技术领域
本发明涉及红花提取物在治疗神经退行性疾病方面的一种新药 理用途，尤其涉及红花提取物在预防或治疗帕金森病中的用途，属于 红花提取物的医药用途领域。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)又名震颤麻痹，是一种 常见的中老年人神经退行性疾病。PD的主要病理改变为黑质致密部 (Substantia Nigral compacta，SNc)多巴胺(Dopamine，DA)能 神经元的变性，当神经元变性到达一定阈值，开始出现症状，主要表 现为静止性震颤、运动迟缓和肌肉强直，此外还有步态、姿势异常， 认知障碍等症状。目前帕金森病发病机理尚不十分清楚，年龄老化、 环境和遗传因素等均参与其中。
临床上对PD的治疗可以分为药物治疗和手术治疗，以药物治疗 为主。手术治疗的应用范围较窄，以苍白球毁损术为代表的毁损手术， 由于其远期疗效不佳并有可能带来不可预测的并发症，如吞咽、语言 和平衡障碍，目前已基本淘汰。神经干细胞移植目前还处于实验阶段， 脑深部电极刺激(deep brain stimulation，DBS)是治疗PD的最新 进展，但手术后仍然要坚持药物治疗；而药物治疗基本上以缓解症状 为主，尤以左旋多巴为最常用的治疗药物，但L-DOPA长期使用有许 多严重副作用，如“开-关”现象、运动不能、精神障碍等，且仅为 对症治疗，随着神经元变性的发展其效能逐渐减小。尽管新的腺苷 A2A受体拮抗剂在PD治疗中的应用受到日益关注，但仍缺乏根治的 药物。由于PD的病因复杂，社会危害大，随着高龄化社会的到来，研 发高效低毒的新的治疗PD的新药显得必须而紧迫。中国是资源丰富 的中药大国，近年来报道许多中药及其有效成分均有神经保护作用， 研究这些中药及其有效成分，开发出能改善PD症状的新药将会有广 阔的应用前景。
红花为菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.的干燥管状花， 性温，昧辛，具有活血通经、散瘀止痛、降低胆固醇、降血压等功效， 临床上主要以水煎液入药。用于月经不调、痛经、经闭、跌打损伤， 对冠心病、血管栓塞性疾病、脉管炎、传染性肝炎等疾病亦有一定的 疗效。值得注意的是，尽管对于红花的研究众多，但一般将其用于改 善心脑血管循环障碍疾病，未见有将其用于神经退行性疾病的用途。
发明内容
本发明涉及红花提取物的新用途。具体来说，就是红花提取物在 神经退行性疾病方面的新用途，尤其是在预防或治疗帕金森病方面的 应用。
本发明通过大量的实验发现，红花提取物具有显著的抗氧化应激 作用，能够有效改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP) 诱导的慢性帕金森病C57小鼠的行为学表现，防止氧化应激诱导的原 代神经细胞的凋亡，保护多巴胺能神经元形态的完整性。上述实验结 果表明，红花提取物具有确切的预防或治疗帕金森病的药理活性。
红花在临床用药上一直作为改善心脑血管循环障碍用药，可以活 血祛瘀，改善心脑血管循环，但作为活性部位，迄今为止，未见有关 于其神经退行性疾病的药理活性研究。作为一种临床常见用药，开发 其新用途具有非常重要的研究价值和实践意义。红花提取物的成分主 要有红花醌苷、新红花苷、红花苷、红花黄色素和黄色素等。尽管有 研究报道，红花提取物中的有些成分具有一定的抗氧化功效，但是抗 氧化功效与抗帕金森病二者之间没有必然的联系，本发明在进行了大 量实验的基础上才最终发现，红花提取物具有确切的预防或治疗帕金 森病的功效。
本发明所述红花提取物可以是红花的水提物，也可是红花的醇提 物。提取物可以为浸膏，也可以为喷雾干燥或冷冻干燥的产物。
本发明人通过实验发现，当本发明所述的红花提取物的有效成分 主要由6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7- 氧葡萄糖醛酸苷或6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷中的任 意一种或多种按照任意的重量配比比例所组成时，该红花提取物相比 于其它的红花提取物，在治疗帕金森病的疗效上有显著的提高。
优选的，上述3种有效成分的重量百分含量分别为：6-羟基山奈 酚-3-氧芸香糖苷0.04-0.16％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄 糖醛酸苷0.01-0.04％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷 0.006-0.024％；更优选的，3种有效成分的百分含量为：6-羟基山奈 酚-3-氧芸香糖苷0.06-0.12％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄 糖醛酸苷0.015-0.03％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷 0.009-0.018％；特别优选的，3种有效成分的百分含量为：6-羟基山 奈酚-3-氧芸香糖苷0.08％、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖 醛酸苷0.02％，6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷0.012％。
