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1、(10)申请公布号 CN 104147006 A (43)申请公布日 2014.11.19 CN 104147006 A (21)申请号 201410304794.0 (22)申请日 2014.06.26 A61K 31/4375(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道 639 号 (72)发明人 强晓妍 张壮伟 许露露 王印行 张鹏成 王永辰 陈欢 李睿岩 张玉彬 (54) 发明名称 盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和 / 或治疗 异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了如式 (I。
2、) 所示的盐酸去亚甲基 小檗碱在制备预防和 / 或治疗异烟肼致药源性肝 损伤药物中的应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104147006 A CN 104147006 A 1/1 页 2 1.如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗异烟肼致药源性肝损伤 药物中的应用。 2. 一种预防或治疗异烟肼致药源性肝损伤的药物组合物， 其特征在于， 含有药物有效 剂量的如式 (I) 所示盐酸去亚甲基小檗碱及药用载体。 3.。
3、 根据权利要求 2 的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物可以是片剂、 胶囊、 丸 剂、 注射剂、 缓释剂及各种微粒给药系统。 权 利 要 求 书 CN 104147006 A 2 1/8 页 3 盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和 / 或治疗异烟肼致药源 性肝损伤药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和 / 或治疗 异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。 背景技术 0002 异烟肼 (isoniazid， INH) 作为最重要的抗结核首选药物之一， 但在临床使用中被 广泛报道导致肝转氨酶升高， 约有 10-20的患者存在不同程度的肝毒性。
4、， 更有约 1.6的 患者出现严重的中毒性肝炎。 由于异烟肼临床处方用药周期较长和肝脏毒副作用， 因而， 患 者在服药期间需定期严密观察肝功能指标。 通常认为INH通过N-乙酰基转移酶2(N-acetyl transferase2， NAT2) 等酶的催化下生成乙酰异烟肼、 异烟酸、 乙酰肼和肼等代谢产物， 其中 肼被认为是最主要的毒性代谢产物之一， 可与肝中生物大分子共价结合， 可直接与肝细胞 发生过氧化反应， 并诱发 DNA 损伤而介导凋亡的发生， 引起不可逆的肝损伤。 0003 细胞色素 P4502E1(CYP2E1) 主要负责内源和外源化合物在体内的生物转化。药 物在体内经 CYP2E。
5、1 代谢可产生大量自由基， 导致脂质过氧化以及 DNA 双链断裂， 造成不同 程度的细胞损伤， 因而， CYP2E1 被认为是人体对药物介导的氧化应激损伤敏感性的重要标 志物之一。氧化应激是由于生物体内活性氧的生成与机体解毒和修复损伤能力失衡造成 的， 在 INH 引起的肝损伤中发挥着重要作用。研究表明， INH 的代谢产物肼和乙酰肼在肝 脏内经 CYP2E1 氧化代谢后引起氧化应激， 影响肝脏内的抗氧化酶系统， 引起肝脏内还原型 GSH(glutathione， GSH) 等抗氧化物耗竭， 使肝细胞功能发生紊乱， 最终导致氧化型肝损伤。 0004 目前临床上用于预防和 / 或治疗异烟肼药源性。
6、肝损伤的药物不多。葡醛内酯治疗 可以改善患者服用异烟肼转氨酶升高。 甘草酸制剂、 水飞蓟素类、 五味子乙酸和还原型谷胱 甘肽等药物有不同程度的抗氧化、 抗炎和保护肝细胞膜及细胞器等作用， 临床应用可保护 肝脏， 防止药源性肝损伤。 这些药物有的价格昂贵， 有的效果不显著， 有些作用机理不明确。 因此， 研发安全有效保护异烟肼致药源性肝损伤的治疗药物已成为当前药物研究的热点领 域之一。 0005 盐酸去亚甲基小檗碱， 如式 (I) 所示， 又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小 檗碱盐酸盐。 0006 说 明 书 CN 104147006 A 3 2/8 页 4 0007 盐酸去亚甲基小檗碱 ( 。
