCT国际申请的公布数据WO2013/092591EN2013062751INTCL权利要求书2页说明书26页序列表49页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书26页序列表49页10申请公布号CN104159914ACN104159914A1/2页21一种肽，包括至少24个连接至一个N封端基团的连续。

3、的氨基酸，其中所述N封端基团选自琥珀酰基、乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所述24个氨基酸的第一个氨基酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或A的组的氨基酸间接连接至所述N封端基团并且其中第一个氨基酸是C、HCY、CBZL或N，第二个氨基酸是Y，第三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，第四个氨基酸表示A或R，第五个氨基酸是C、HCY或L，第六个氨基酸是I，第七个氨基酸是一种酸性氨基酸，第八个氨基酸表示丙氨酸或一种酸性氨基酸，第九个氨基酸是L，第十个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，第十一个氨基酸是一种碱性氨基酸，第十二个氨基酸是丙氨酸或一种碱性氨基酸，第十三个氨基酸是一种亲脂性氨基。

4、酸，第十四个氨基酸是Q或R，第十五个氨基酸是E，第十六个氨基酸是Q，第十七个氨基酸是Q，第十八个氨基酸是E，第十九个氨基酸是K，第二十个氨基酸是N，第二十一个氨基酸是E，第二十二个氨基酸是A，第二十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸并且第二十四个氨基酸是L；任选地所述第二十四个氨基酸连接至一个选自R、R、L、TBA或K（棕榈酰）的组的氨基酸。2根据权利要求1所述的肽，其中第三个氨基酸选自A、L、I、F、V、W、TBA、NVA、ABU或CHA的组，第四个氨基酸是R或A，第七个氨基酸选自E或D，当是一种酸性氨基酸时，第八个氨基酸表示E，第十个氨基酸选自I或TBA，当是一种碱性氨基酸时，第十一个氨基酸是R。

5、或K，当是一种碱性氨基酸时，第十二个氨基酸是R或K，第十三个氨基酸选自A、NVA或ABU，并且权利要求书CN104159914A2/2页3第二十三个氨基酸是A或L。3根据权利要求1或2所述的肽，其中第一个氨基酸和第五个氨基酸彼此独立地是C或HCY并且其中所述第一个和所述第五个氨基酸经由B1、B2、B3、B21或B22连接。4根据以上权利要求中任一项所述的肽，其中当连接至第二十四个氨基酸时，氨基酸R间接附接至胆固醇或棕榈酰或其衍生物。5根据权利要求4所述的肽，在所述氨基酸R与所述胆固醇或棕榈酰或其衍生物之间具有一个接头，其中所述接头包括两个或更多个氨基酸，优选其中该接头是GLYSERGLYCYS。

6、（GSGC）或GLYSERGLYLYS（GSGK）。6根据以上权利要求中任一项所述的肽，其中氨基酸序列处于二聚体或三聚体构型。7根据权利要求1、2或3所述的肽，具有选自下组的氨基酸序列戊酰基ECYLACIEALIRAAQEQQEKNEAALRNH2、戊酰基ECYLACIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2或SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2，其中在该肽中的半胱氨酸（C）部分经由B1连接。8根据权利要求1或2所述的肽，具有以下氨基酸序列异戊酰基ECBZLYLALIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2。9根据权利要求15中任一项所述的肽，具有选自以下的。

7、氨基酸序列SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2和ACACYAACIEALIRAAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2，其中在该肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸（C）部分经由B1连接。10根据权利要求15中任一项所述的肽，具有选自以下的氨基酸序列SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK棕榈酰基NH2，其中在该肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸（C）部分经由B1连接；SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2以及SUCENYLRLIEELIRKAQEQQ。

8、EKNEAALRGSGK棕榈酰NH2。11如权利要求110中任一项所述的肽用于抑制HIV与一种宿主细胞融合或抑制HIV进入该宿主细胞中的用途。12如权利要求110中任一项所述的肽用于生产一种用以预防或用以治疗HIV与一种宿主细胞融合或HIV进入该宿主细胞中或人类的HIV感染的药物的用途。13药物组合物，包括具有根据权利要求110中任一项所述的氨基酸序列的肽连同一种药学上可接受的载体。权利要求书CN104159914A1/26页4HIV膜融合抑制剂0001本发明涉及人类免疫缺陷病毒HIV与宿主细胞相融合的一种抑制剂或HIV进入该宿主细胞的抑制剂，该抑制剂包括至少24个、但是优选是26个连续的氨基。