本发明所述的红花提取物的有效成分由6-羟基山奈酚-3-氧芸香 糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷或6-羟基山奈 酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷中的任意一种或多种按照任意的重量 配比比例所组成时，其制备方法包括：(1)将红花用水浸泡提取，将 水提取物过滤；(2)滤液上大孔树脂，用水-乙醇梯度洗脱；(3)收集 50％乙醇洗脱液，浓缩，冻干，纯化，即得。其中，步骤(1)中优选 将红花药材加水浸泡，浸泡后的红花再用30-80℃温水浸泡提取，将 提取液减压浓缩，再减压抽滤。更优选的，将浸泡后的红花再用60℃ 温水浸泡提取2次，每次提取2小时。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种预防或治疗帕金 森病的药物组合物，该药物组合物由有效量的红花提取物与药学上可 接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受用量的红花提取物 与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将 其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给 药，也适合于其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂、 颗粒剂、丸剂或口服液等液体制剂形式，或软膏剂、巴布剂等外用剂 型。为了增加药物的溶出和吸收，红花提取物还可以制备成固体分散 体。此外，该组合物也可以制备成缓控制剂、纳米制剂以及智能型给 药系统。根据不同的给药途径和给药方法，本发明药物组合物可以含 有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的红花提取物。
本发明所述红花提取物口服固体制剂，包括红花提取物活性成份 和作为分散剂的载体，其特征是所述的载体材料选自交联聚乙烯吡咯 烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶、聚乙二醇、糊精及其衍生物、乳 糖、预胶化淀粉、微晶纤维素等之一种或其中几种的混合物。载体与 药物的比例范围一般为0.5-20∶1(w/w)，较佳为1-5∶1(w/w)，最 佳为2∶1(w/w)。
所添加的稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分。 常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、 甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。
所采用的外加崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为 2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与 总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一 种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7 ％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳。最佳为交 联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)。
所采用的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙， 聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂 酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一 般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。
所采用的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀 粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％， 与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以 聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％ 乙醇水溶液。
所用助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种 混合物。