7、式 I) 的英文名为 Demethyleneberberine Hydrochloride 或 Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为 DMB。式 (I) 中的骨架 结构为去亚甲基小檗碱， 它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学 联合会 (IUPAC) 将式 (I) 中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名 9， 10-dimethoxy-5， 6-dihydroisoquinolino2， 1-bisoquinolin-7-ium-2， 3-diol， 其中文名为 9， 10- 二甲氧 基 -5， 6- 二氢异喹啉 2， 1-b 异喹啉 -7。
8、- 鎓 -2， 3- 二羟基。它的分子式 ： C19H18NO4+， 分子 量为 ： 324.35。 化学文摘号(CAS)为 ： 25459-91-0。 去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸 形成多种盐， 如氯化盐、 硫酸盐、 磷酸盐、 溴化盐、 碘化盐、 枸橼酸盐、 延胡索酸盐、 马来酸盐、 苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。 0008 去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏 (Cortex Phellodendri Chinensis)中， 由于含量较低， 相关活性研究很少。 有报道认为它在体外对多种革兰阳性及 阴性菌均具有抑菌作用。 近年来人们对小檗碱研究非常活跃， 发现小檗碱除抗。
9、菌活性外， 还 具有降血糖、 降血脂、 抗炎、 抗病毒和抗肿瘤等药理作用。人们在研究小檗碱体内代谢过程 中， 发现小檗碱在体内经肝脏代谢亦可产生去亚甲基小檗碱， 但对该代谢产物 DMB 在预防 和 / 或治疗异烟肼致药源性肝损伤的治疗作用研究未见报道。 0009 迄今为止， 现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱或去亚甲基小檗碱对预防和 / 或治疗异烟肼致药源性肝损伤作用的记载和报道。 发明内容 0010 为了克服现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种预防和 / 或治疗异烟肼致 药源性肝损伤的化合物， 特别是提供了如式 (I) 所示的盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 作为预 防和 / 或治疗异。
10、烟肼致药源性肝损伤药物的应用。 0011 本发明通过建立异烟肼致药源性肝损伤动物模型， 观察盐酸去亚甲基小檗碱对异 烟肼致药源性肝损伤的预防与治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明， 盐酸去亚甲基 小檗碱 (DMB) 对异烟肼致药源性肝损伤具有预防保护和治疗作用。 0012 本发明通过MTT法， 细胞水平分析DMB对异烟肼致肝损伤的保护作用， 研究结果表 明 ： 在人源肝癌细胞系HepG2中， 盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)呈剂量依赖性的提高异烟肼致 损的细胞存活率。相对于单纯暴露于 25mM 异烟肼而言， 12.5M 和 25M DMB 分别提高异 烟肼致损细胞存活率 16和 33。在人源正常。
11、永生化细胞系 L02 中， 同样观察到 DMB 对异 烟肼损伤的逆转作用， 相较于单纯暴露于 25mM 异烟肼， 25M DMB 提高异烟肼致损细胞存 活率27。 因此， 从细胞水平上， 可以判断盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)的对异烟肼所致的药 源性肝损伤有一定的保护作用。 0013 本发明通过以小鼠为动物模型， 研究发现盐酸去亚甲基小檗碱对异烟肼引起的小 鼠肝损伤具有保护作用。 本发明以小鼠为动物试验模型， 通过给药治疗， 考察盐酸去亚甲基 小檗碱 (DMB) 对异烟肼引起的小鼠肝损伤的预防性治疗作用。按照药理学剂量换算， 小鼠 每日灌胃相当于人日常用量的异烟肼 (100mg/kg)21 天，。
12、 使小鼠模拟临床使用异烟肼时造 成的药源性肝损伤， 同时分别给予 DMB15mg/kg(IP) 和 30mg/kg(IP) 药物治疗， 研究给予？ ？ DMB 治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能以及肝氧化损伤的保护作用。正常对照组以及 模型组给予相同体积的赋形剂， 21 天后处死动物。实验结果分析表明， 小鼠经连续 21 天异 说 明 书 CN 104147006 A 4 3/8 页 5 烟肼灌胃后， 与对照组小鼠相比， 模型组小鼠 ALT 升高 34.5。与模型组相比， DMB 给药组 小鼠 ALT 均下降约 45， 并恢复至正常水平及以下 ； 小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对 照组。