9、酸；本发明还涉及一种包括所述氨基酸的药物组合物。0002用于治疗HIV的当前疗法总体上靶向病毒酶逆转录酶和/或蛋白酶。然而，HIV的若干其他酶或结构蛋白例如包膜糖蛋白在感染中同样发挥关键作用。0003HIV包膜糖蛋白由两个通过前体GP160蛋白的蛋白酶剪切产生的相关亚单位GP120和GP41组成。它作为三个GP120和三个GP41亚单位的复合物存在于病毒膜中。GP41亚单位介导病毒与靶细胞的膜融合，从而允许HIV感染新的细胞。在靶细胞识别和受体结合中涉及GP120亚单位。0004由GP41介导的膜融合过程涉及糖蛋白的构象变化，这允许三聚体GP41的N端区N螺旋穿透细胞膜。这一插入之后，三个GP。

10、41亚单位的C端区C螺旋在N螺旋上折返。在GP41的N螺旋区与C螺旋区之间形成的六聚体螺旋相互作用被称作6螺旋束导致细胞膜和病毒膜的密切接近，这最终导致病毒膜与细胞膜融合。0005抑制这一稳定的6螺旋束的形成为预防HIV感染提供了一个令人感兴趣的途径。HIV包膜由带有包膜蛋白的脂双层组成，这些包膜蛋白由在外观上高度糖基化的GP120蛋白和GP41跨膜糖蛋白组成。GP41的分子序列包括所谓的“七肽重复HEPTADREPEAT”区HR1和HR2。一个七肽重复是一个由七个氨基酸的重复模式组成的结构基序。HIV进入宿主细胞起始于GP120与细胞CD4受体的结合及其与趋化因子共受体CCR5或CXCR4的。

11、随后结合。这触发了一系列暴露GP41融合结构域的构象变化，该融合结构域插入细胞膜中。然后，HR2区结合至由对应的HR1区形成的疏水槽，从而形成所述稳定的6螺旋束。这使得病毒膜与细胞膜接近以便融合和进入。由此可见，对6螺旋束形成的干扰阻止了病毒进入细胞。0006HIV的GP41包含两个形成所述6螺旋束的肽延伸被称作HR1和HR2，6螺旋束的形成是在病毒膜与宿主细胞膜融合背后的驱动力。真实的6螺旋束由3个平行的HR1延伸内部的卷曲螺旋、在外部沿着该内部的卷曲螺旋的槽以反向平行的方式补充的3个HR2延伸组成。0007所谓的N36SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL。

12、是HR1的一部分并且所谓的C34WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL是HR2的一部分。大多数当前的肽融合抑制剂是HR2模拟物，并且是C34的类似物或包含C34的部分。肽HR1模拟物的抗病毒潜力同样被用文件证明并且全部包含N36的最后17个氨基酸，也被称作N17LLQLTVWGIKQLQARIL。N36衍生的肽通常与肽标签融合，该肽标签同样是一个三聚体卷曲螺旋并且具有有利的溶解性特征，这部分是由于它们包含许多带电荷的侧链。融合以这样的一种方式发生，使得遵循七肽重复，典型的是卷曲螺旋拉链。此类肽标签的两个实例是所谓的IQ序列RMKQIEDKIEEIESKQKKIEN。

13、EIARIKK和所谓的IZ序列IKKEIEAIKKEQEAIKKKIEAIEK。在目的是找到抑制HIV融合的小分子的实验中，本领域的普通技术人员测试了许多肽，其中一些来源于关于HR1模拟物的已公开的作品。说明书CN104159914A2/26页50008在本领域中已知的所谓的HIV进入或HIV融合肽的问题之一是这些肽的相对低的抗病毒活性。这些肽的另一个问题，尤其是当预期被配制为一种适当的药物组合物时，是由于在所述肽中存在疏水性氨基酸而造成的差的溶解性。其结果是包括那些肽的药物组合物难于配制并且因此难于研发。0009此外，在本领域中相信用于最佳抗病毒活性的所谓的HIV进入或HIV融合肽应该在N端。