本发明所述红花提取物固体分散体的制备工艺可以为熔融法、溶 剂法、溶剂-熔融法或研磨法。所使用的水溶性载体一般为PEG类、 聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、糖类。水不溶性载体一般为乙基纤维素、 壳聚糖、丙烯酸树脂、脂质类等。肠溶性材料一般为邻苯二甲酸羟丙 基甲基纤维素和丙烯酸树脂类。
所采用的表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加 药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％， 与总重量比)。
本发明进一步提供红花提取物液体制剂的制备方法，该方法包 括：采用纯水、生理盐水或缓冲水溶液作为溶剂，以化学计量的红花 提取物为原料，配制本发明所述红花提取物水溶液，所得红花提取物 水溶液还可以任选含有其它药用辅料如抗氧化剂等，该溶液经本领域 熟知的无菌和/或无热源处理后灌装于注射液容器如安瓿瓶。举例来 说，其无菌和/或无热源处理可以是微孔超滤、热压灭菌等。
本发明所提供的满足临床应用需要的红花提取物溶液中可以用 于进一步制备冻干制品，例如冻干粉针。本发明的冻干制品的浓度一 般为5mg/ml-100mg/ml。冻干前，红花提取物水溶液可以任选添加药 学上可接受的填充剂、防冻剂、渗透压调节剂、pH调节剂等。
一般来讲，本发明所述红花提取物用于治疗神经退行性疾病的推 荐剂量为1-200mg/kg，优选为5-100mg/kg，最优选为10-60mg/kg。 上述剂量可以为单剂量或多剂量给药。
附图说明
图1红花提取物的制备工艺流程图。
图2红花提取物的质谱鉴定图；色谱条件：色谱柱：Angilent SB C-18(5μ，4.6×250mm)；流动相：A：乙腈；B：0.1％三氟乙 酸0-20min，2-5％A；20-30min，5-10％A；30-60min，10-20％A； 60-65min，20％A.流速：1ml/min。
图3红花提取中的主要化合物紫外图谱。
图4小鼠在滚筒仪上的潜伏期试验结果(x±s，n＝13)；**P ＜0.01vs MPTP组；#P＜0.05红花50mg/kg vs红花100mg/kg。
图5红花提取物对MPTP模型小鼠纹状体DA，DOPAC，HVA含 量的影响与对照组比较，a：P＜0.01；b：P＜0.05。 与MPTP组比较，c：P＜0.01；d：P＜0.05。
图6黑质多巴胺能神经元免疫组化染色试验结果；A.正常组B. 模型组(MPTP 30mg/kg)C.司来吉兰(Selegiline)(5mg/kg)+ MPTP D.红花提取物(50mg/kg)+MPTP E.红花提取物(100mg/kg) +MPTP F.红花提取物(100mg/kg)。
图7化合物Hhw10和hhw17的抗氧化活性实验结果。
图86-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷的QCM实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点 将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发 明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本 发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改 或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1红花提取物的制备
一材料与方法
1材料
1.1.1试剂与药品
常规提取分离用乙醇、甲醇等均为分析纯试剂，制备用甲醇为色 谱纯试剂，北京化工厂生产，乙腈为Fisher试剂(Fisher Scientific， Fairlawn，NJ)。去离子水由纯净水经Millipore Simplicity纯水系 统制备。
大孔树脂(AB-8)购自天津南开大学；层析柱用凝胶Sephadex LH-20(25-100μm)为Amersham Biosciences公司产品，北京分公司 分装；ODS反相柱填料(50μm)为Merk公司生产。
1.1.2药材
红花为菊科植物红花Carthamus rinctorius L.的干燥花瓣， 购自中国药材公司，产地为新疆，由北京大学药学院果德安教授鉴定。
2实验方法
2.1提取与分离
取红花药材560g，加14倍重量水浸泡过夜，60℃温浸两次， 每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩至一定体积约4升左右，将 水提物溶液减压抽滤，澄清溶液上AB-8大孔树脂(购自天津南开大 学)，以水-乙醇梯度洗脱。水洗脱部分为糖及大分子蛋白质等物质， 弃去。HPLC检测收集10％(6g)、30％(22g)、50％(24g)、70％(2.4g)、 95％(0.8g)乙醇洗脱部分，分别减压浓缩至一定体积后，至于真空冷 冻干燥机中冻干，得干燥粉末，置干燥器中，避光阴凉处贮藏备用。 取50％乙醇部分上Sephadex LH-20柱，水-甲醇梯度洗脱，HPLC检 测收集合并各流份，半制备液相进一步纯化，得到hhw-11(6-羟基 山奈酚-3-氧芸香糖苷)(41mg)、hhw-18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄 糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)(9.8mg)、hhw-20(6-羟基山奈酚-3-氧芸香 糖-6-氧葡萄糖苷)(6mg)。以上成分为红花的富含成分。具体分离 过程见图1。上述3种成分的质谱鉴定图和紫外图谱分别见图2和图 3。