13、小鼠相比， 模型组小鼠 AST 升高 103.2， 与模型组相比， DMB 给药组小鼠 AST 均下降 约 30， 并恢复至接近正常水平。同时给予 DMB 治疗能显著降低异烟肼所致肝损伤引起的 ALT、 AST 升高。由此可见， DMB 具有明显的抗异烟肼致药源性肝损伤和保护肝功能的作用。 0014 此外， 小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组相比， 模型组异烟肼引起的肝 损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物 MDA 升高 75.0， GSH 降低 27.0， GPx 活性分别降低 11.7。而与模型组相比， DMB 低剂量 (15mg/kg， IP) 和高剂量 (30mg/kg， IP) 给。
14、药组 MDA 分别降低 14.3和 45.2， 而 GPx 活性分别提高了 7.8、 和 24.9， 以及 DMB 高剂量组 GSH 升高 36.5， 恢复至接近正常水平。并且 DMB 对脂质过氧化物 MDA 的降低、 GSH 的升高 和 GPx 活性的提高具有显著的浓度依赖性， 高剂量组的治疗效果优于低剂量组。因此， DMB 具有降低脂质过氧化产物 MDA 水平， 促进 GSH 再生， 增强肝脏自由基的清除， 防止脂质过氧 化的能力。 0015 肝脏病理学研究结果表明 ： 正常对照组肝脏形态未见异常， 肝细胞排列规则 ； 模 型组肝脏有明显嗜酸性病变和脂肪浸润现象。而给药组上述病变明显减轻，。
15、 恢复至接近正 常对照组水平， 其中 DMB 低剂量给药组的嗜酸性病变显著减少， 但仍有少量脂肪浸润以及 细胞水肿现象， DMB 高剂量给药组几乎未见异常病变现象。实验结果表明盐酸去亚甲基小 檗碱 (DMB) 能有效预防治疗异烟肼引起的肝损伤小鼠肝脏病变。蛋白质免疫印迹实验结果 表明 ： 小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组相比， 模型组小鼠肝脏 CYP2E1 表达量显著 升高， 给药 DMB(30mg/kg， IP) 后小鼠肝脏 CYP2E1 表达量明显降低， 实验结果表明盐酸去亚 甲基小檗碱(DMB)通过有效降低肝脏CYP2E1的蛋白表达， 从而减轻由肝药酶表达增加导致 的氧化应激。
16、损伤， 可有效缓解环节异烟肼引起的肝损伤。 0016 本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 产品采用常规化学与分离纯化法制得。本 实验室采用高效液相色谱 (HPLC) 分析检测， 其纯度达 98以上， 并经化学法、 质谱 (MS) 法 和核磁共振 (1H-NMR) 法分析鉴定， 表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 产品化学结 构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 其纯度和化学结构符合开展体内、 外生 物学活性和药理作用研究要求。 0017 本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅 剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有 0.1 95重量。
17、的盐酸去亚甲基小檗碱。在 单元剂型中本发明化合物一般含量为 0.1 100mg。 0018 本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时， 如果 需要， 可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和 / 或辅剂结合， 制成可作 为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。 0019 本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药， 给药途径可为肠道 或非肠道， 如口服、 肌肉、 皮下、 鼻腔、 口腔粘膜、 皮肤、 腹膜或直肠等。 0020 本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。 注射包括静脉注 射、 肌肉注射、 皮下注射、 皮内注射和穴位注射等。