14、侧包含所谓的“吉姆口袋KIMPOCKET”结合基序或在C端侧包含脂类结合基序。两侧都被认为是抗病毒活性所不可或缺的。ECKERT埃克特和KIM吉姆，PNAS，2001，第98卷，第20期，第1118711192页。0010然而，对基于拥有用于药物配制品目的的高抗病毒活性以及可接受的溶解度的肽和/或小分子的所谓的融合或进入HIV抑制剂仍存在未满足的医学需要。0011根据本发明，一种肽的衍生物出人意料地显示出在低NM范围内极好的EC50的效力，这些衍生物在N端侧既不包含所谓的吉姆口袋结合基序在C端侧又不包含脂类结合基序，包括至少24个连接至N封端基团的连续的氨基酸，其中所述N封端基团选自琥珀酰基、。

15、乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所述24个氨基酸的第一个氨基酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或A的组的氨基酸间接连接至所述N封端基团。0012本发明的肽的长度是至少24个连续的氨基酸长并且连接至N封端基团，其中所述N封端基团选自琥珀酰基、乙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基或异戊酰基的组并且其中所述24个氨基酸的第一个氨基酸直接连接至该N封端基团或经由另一个选自E、A或A的组的氨基酸间接连接至所述N封端基团并且其中0013第一个氨基酸是C、HCY、CBZL或N，0014第二个氨基酸是Y，0015第三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，0016第四个氨基酸表示A或R，0017。

16、第五个氨基酸是C、HCY或L，0018第六个氨基酸是I，0019第七个氨基酸是一种酸性氨基酸，0020第八个氨基酸表示丙氨酸或一种酸性氨基酸，0021第九个氨基酸是L，0022第十个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，0023第十一个氨基酸是一种碱性氨基酸，0024第十二个氨基酸是丙氨酸或一种碱性氨基酸，0025第十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸，0026第十四个氨基酸是Q或R，0027第十五个氨基酸是E，0028第十六个氨基酸是Q，0029第十七个氨基酸是Q，0030第十八个氨基酸是E，0031第十九个氨基酸是K，说明书CN104159914A3/26页60032第二十个氨基酸是N，0033第二十一个氨。

17、基酸是E，0034第二十二个氨基酸是A，0035第二十三个氨基酸是一种亲脂性氨基酸并且0036第二十四个氨基酸是L，0037任选地所述第二十四个氨基酸连接至一个选自R、R、L、TBA或K棕榈酰的组的氨基酸。0038在一个另外的实施例中，本发明涉及一种上面提及的肽，其中第三个氨基酸选自A、L、I、F、V、W、TBA、NVA、ABU或CHA的组，0039第四个氨基酸是R或A，0040第七个氨基酸选自E或D，0041当是一种酸性氨基酸时，第八个氨基酸表示E，0042第十个氨基酸选自I或TBA，0043当是一种碱性氨基酸时，第十一个氨基酸是R或K，0044当是一种碱性氨基酸时，第十二个氨基酸是R或K，。

18、0045第十三个氨基酸选自A、NVA或ABU，并且0046第二十三个氨基酸是A或L。0047在另一个实施例中，当前发明涉及一种如上所定义的肽，其中第一个氨基酸和第五个氨基酸彼此独立地是C或HCY，并且其中所述第一个氨基酸和所述第五个氨基酸经由B1、B2、B3、B21或B22连接。当附接至这些B1、B2、B3、B21或B22部分用于对应的桥结构的这些缩写的含义参见下面时，获得一种根据本发明的在其N端部分具有一个环状肽结构II4侧链至侧链的肽一种所谓的CLIPS肽用化学方法连接至一个杂芳香族支架上的肽0048根据本发明的肽在C端氨基酸处可以直接或间接结合至胆固醇或棕榈酰或其衍生物。可替代地，它们可。