C27H30O16
Exact Mass：610.15
Mol.Wt.：610.52
m/e：610.15(100.0％)，611.16(30.2％)，612.16(7.7％)，613.16(1.4％)
C，53.12；H，4.95；O，41.93
6-Hydroxykaempferol 3-O-β-D-rutinoside
(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷)
C27H28O17
Exact Mass：624.13
Mol.Wt.：624.5
m/e：624.13(100.0％)，625.14(30.2％)，626.14(7.9％)，627.14(1.4％)
C，51.93，H，4.52；O，43.55
6-Hydroxykaempferol 6-O-β-D-glucoside-7-O-β-D-glucuronide
(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)
C33H40O21
Exact Mass：772.21
Mol.Wt.：772.66
m/e：772.21(100.0％)，773.21(37.0％)，774.21(10.8％)，775.21(1.6％)
C，51.30；H，5.22；O，43.48
6-Hydroxykaempferol 3-O-β-rutinoside-6-O-β-D-glucoside
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷
实施例2红花提取物颗粒剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基 山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸 苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)3克，与5克微晶纤维 素、3克乳糖、1克交联羧甲基纤维素钠混合，以3％聚维酮乙醇液(50 ％浓度)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒， 即得红花提取物颗粒剂。
实施例3红花提取物片剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基 山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸 苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)10克，与5克乳糖、3 克预胶化淀粉、1克羧甲基淀粉钠混合，过80目筛2遍，混合均匀，以 3％PVP乙醇溶液(浓度50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60 ℃干燥，过30目筛整粒，加入0.1克微粉硅胶混合均匀，压片，可制 备红花提取物片100片。
实施例4红花提取物胶囊剂的制备
取实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基 山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸 苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)10克，与4克微晶纤 维素、4g淀粉、1克交联聚维酮混合均匀，以1％聚维酮乙醇液(浓度 50％)为粘合剂制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，过30目筛整粒， 灌装胶囊100粒。
实施例5红花提取物固体分散体的制备
将1重量份实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含 有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡 萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)与1重量份 PVP-K30，溶于适量水中，将该溶液喷雾干燥。喷雾干燥条件为：进 风温度为45℃，进料速度为25ml/min，雾化器转速为45Hz，旋风分离 器压差为50mm水柱。所得干燥粉末即为红花提取物固体分散体。
实施例6红花提取物固体分散体的制备
将1重量份实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含 有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡 萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)与2重量份 PVP-XL混合均匀，置于行星式研磨仪中，以300r/m的转速研磨1.5小 时，即得红花提取物固体分散体。