18、。 0021 给药剂型可以是液体剂型、 固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、 胶体类、 微粒 剂型、 乳剂剂型、 混悬剂型。其他剂型例如片剂、 胶囊、 滴丸、 气雾剂、 丸剂、 粉剂、 溶液剂、 混 说 明 书 CN 104147006 A 5 4/8 页 6 悬剂、 乳剂、 颗粒剂、 栓剂、 冻干粉针剂等。 0022 本发明化合物可以制成普通制剂、 也可以是缓释制剂、 控释制剂、 靶向制剂及各种 微粒给药系统。 0023 例如为了将单位给药剂型制成片剂， 可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于 载体的例子是， 例如稀释剂与吸收剂， 如淀粉、 糊精、 硫酸钙、 乳糖、 甘露醇、 蔗糖、 氯化钠。
19、、 葡 萄糖、 尿素、 碳酸钙、 白陶土、 微晶纤维素、 硅酸铝等 ； 湿润剂与粘合剂， 如水、 甘油、 聚乙二 醇、 乙醇、 丙醇、 淀粉浆、 糊精、 糖浆、 蜂蜜、 葡萄糖溶液、 阿拉伯胶浆、 明胶浆、 羧甲基纤维素 钠、 紫胶、 甲基纤维素、 磷酸钾、 聚乙烯吡咯烷酮等 ； 崩解剂， 例如干燥淀粉、 海藻酸盐、 琼脂 粉、 褐藻淀粉、 碳酸氢钠与枸橼酸、 碳酸钙、 聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、 十二烷基磺酸钠、 甲 基纤维素、 乙基纤维素等 ； 崩解抑制剂， 例如蔗糖、 三硬脂酸甘油酯、 可可脂、 氢化油等 ； 吸 收促进剂， 例如季铵盐、 十二烷基硫酸钠等 ； 润滑剂， 例如滑石粉、 二氧。
20、化硅、 玉米淀粉、 硬脂 酸盐、 硼酸、 液体石蜡、 聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片， 例如糖包衣片、 薄膜 包衣片、 肠溶包衣片， 或双层片和多层片。 0024 例如为了将给药单元制成丸剂， 可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体 的例子是， 例如稀释剂与吸收剂， 如葡萄糖、 乳糖、 淀粉、 可可脂、 氢化植物油、 聚乙烯吡咯烷 酮、 单硬脂酸甘油脂、 高岭土、 滑石粉等 ； 粘合剂， 如阿拉伯胶、 黄蓍胶、 明胶、 乙醇、 蜂蜜、 液 糖、 米糊或面糊等 ； 崩解剂如琼脂粉、 干燥粉、 海藻酸盐、 十二烷基磺酸钠、 甲基纤维素、 乙基 纤维素等。 0025 例如为了将给药单元。
21、制成胶囊， 将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与 上述的各种载体混合， 并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效 成分本发明化合物制成微囊剂， 混悬于水性介质中形成混悬剂， 亦可装入硬胶囊中或制成 注射剂应用。 0026 例如， 将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂， 如溶液剂、 混悬剂溶 液剂、 乳剂、 冻干粉针剂， 这种制剂可以是含水或非水的， 可含一种和 / 或多种药效学上可 接受的载体、 稀释剂、 粘合剂、 润滑剂、 防腐剂、 表面活性剂、 分散剂、 渗透压调节剂、 增溶剂 和 pH 调节剂。如稀释可选用水、 乙醇、 聚乙二醇、 1， 3- 丙二醇、 。
22、乙氧基化的异硬脂醇、 多氧 化的 异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨醇脂、 脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、 甘露醇、 甘 油、 葡萄糖、 磷酸盐、 醋酸盐等 ； 增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、 卵磷脂、 羟丙基 B- 环糊精 等 ； pH 调节剂可以是磷酸盐、 醋酸盐、 盐酸、 氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂， 还可以加入甘 露醇、 葡萄糖等作为支撑剂。 0027 此外， 如需要， 也可以向药物制剂中添加着色剂、 防腐剂、 香料、 矫味剂、 甜味剂或 香料等。这些辅料是本领域常用的。 0028 本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。 可 将它们灭菌， 例如通过经由细菌。