19、以通过包括两个或更多个氨基酸的接头连接。优选地，该接头由两个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸组成。这些氨基酸可以是天然存在的或合成的氨基酸。该接头优选包括GLYSERGLYCYSGSGC或GLYSERGLYLYSGSGK。0049所以，本发明的一部分还是一种如在上面提及的肽，其中当连接至第二十四个氨基酸时，氨基酸R间接附接至胆固醇或其衍生物，或间接附接至棕榈酰或其衍生物。胆固醇经由乙酰基结合至C端半胱氨酸酰胺或同型半胱氨酸酰胺的侧链，即用于附接至胆固醇的接头在其C端侧必有一种半胱氨酸酰胺或同型半胱氨酸酰胺参见下图2。0050所述氨基酸R和所述胆固醇或其衍生物优选地通过一个具有两个或更多个。

20、氨基酸，优选是两个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸例如GLYSERGLYCYSGSGC的接头连接。0051可替代地，所述氨基酸R和所述棕榈酰或其衍生物优选地通过一个具有两个或更多个氨基酸，优选是两个、三个或四个氨基酸，更优选是四个氨基酸例如GLYSERGLYLYSGSGK的接头连接。0052根据本发明的肽包括一个本身处于二聚体或三聚体构型的氨基酸序列。一个实例是本发明的肽通过例如一个SS桥用化学方法彼此连接。说明书CN104159914A4/26页70053根据本发明的优选肽分别具有选自下组的氨基酸序列戊酰基ECYLACIEALIRAAQEQQEKNEAALRNH2其中在该肽中的半胱氨酸。

21、C部分经由B1连接以及戊酰基ECYLACIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2其中在该肽中的半胱氨酸C部分经由B1连接。0054根据本发明的另一个优选肽是SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2，其中在该肽中的半胱氨酸C部分经由B1连接。0055根据本发明的另一个优选肽具有以下氨基酸序列异戊酰基ECBZLYLALIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2。0056具有选自SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2和ACACYAACIEALIRAAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2的氨基酸序。

22、列的肽也是高度优选的，其中在所述肽中在位置1和位置5处的半胱氨酸C部分经由B1或B3连接，然而B1是最优选的连接。0057非常优选的是具有氨基酸序列SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2的这种肽，其中在所述肽中的位置1和位置5处的半胱氨酸C部分经由B1连接。0058根据本发明的优选肽还是0059SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH20060SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK棕榈酰NH20061此外，根据本发明的肽优选在一种药物组合物中用于或可以用于抑制HIV与。

23、宿主细胞的融合或HIV进入宿主细胞中。0062那些药物组合物包括一种或多种发明的肽连同一种药学上可接受的载体。0063定义0064用于本说明书和权利要求书的目的并且就根据本发明的肽而论，术语“氨基酸”意在指代一个具有至少一个游离氨基基团以及至少一个游离羧基基团并且除了氨基或羧基基团以外可以进一步包括一个或多个游离化学反应性基团例如，羟基、巯基等的分子。该氨基酸可以是一种天然存在的L氨基酸在本说明书中顺序地描绘为大写字母或其对应的D对映异构体在本说明书中顺序地描绘为小写字母，一种合成的非天然存在的氨基酸例如顺序地用3字母代码表示，如TBA等，一种修饰的氨基酸，一种氨基酸衍生物，一种氨基酸前体，和。

24、/或一种保守取代。本领域的普通技术人员将了解，掺入一种肽中的氨基酸的选择将部分取决于抗病毒肽所需的具体的物理、化学或生物特征。此类特征部分由螺旋度和抗病毒活性的确定而确定。例如，本领域的普通技术人员将了解，一种合成肽中的氨基酸可以由一个或多个天然存在的L氨基酸及其对应的D对映异构体、或非天然存在的氨基酸像TBA等组成。0065在本说明书中使用“保守取代”来意指在合成肽的序列中的一个或多个氨基酸取代使得该合成肽仍展示出出人意料的、改进的生物活性。这包括与被置换的氨基酸基本上具有相同的电荷、大小、亲水性、和/或芳香性的氨基酸的取代。0066“CLIPS”肽是一种根据本发明的肽，这种肽在N端部分包括。