实施例7微粉化的红花提取物的制备
将实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱部分，含有6-羟基 山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸 苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)置于气流粉碎机中粉 碎，过200目筛，即得微粉化的红花提取物。
实施例8红花提取物注射剂的制备
1.处方
原料 用量
实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱 100.0g
部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-
羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)
羟丙基-β-环糊精 500.0g
pH 7.5Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液 至 5.0L
制成 1000支
2.制法Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液适量，加入红花提取物500g， 羟丙基β-环糊精500g，搅拌至溶，加Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至 5.0L，0.45μm微孔滤膜粗滤，续以0.22μm的微孔滤膜过滤后，即 得红花提取物注射剂。
实施例9红花提取物糖浆剂的制备
1.处方
原料 用量
实施例1所制备的红花提取物(50％乙醇洗脱 100.0g
部分，含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-
羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、
6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)
蔗糖 500.0g
防腐剂 适量
矫味剂 适量
蒸馏水 至 10.0L
制成 1000瓶
2.制法将蔗糖加入到不锈钢容器中，加适量蒸馏水后蒸汽加 热，待蔗糖溶解后过40目筛除去异物。另取蒸馏水适量，加入红花 提取物，经搅拌至溶，0.45uM滤膜过滤，滤液与所制备的糖浆充分 混合，其他附加剂溶解后在搅拌条件下缓缓加入上述混合液，加蒸馏 水至全量，搅拌均匀。测定主药含量，合格后进行灌装，即得红花提 取物糖浆剂。
实验例1行为学实验
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动 物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前 适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇洗 脱部分，主要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6- 氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄 糖苷)。SD-2型小鼠滚筒仪，北京大学医学部实验仪器厂生产。
1.2实验方法
1.2.1实验分组及处理方法
小鼠随机分为分5组，每组13只，分别为空白对照组、模型对 照组、金刚烷胺(30mg/kg)、以及红花提取组(50mg/kg，100mg/kg)。 连续灌胃给药14d，于第11d开始灌胃给药前1h腹腔注射MPTP 30 mg/kg(对照组给予等体积的生理盐水)，连续4d，最后1次给药后1d， 进行行为学指标测试，4d后断头放血处死，分别取小鼠脑纹状体和 黑质，于-80℃保存，用于分别测定多巴胺含量以及免疫组化实验(分 组不同，阳性对照药物是司来吉兰(Selegiline)(5mg/kg))。
1.2.2实验指标测定方法
一般行为学观察 观察小鼠在腹腔给予MPTP造模后的一般行 为表现，有无异常反应，比较分析各组之间的差异。
滚筒实验 使用SD-2型小鼠滚筒仪测试小鼠的滚筒行为表现。 测试前连续训练3d，每天2次，转速为12r/min，训练时间120s。 将小鼠置于滚筒仪的滚筒上，设置转速35r/min，测试小鼠从滚筒开 始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动潜伏期，测试时间为120s。 每只小鼠测3次取平均值。
二实验结果与讨论
2.1一般行为学
腹腔给予MPTP(30mg/kg)后5min开始，与对照组相比MPTP模 型组小鼠的一般行为表现异常，大多数出现下列变化：举尾、竖毛、唾 液分泌增多、呼吸加快、肌张力减退、对外环境刺激敏感及牙颤等， 其持续时间一般为2～3h。而红花(50、100mg/kg)和金刚烷胺(40 mg/kg)组，其症状表现较轻，持续时间较短。