23、过虑器过滤、 通过向组合物中加入灭菌剂、 通过将组合物放 射处理、 或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。 0029 为了达到用药目的， 增加治疗效果， 本发明的药物或药物组合物可用任何公知的 给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因 为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同， 因此在组织中获得治疗浓度 的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于逐渐增加治疗剂量， 初始剂量将取决 说 明 书 CN 104147006 A 6 5/8 页 7 于给药途径。 0030 对于任何特定患者， 本发明化合物药物组合物的给药剂。
24、量取决于许多因素， 例如 所要预防或治疗疾病的性质和严重程度， 患者或动物的性别、 年龄、 性格及个体反应， 给药 途径、 给药次数、 治疗目的， 因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患 者的病症， 可能必须对剂量作出某些改变， 并且在任何情况下， 都由医师决定个体患者的合 适剂量。 0031 给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。 一般来讲， 本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。 可以根据本发明化合物组合物中 最后的制剂中所含有的实际药物数量， 加以适当的调整， 以达到其治疗有效量的要求， 完成 本发明的预防或治疗目的。 可以是单一剂量形。
25、式给药或分成几个， 例如二、 三或四个剂量形 式给药 ； 这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的 化合物或组合物可单独服用， 或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。 0032 去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物， 又是小檗碱在 体内肝脏中的代谢产物， 天然环保， 无毒高效。 本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备预 防和 / 或治疗异烟肼致药源性肝损伤药物中的应用。 0033 术语 0034 ALT ： 谷丙转氨酶 ； 0035 AST ： 谷草转氨酶 ； 0036 DMB ： 盐酸去亚甲基小檗碱 ； 0037 DMSO ： 二甲亚砜。
26、 ； 0038 GPx ： 谷胱甘肽过氧化物酶 ； 0039 GSH ： 谷胱甘肽 ； 0040 INH ： 异烟肼 ； 0041 IP ： 腹腔注射 ； 0042 MDA ： 丙二醛 附图说明 0043 图 1DMB 对异烟肼所致 HepG2 和 L02 细胞损伤的保护作用 0044 其中， A ： DMB 和 INH 对 HepG2 细胞的生长影响 ； B ： DMB 和 INH 对 L02 细胞的生长影 响 0045 图 2 DMB 预防性治疗改善异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能 0046 其中， A ： DMB 和 INH 对小鼠血清 ALT 的影响 ； B ： DMB 和 INH 对小鼠。
27、血清 AST 的影响 0047 图 3DMB 改善预防性治疗对异烟肼引起的肝氧化应激损伤 0048 其中， A ： DMB 和 INH 对小鼠肝组织 MDA 的影响 ； B ： DMB 和 INH 对小鼠肝组织 GSH 的 影响 ； C ： DMB 和 1NH 对小鼠肝组织 GPx 的影响 0049 图 4DMB 对异烟肼所致药源性肝损伤病理形态的影响 0050 其中， A ： 正常小鼠肝组织HE染色图(400) ； B ： 异烟肼损伤模型小鼠肝组织HE染 色图 (400) ； C ： DMB 低剂量组小鼠肝组织 HE 染色图 (400) ； D ： DMB 高剂量组小鼠肝组织 HE 染色 (。
28、400)。黑色箭头标注为嗜酸性病变部位， 红色箭头标注为脂肪浸润病变部位。 说 明 书 CN 104147006 A 7 6/8 页 8 0051 图 5DMB 对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝药酶 CYP2E1 表达的抑制作用 具体实施方式 0052 下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方式 限制本发明。 0053 一、 体外生物活性试验 0054 实施例 1. 盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 对异烟肼致药源性肝损伤保护作用 0055 方法 ： 通过 MTT 法， 细胞水平分析 DMB 对异烟肼致药源性肝损伤的保护作用。取对 数生长期的人肝癌细胞 HepG2 或人源。