25、一个肽结构，这种肽结构形成自在所述N端部分第一个氨基酸与第五个氨基酸经由B1、B2、B3、B21或B22部分之一的连接其中需要一个游离的硫醇官能团。用于获得此类CLIPS肽的一种方法描述于WO2004/077062中。说明书CN104159914A5/26页80067术语“HIV”是指人类免疫缺陷病毒，并且更优选是HIV1。0068一种“药学上可接受的载体”意指一种不显著地改变该载体添加至其中的根据本发明的肽的生物活性的载体介质。此类载体是例如缓冲的水、等渗的水性缓冲溶液、含水醇以及类似物。0069术语“接头”是指一种作为用于可操作地连接两个不同的分子的分子桥的化合物或部分例如其中该接头的一部。

26、分结合至根据本发明的肽并且其中该接头的另一部分结合至胆固醇或其衍生物。0070“EC50”半最大有效浓度是一种化合物抑制一种生物学功能的有效性的量度。这一定量量度指示需要多少具体药物或其他物质抑制剂来抑制一半的给定的生物过程或过程的成分，即一种酶、细胞、细胞受体或微生物。根据FDA，EC50表示50体外抑制所需的药物的浓度0071在本说明书中使用的命名法0072如在本领域中已知的，对于L天然氨基酸而言，使用以下缩写0073说明书CN104159914A6/26页90074对于非天然氨基酸而言，使用以下命名法3字母代码00750076说明书CN104159914A7/26页100077对于根据本。

27、发明的那些肽而言，其中第一个氨基酸和第五个氨基酸是C或HCY，所述氨基酸通过B1、B2、B3、B21或B22连接并且在下文阐明了这些缩写的解释00780079对于根据本发明的肽使用的封端基团而言，使用以下缩写并且在下文给予解释00800081说明书CN104159914A108/26页110082根据本发明的肽列于下表中0083为清楚起见在下表中的编号“636661”对应于在HIV的GP160中的氨基酸编号，其中位置号637被认为是在根据本发明的肽中的第一个命名的氨基酸。所以例如，位置号646是第十个命名的氨基酸并且位置号660相应地被认为是在根据本发明的肽中的被命名的第二十四个氨基酸。008。

28、4另外，阐明在下表中的任何氨基酸序列在左端侧起始于对应的N封端基团并且在右端侧以甲酰胺结束。0085说明书CN104159914A119/26页120086根据本发明的优选七7肽被列于下面0087戊酰基ECYLACIEALIRAAQEQQEKNEAALRNH2所谓说明书CN104159914A1210/26页13的第一个氨基酸C与所谓的第五个氨基酸C的连接经由B1。0088戊酰基ECYLACIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH2所谓的第一个氨基酸C与所谓的第五个氨基酸C的连接经由B1。0089异戊酰基ECBZLYLALIEELIRKAQEQQEKNEAALRNH20090SUCECYL。

29、RCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH2所谓的第一个氨基酸C与所谓的第五个氨基酸C的连接经由B1。0091SUCECYLRCIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK棕榈酰NH2所谓的第一个氨基酸C与所谓的第五个氨基酸C的连接经由B1。0092SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH20093SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK棕榈酰NH20094最优选的是来自以上列表的以下两种肽0095SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGC胆甾醇基氧羰基甲基NH。

30、20096SUCENYLRLIEELIRKAQEQQEKNEAALRGSGK棕榈酰NH20097根据本发明的肽的制备。0098用于肽的FMOC合成的通用程序0099在使用42，4二甲氧基苯基FMOC氨基甲基苯氧基RINKAMIDE树脂的固相上通过FMOC化学合成具有C端甲酰胺的肽。将侧链官能度保护为NBOCK，W、OTBUD，E，S，T，Y、NTRTH，N，Q、STRTC，HCY、SACMC或NPBFR，R基团。ACM乙酰氨基甲基，BOC叔丁氧基羰基，TBU叔丁基，FMOC9芴基甲氧基羰基，PBF2，2，4，6，7五甲基二氢苯并呋喃5磺酰基，TRT三苯甲基0100对于每个氨基酸偶联步骤利用偶联。