2.2滚筒实验
实验结果表明MPTP模型组与对照组相比，运动潜伏期明显缩短 (P＜0.01)，用50mg/kg、100mg/kg红花提取物预处理后，和MPTP 模型组相比能明显的增加滚筒运动潜伏期(均为P＜0.01，图4)。
三、实验结论
3.1红花提取物可以显著地延长MPTP造模小鼠滚筒运动潜伏 期，表明红花提取物具有一定的神经保护作用。
3.2红花低剂量组与红花高剂量组MPTP造模小鼠滚筒运动潜伏 期存在显著性差异(P＜0.05)，说明红花提取物的神经保护作用可 能具有剂量依赖性。
实验例2HPLC-ECD法测定纹状体中多巴胺及其代谢产物的含量
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动 物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前 适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇 洗脱部分，主要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6- 氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄 糖苷)。
2实验方法
2.1实验分组与给药
室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前适应环 境1周。小鼠随机分为分5组，每组13只，分别为空白对照组、模型对 照组、金刚烷胺组(40mg·kg-1)、以及红花提取物组(50mg·kg-1， 100mg·kg-1)。给药：连续灌胃给药14d，空白对照组与模型对照组 给予等体积的去离子蒸馏水。造模(赵欣，蒲小平，耿兴超.松果菊 苷对帕金森病模型小鼠黑质纹状体蛋白表达影响的双向电泳分析[J]. 中国药理学通报，2008，24(1)：28～32.)：于第11d开始灌胃给药 前1h腹腔注射MPTP 30mg·kg-1(对照组给予等体积的生理盐水)， 连续4d，最后1次给药后1d，进行行为学指标测试。行为学指标测 试完后1d，小鼠断头放血处死，取小鼠脑纹状体，于-80℃保存，用 于测定多巴胺含量。
采用高效液相-电化学法(HPLC-ECD)检测纹状体内多巴胺及其 代谢产物二羟苯乙酸(dihydroxy-phenyl acetic acid，DOPAC)和 高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量(赵磊，蒲小平.类叶 升麻苷对MPTP所致帕金森病小鼠模型的神经保护作用[J].中国药理 学通报，2007，23(1)：42～46.)。样品预处理：取纹状体，按比例 为250μL∶100mg组织加入样品预处理A液(0.4mol·L-1HClO4)。 冰浴超声匀浆处理，4℃静置1h，避光保存，15000g离心20min， 定量吸取上清后加入一半上清体积的样品预处理B液(20mmol·L-1柠檬酸钾，300mmol·L-1磷酸氢二钾，2mmol·L-1EDTA-2Na)，充分 混匀后4℃静置1h，15000g离心20min，取上清，-80℃保存直 至测定。样品测定条件：施加电势：0～500mV，以100mV递增。流 动相：柠檬酸缓冲液100mmol·L-1，EDTA-2Na 100mmol·L-1，1-烷 基硫酸钠20mmol·L-1，20％甲醇。C18柱流速：1ml·min-1，温度 24℃±1℃。进样量：50μL。多巴胺含量用μg·g-1湿组织重表 示。测定数据后，绘制标准曲线及进行统计学分析。
3实验结果与讨论
图5所示是由标准曲线计算得到的各组样本DA，DOPAC以及HVA的 含量柱状图。与正常组(Control)比较，模型组(MPTP)纹状体内 DA(P＜0.01)，DOPAC(P＜0.01)，HVA(P＜0.05)含量降低并且 有显著性差异。与模型组比较，红花提取物(CTE)50mg·kg-1组 DA(P＜0.05)，DOPAC(P＜0.05)含量有显著性增高。与模型组比 较，红花提取物100mg·kg-1组DA(P＜0.01)，DOPAC(P＜0.01)， HVA(P＜0.01)的含量有显著性增高。与CTE(50mg·kg-1)组比较， CTE(100mg·kg-1)组DA含量显著增加(P＜0.05)(图中未标示)。
实验例3脑区DA神经元酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色
一材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物
C57BL/6小鼠，雄性，体重16-18g，购自北京大学医学部实验动 物中心，室温恒温饲养，饮水饮食不限，12小时交替照明。实验前 适应环境1周。许可证号：SCXK(京)2006-0025。
1.1.2试剂和仪器
MPTP购自Sigma公司；司来吉兰(Selegiline)购自南京思科药 业有限公司，红花提取物由实施例1所制备(50％乙醇洗脱部分，主 要含有6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7- 氧葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。