29、正常永生化细胞系 L02(ATCC) 接种于 96 孔细胞培养 板 (Costar) 内， 以添加 10胎牛血清 ( 兰州民海生物工程有限公司， 批号 ： 20120927) 的 DMEM 培养基 (Gibico， 批号 ： 1312056) 培养至一定融合度后， 除正常对照组加入相同赋形剂 外， 均加入终浓度为 25mM 的异烟肼， 给药组同时加入终浓度分别为 6.25， 12.5 或 25M 的 DMB， 各组同时进行6个复孔。 孵育24小时后， 换以含有10MTT无血清DMEM孵育4h， 吸尽 各孔液体后， 每孔加入 150ul 二甲亚砜 (DMSO)， 37摇床混匀 15 分钟后， 4。
30、90nm 读取相应吸 光度值。存活率计算方法如下 ： 存活率 (100 ) ( 对照孔吸光度值 - 样本孔吸光度值 )/ 对照孔吸光度值 100。 0056 结果 ： 实验结果显示， 在人源肝癌细胞系 HepG2 中， 盐酸去亚甲基小檗碱 (DMB) 呈 剂量依赖性的提高异烟肼致损的细胞存活率， 相较于单纯暴露于 25mM 异烟肼， 12.5M 和 25M DMB 分别提高细胞存活率 16， 33。在人源正常永生化细胞系 L02 中， 同样观察到 DMB对异烟肼损伤的逆转作用， 相较于单纯暴露于25mM异烟肼， 25M DMB提高细胞存活率 27。如图 1 所示。因此， 盐酸去亚甲基小檗碱 (。
31、DMB) 的对异烟肼所致的药源性肝损伤可 能有一定的保护作用。 此细胞水平的药效结果是后续整体水平药理作用研究的重要前提和 保障。 0057 二、 体内药理实验研究 0058 实施例 2.DMB 预防性治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝功能的保护作用 0059 方法 ： 雄性 ICR 小鼠， 体重 22-24 克， 随机分为 4 组， 每组 8 只。4 组分别为正常对 照组、 模型组、 DMB 低剂量给药组 (15mg/kg， IP)、 DMB 高剂量给药组 (30mg/kg， IP)。所有小 鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼(100mg/kg)。 同时给药组小鼠腹腔注射分别给 予高、 低剂。
32、量的DMB， 每天一次， 其余各组给予相同体积赋形剂， 共21天。 末次给药后禁食过 夜， 摘眼球取血， 静置30分钟， 离心3000rpm/10min， 常规分离血清。 用南京建成试剂盒分析 测定血清中 ALT 和 AST 活性。 0060 结果 ： 实验结果如表 1 所示。小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组小鼠相比， 模型组小鼠 ALT 升高 34.5。与模型组相比， DMB 低剂量给药组、 DMB 高剂量给药组小鼠 ALT 分别下降 46.1、 42.1。小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组小鼠相比， 模型组 小鼠 AST 升高 103.2， 与模型组相比， DMB 低。
33、剂量给药组、 DMB 高剂量给药组小鼠 AST 分别 下降37.8、 27.9， 并恢复至接近正常水平。 同时给予DMB治疗能显著降低异烟肼所致肝 损伤引起的 ALT、 AST 升高。由此可见， DMB 具有明显的抗异烟肼致药源性肝损伤和保护肝 功能的作用。如图 2 所示。 0061 表 1 DMB 预防性治疗降低对异烟肼引起的肝损伤小鼠 ALT 和 AST 的影响 说 明 书 CN 104147006 A 8 7/8 页 9 0062 0063 (n 8， meanvariance.*p 0.05， *p 0.01， *p 0.001vs Model) 0064 实施例 3.DMB 预防性治。
34、疗对异烟肼引起的肝氧化损伤的保护作用 0065 方法 ： 雄性 ICR 小鼠， 体重 22-24 克， 随机分为 4 组， 每组 8 只。4 组分别为正常对 照组、 模型组、 DMB 低剂量 (15mg/kg， IP) 给药组和 DMB 高剂量 (30mg/kg， IP) 给药组。所有 小鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼(100mg/kg)。 同时给药组小鼠腹腔注射分别 给予高、 低剂量的DMB， 每天一次， 其余各组给予相同体积赋形剂， 共21天。 末次给药后禁食 过夜， 处死动物， 不同小鼠取同一部位肝组织， 于冰浴上以 PBS 制成 10肝匀浆。按照试剂 盒 ( 南京建成 ) 说明。