31、方案在NMPN甲基2吡咯烷酮中使用5倍过量的HBTU21H苯并三唑1基1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸酯/HOBT羟基苯并三唑/FMOC氨基酸/DIEAN，N二异丙基乙胺1112，使用双偶联活化2030分钟。通过在室温下，使该树脂与在NMP中的AC2O乙酸酐/DIEA10110，V/V/V反应30MIN乙酰化该肽。通过使该肽树脂与在NMP中的10当量的琥珀酸酐和2当量的DIEA反应进行琥珀酰化。对于用丁酰基、异戊酰基、戊酰基以及己酰基封端N端，使用与用于氨基酸偶联的相同的方案。0101将这些肽从该树脂上剪切下来并且通过在室温下与包含133W苯酚、5V苯甲硫醚、25V1，2乙二硫醇、以及5VMIL。

32、LIQH2O的TFA三氟乙酸，40ML/MMOL树脂反应23小时使其完全脱保护。沉淀并用冰冷的乙醚/戊烷11洗涤，随后由ACN乙腈/水11冻干该沉淀材料，提供粗肽，将其通过反相高效液相色谱RPHPLC纯化。0102通过反相HPLC纯化制备的肽0103使用配备有DELTAPAK柱25X100或40X210MM，15M，沃特斯，美国说明书CN104159914A1311/26页14的沃特斯RCM模块，以1B/MIN的线性AB梯度溶剂A在水中的005TFA，溶剂B在ACN中的005TFA，以40或100ML/MIN的流速进行肽纯化该梯度的起始百分比基于在分析HPLC中的停留时间。在215NM处检测肽。

33、。收集纯的部分并冻干，产生该肽的三氟乙酸盐。0104与肽的CLIPS反应0105所谓的CLIPS反应的一个实例示例于图1中是通过使在ACN和水13的混合物中的浓度为05MM的完全未保护的肽与125当量的CLIPS试剂，二溴邻二甲苯、，二溴间二甲苯、，二溴对二甲苯、1，4双溴甲基萘、2，7双溴甲基萘、或苄基溴反应而进行的，通过添加02M碳酸氢铵水溶液将该反应混合物的PH调节至78。一小时后，用10TFA将该反应混合物淬灭。在纯化之前部分地除去ACN旋转蒸发器；在疏水性肽的情况下，不除去ACN。01060107作为实例的胆固醇连接的肽82的合成0108使用如上所述的通用合成方案在固相250MOL6。

34、X100MOL上合成肽中间产物I1。将C端半胱氨酸偶联为FMOCCYSACMOHORPEGENPEPTIDECHEMICALSGMBH公司，德国。在配备有DELTAPAK柱40X210MM，15M，沃特斯，美国USA的沃特斯RCM模块上，以在20分钟内起始于22至42B的线性梯度溶剂A在水中的005TFA，溶剂B在ACN中的005TFA，以100ML/MIN的流速四个批次地纯化该粗肽2793MG。收集纯的部分并且在减压下浓缩旋转蒸发器，在由ACN/水11冻干后得到820MG的I1的三氟乙酸盐。0109将肽中间产物I1820MG，225MOL溶解于水110ML和ACN340ML的混合物中，添加在。

35、ACN28ML中的，二溴对二甲苯74MG，280MOL，随后添加碳酸氢铵水溶液56ML的02M溶液。将该反应混合物搅拌一小时，用10TFA酸化至PH3并且将其直接在DAVISILC18制备型HPLC柱50X277MM，1624M，格瑞斯公司GRACE，美国上，以在20分钟内23至43B的线性梯度溶剂A在水中的005TFA，溶剂B在ACN中的005TFA，以120ML/MIN的流速进行纯化。使注射液在13B中以60ML/说明书CN104159914A1412/26页15MIN运行5MIN。在蒸发旋转蒸发器并冻干由ACN/水11后，得到576MG的I2的三氟乙酸盐。0110将肽中间产物I2576M。

36、G，154MOL溶解于8M盐酸胍水溶液154ML中，随后在剧烈搅拌下添加甲醇123ML和I2154ML的在甲醇中的34MG/ML溶液，2MMOL。15MIN后，添加DTT二硫苏糖醇，77ML并且使用385ML的02M碳酸氢铵水溶液将该反应混合物的PH调节至PH7。在减压下蒸发甲醇旋转蒸发器并且将获得的粗产物在DAVISILC18制备型HPLC柱50X277MM，1624M，格瑞斯公司GRACE，美国上，以在20分钟内24至44B的线性梯度溶剂A在水中的005TFA，溶剂B在ACN中的005TFA，以120ML/MIN的流速进行纯化。使注射液在14B中以60ML/MIN运行5MIN。在蒸发旋转蒸。

37、发器并冻干由ACN/水11后，得到421MG的肽中间产物I3。0111在剧烈搅拌下，将胆固醇162MG，在5MLDCM二氯甲烷中，420MOL、溴乙酸556MG，在2MLDCM中，400MOL以及DMAP4二甲基氨基吡啶，5MG，在1MLDCM中，40MOL混合。添加DCC二环己基碳二亚胺，825MG，在1MLDCM中，400MOL并且将反应混合物在室温下搅拌两小时。通过过滤除去沉淀物。将获得的一半滤液添加至在DMFN，N二甲基甲酰胺，10ML中的I34201MG，0115MMOL的溶液中，随后添加浓缩的碳酸氢铵水溶液，直到得到PH为7。搅拌该反应混合物直到完全转化70MIN，通过LCMS进行。

38、监测并且随后通过添加TFAPH3进行淬灭。通过用氮起泡蒸发掉大部分DCM。将该肽在配备有DELTAPAK柱40X210MM，15M，沃特斯，美国的沃特斯RCM模块上，以在30分钟内45至75B的线性梯度溶剂A在水中的005TFA，溶剂B在ACN中的005TFA，以100ML/MIN的流速进行纯化。使注射液在35B中以50ML/MIN运行5MIN。在减压下浓缩纯的部分旋转蒸发器并由ACN/水11冻干，以产生245MG作为三氟乙酸盐的胆固醇连接的肽82。0112说明书CN104159914A1513/26页160113UPLC分析0114如在对应的方法中指明的，使用LC泵、二极管阵列DAD或UV检。

39、测器以及一个柱进行UPLC超高效液相色谱测量。必要的话，包括另外的检测器参见以下方法的表格。0115将来自该柱的流引至质谱仪MS，该质谱仪配置有大气压离子源。设置调谐参数例如扫描范围、驻留时间以便获得允许鉴定化合物的分子量MW的离子在本领域的普通技术人员的知识内。使用适当的软件进行数据采集。0116通过其实验停留时间RT及其分子量对肽进行描述。使用MASSLYNX软件沃特斯，美国，由来自一种肽的所有观察到的质子化状态的实验质荷M/Z比计算分子量。0117在下文中，“BEH”桥联乙基硅氧烷/硅石混合物，“DAD”二极管阵列检测器，“QTOF”四极管飞行时间质谱仪，“SQD”单一四极管检测器。01。

40、18表UPLC方法代码以ML/MIN表示流量；以表示柱温T。0119说明书CN104159914A1614/26页170120使用的测定描述与结果0121标准抗病毒实验“AVE”野生型HIV菌株IIIBHIV菌株HXB2D一侧定向突变体V38A和Q40H0122测定原理0123HIV1复制测定测量作为增强型绿色荧光蛋白EGFP表达的诱导的病毒复制HIV野生型病毒菌株IIIB或HXB2D，或在GP41基因中具有突变V38A或Q40H的HIV突变病毒株HXB2D。指示物MT4LTREGFP细胞包含处于HIV1LTR启动子序列的控制之下的EGFP基因。成功的HIV1感染导致病毒TAT蛋白质表达并且随。

41、后诱导EGFP表达。预期与未处理的HIV感染的对照相比，抑制HIV1感染的化合物/肽减少EGFP表达。0124方法0125将测试化合物/肽的4倍系列稀释物与HIV1IIIB、HXB2D、或HXB2D突变病毒V38A或Q40H和MT4LTREGFP细胞混合并且将其在37下进行孵育。3天后，使用氩激光器扫描显微镜检查孔的EGFP表达。通过EGFP信号对化合物浓度的对数的线性插值确定抑制50的病毒诱导的EGFP信号的有效化合物/肽浓度EC50；添加T20、C34和西夫韦肽作为参考化合物。对于V38A和Q40H突变病毒，结果被报道为与药物易感的野生型菌株HXB2D相比的EC50的倍数变化，该野生型菌株。