35、测定肝组织中脂质过氧化物 MDA 水平。DTNB 法测定抗氧化物质 GSH。 根据试剂盒 ( 南京建成 ) 说明分析肝脏中抗氧化酶 GPx 水平。 0066 结果 ： 实验结果如表 2 所示。小鼠经连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组相比， 模 型组异烟肼引起的肝损伤导致小鼠肝脏脂质过氧化物 MDA 升高 75.0， GSH 降低 27.0， GPx 活性分别降低 11.6。与模型组相比， DMB 低剂量和高剂量组 MDA 分别降低 14.3和 45.2， 而GPx活性分别提高了7.8、 和24.9， 以及DMB高剂量组GSH升高36.5， 恢复 至接近正常水平。另外， DMB 对脂质过氧化。
36、物 MDA 的降低、 GSH 的升高和 GPx 活性的提高具 有显著的浓度依赖性， 高剂量组的治疗效果优于低剂量组。由此可见， DMB 具有降低脂质过 氧化产物 MDA 水平， 促进 GSH 再生， 增强肝脏自由基的清除， 防止脂质过氧化的能力。如图 3 所示。 0067 表 2 DMB 预防性治疗对异烟肼引起的肝氧化损伤的保护作用 0068 0069 (n 8， meanvariance.*p 0.05， *p 0.01， *p 0001vs Model) 0070 实施例 4.DMB 预防性治疗对异烟肼引起的肝损伤病理学改变的保护作用 0071 方法 ： 雄性 ICR 小鼠， 体重 22-。
37、24 克， 随机分为 4 组， 每组 8 只。组分别为正常对照 组、 模型组、 DMB 低剂量 (15mg/kg， IP) 给药组和 DMB 高剂量 (30mg/kg， IP) 给药组。所有小 鼠每日灌胃给予相当于人日常用量的异烟肼(100mg/kg)。 同时给药组小鼠腹腔注射分别给 说 明 书 CN 104147006 A 9 8/8 页 10 予高、 低剂量 DMB， 每天一次， 其余各组给予相同体积赋形剂， 共 21 天。末次给药后禁食过 夜， 处死动物， 不同小鼠取肝脏大叶同一部位组织以 10甲醛固定， HE 染色进行病理学检 查。 0072 结果 ： 肝脏病理学研究结果表明， 正常对。
38、照组肝脏形态未见异常， 肝细胞排列规 则 ； 模型组肝脏有明显嗜酸性病变和脂肪浸润现象。 而给药组上述病变明显减轻， 恢复至接 近正常对照组水平， 其中 DMB 低剂量给药组的嗜酸性病变显著减少， 但仍有少量脂肪浸润 以及细胞水肿现象， DMB 高剂量给药组几乎未见异常病变现象。实验结果表明盐酸去亚甲 基小檗碱 (DMB) 能有效预防治疗异烟肼引起的肝损伤小鼠肝脏病变。如图 4 所示。 0073 实施例 5.DMB 预防性治疗对异烟肼引起的肝损伤小鼠肝药酶 CYP2E1 表达活性的 抑制作 用 0074 方法 ： 雄性 ICR 小鼠， 体重 22-24 克， 随机分为 3 组， 每组 8 只。。
39、3 组分别为正常对 照组、 模型组和 DMB 高剂量 (30mg/kg， IP) 给药组。所有小鼠每日灌胃给予相当于人日常用 量的异烟肼 (100mg/kg)。同时给药组小鼠腹腔注射分别给予高、 低剂量 DMB， 每天一次， 其 余各组给予相同体积赋形剂， 共 21 天。末次给药后禁食过夜， 处死动物， 不同小鼠取同一部 位肝组织 0.1g， 用于蛋白质免疫印迹分析， 检测细胞色素 P450(CYP2E1) 的表达量。蛋白质 免疫印迹实验中内参 GAPDH 购于 Bioworld 公司 ( 中国上海 )， CYP2E1 抗体购于 Anbo 公司 ( 美国旧金山 )。 0075 结果 ： 小鼠经。
40、连续 21 天异烟肼灌胃后， 与对照组相比， 模型组小鼠肝脏 CYP2E1 表 达量显著升高， CYP2E1 能增加肝脏 ROS 的生成， 引起肝细胞的氧化损伤。给药 DMB 后小鼠 肝脏CYP2E1表达量明显降低， 实验结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)通过有效降低肝脏 CYP2E1 的蛋白表达， 减轻由肝药酶表达增加导致的氧化应激损伤， 能有效缓解环节异烟肼 引起的肝损伤。如图 5 所示。 说 明 书 CN 104147006 A 10 1/4 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 104147006 A 11 2/4 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 104147006 A 12 3/4 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 104147006 A 13 4/4 页 14 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104147006 A 14 。