42、形成该突变病毒的骨架。0126标准AVE50人血清0127测定原理0128HIV1复制测定具有50人血清测量在50人血清的存在下的作为增强型绿色荧光蛋白EGFP表达的诱导的病毒复制。指示物MT4LTREGFP细胞包含处于HIV1LTR启动子序列的控制之下的EGFP基因。成功的HIV1感染导致病毒TAT蛋白质表达并且随后诱导EGFP表达。预期与未处理的HIV感染的对照相比，抑制HIV1感染的化合物/肽减少EGFP表达。在该测定中，预期与人血清结合的化合物/肽具有用于抑制病毒的减少的活性。0129方法0130在50人血清的存在下，将测试化合物/肽的4倍稀释物与HIV1和MT4LTREGFP细胞混合。

43、并且将其在37下进行孵育。3天后，使用氩激光器扫描显微镜检说明书CN104159914A1715/26页18查孔的EGFP表达。通过EGFP信号对化合物浓度的对数的线性插值确定抑制50的病毒诱导的EGFP信号的有效化合物/肽浓度EC50；添加T20、C34和西夫韦肽作为参考化合物。将结果报道为与在不具有人血清的测定中获得的EC50相比的EC50的倍数变化。0131说明书CN104159914A1816/26页190132说明书CN104159914A1917/26页200133说明书CN104159914A2018/26页210134说明书CN104159914A2119/26页220135说。

44、明书CN104159914A2220/26页230136说明书CN104159914A2321/26页240137说明书CN104159914A2422/26页250138说明书CN104159914A2523/26页260139说明书CN104159914A2624/26页270140说明书CN104159914A2725/26页280141ND未确定。0142PBD口袋结合结构域说明书CN104159914A2826/26页290143上面描述了在圆括弧中指明的分析方法A和B；A起始于5B的线性AB梯度30B/MIN，A起始于25B的线性AB梯度25B/MIN。说明书CN104159914。

45、A291/49页3000010002序列表CN104159914A302/49页310003序列表CN104159914A313/49页320004序列表CN104159914A324/49页330005序列表CN104159914A335/49页340006序列表CN104159914A346/49页350007序列表CN104159914A357/49页360008序列表CN104159914A368/49页370009序列表CN104159914A379/49页380010序列表CN104159914A3810/49页390011序列表CN104159914A3911/49页400012。

46、序列表CN104159914A4012/49页410013序列表CN104159914A4113/49页420014序列表CN104159914A4214/49页430015序列表CN104159914A4315/49页440016序列表CN104159914A4416/49页450017序列表CN104159914A4517/49页460018序列表CN104159914A4618/49页470019序列表CN104159914A4719/49页480020序列表CN104159914A4820/49页490021序列表CN104159914A4921/49页500022序列表CN10415。

47、9914A5022/49页510023序列表CN104159914A5123/49页520024序列表CN104159914A5224/49页530025序列表CN104159914A5325/49页540026序列表CN104159914A5426/49页550027序列表CN104159914A5527/49页560028序列表CN104159914A5628/49页570029序列表CN104159914A5729/49页580030序列表CN104159914A5830/49页590031序列表CN104159914A5931/49页600032序列表CN104159914A6032/。

48、49页610033序列表CN104159914A6133/49页620034序列表CN104159914A6234/49页630035序列表CN104159914A6335/49页640036序列表CN104159914A6436/49页650037序列表CN104159914A6537/49页660038序列表CN104159914A6638/49页670039序列表CN104159914A6739/49页680040序列表CN104159914A6840/49页690041序列表CN104159914A6941/49页700042序列表CN104159914A7042/49页710043序列表CN104159914A7143/49页720044序列表CN104159914A7244/49页730045序列表CN104159914A7345/49页740046序列表CN104159914A7446/49页750047序列表CN104159914A7547/49页760048序列表CN104159914A7648/49页770049序列表CN104159914A7749/49页78序列表CN104159914A78。