2实验方法
2.1.麻醉
每组小鼠各取两只，以戊巴比妥钠(50mg/kg，ip)腹腔注射麻 醉，后肢回缩反射消失及角膜反射消失为麻醉指标。
2.2灌注固定
将小鼠仰卧位固定于鼠板上，快速剪开腹腔和胸腔前壁，清晰暴 露出心脏和升主动脉，用连有输液管的注射针头由心尖处插入左心 室，并通过心腔插入升主动脉，用止血钳固定，依次以生理盐水和4％ 多聚甲醛灌注固定，直到动物全身呈僵硬状态。
2.3取材和后固定
灌注结束后取出完整的脑组织，先置于4％多聚甲醛中后固定6h， 然后经10％、20％、30％的梯度蔗糖浸泡过夜。
2.4冰冻切片
待组织块下沉后对黑质部位进行切片，修整脑组织块，于前卤后 4.2-5.6mm范围内做连续间隔冰冻冠状切片，制成20μm厚的冰冻切 片。
2.5TH染色
1)0.01M的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)冲洗5-10分钟，加入3％ H2O210分钟。
2)用去离子水冲洗后，再用0.01M磷酸盐缓冲液浸泡切片5分 钟。
3)加入封闭剂(10％兔血清，用0.01M PBS稀释)室温孵育30 分钟，倾去，勿洗。
4)加入酪氨酸羟化酶的多克隆抗体(Chemicon International， Temecula，CA，USA)(1∶1000稀释，含有0.3％的TritonX-100)， 4℃过夜。
5)室温复苏5分钟，0.01M的PBS漂洗，5分钟×3次。
6)加入一滴两步法试剂盒的二抗，37℃孵育30分钟。
7)0.01M PBS冲洗，5分钟×3次。
8)DAB染色，按照试剂盒所示，取A/B两种试剂各加入一滴至1ml 去离子水中，即可获得1ml DAB工作液，进行染色。取一切片置于显 微镜下观察，有阳性反应即可终止显色，置于去离子水内。
9)梯度乙醇脱水(80％乙醇5min×1次；85％乙醇5min×1次； 90％乙醇5min×1次；95％乙醇5min×2次；无水乙醇5min×2次)， 二甲苯透明(二甲苯5min×2)，中性树胶封固(加中性树胶1滴于 载玻片上，轻轻的从一边开始盖上盖玻片，注意防止有气泡产生，晾 干即可)。于显微镜下观察并照相。
2.4统计学处理
所有数据均以均值±标准差来表示。除滚筒实验采用 Mann-Whitney U检验外，其余实验的各组间比较采用t-检验和双因素 ANOVA检验，P＜0.05为统计学上有显著性差异。
二实验结果与讨论
小鼠黑质部位的酪氨酸羟化酶的免疫组化染色结果如图6所示。 TH是多巴胺合成代谢中的限速酶。通过TH抗体特异性染色，可以明显 的观察到多巴胺能神经元。在多巴胺能神经元的胞浆内可明显观察到 褐色的阳性反应(图6A)。从图6中可以看出，给予MPTP后可发现黑 质部位的多巴胺能神经元数量以及免疫反应的阳性信号强度与正常 对照组相比均明显降低(图6B)；而用红花提取物预处理后，和模 型组相比则能显著增加黑质部位的多巴胺能神经元的数量，提高免疫 化学反应的阳性信号强度(图6D，E)。单纯给予红花提取物，神经 元的数目和形态都类似于正常组(图6F)。结果表明，红花提取物 对神经细胞具有神经保护作用，可以对抗MPTP神经毒素诱导的细胞死 亡，且其本身没有毒性(参见图6F)。
三实验结论
红花提取物具有神经保护作用，能够保持多巴胺能神经元形态的 完整性，对抗MPTP神经毒素对多巴胺能神经元的损伤。
实验例4红花组分体外抗ADP诱导的血小板聚集活性测定
1.1动物与分组：清洁级SD大鼠，体重250±30g；由北京大学医 学部实验动物中心提供。测定分成6组，即空白对照组、阿司匹林组、 hhw5组、hhw10组、hhw17组，hhw18组，每组测定3次(n＝3)。
1.2仪器与药品：TYXN-96血小板聚集仪(上海通用机电技术研究 所)：旋转蒸发器RE-52(上海亚荣生化仪器厂)；DLSB低温冷却循 环泵(郑州长城科工贸易有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(上 海亚荣生化仪器厂)；数显恒温水浴锅HH-2(国华电器有限公司)；
戊巴比妥钠购自上海化学试剂厂；肝素钠购自天津生化制药厂。
2.实验方法
2.1PRP与PPP制备：大鼠称重，0.3％戊巴比妥钠按1ml/100g腹腔 内注射，麻醉后仰卧位，四肢固定于手术台上，腹部沿正中线皮肤切 开，钝性分离皮下组织、浅深肌肉，分别暴露并游离出腹主动脉取血 5～8ml，放入有3.8％枸橼酸钠抗凝剂的硅化离心管中(血量与抗凝 剂比例为9∶1)；使血液与抗凝剂充分混匀，加盖备用。将上述血标 本以800r/min离心10min，小心取出上清液，得富血小板血浆即PRP； 继续以3000r/min离心15min，取上清液，得贫血小板血浆即PPP， 留作空白对照用。
2.2血小板聚集率测定：取250μl PRP于比浊管内，37℃环境中 恒温孵育5min。以PPP调节PRP至血小板数为(40～50)×1011/L。然 后将搅拌磁子放入孵育好的PRP内，搅拌，迅速注入聚集诱导剂ADP20 μl(5μmo l/L)，记录5min聚集曲线，取最大聚集率(Amax)，并 计算聚集抑制率，聚集率＝[(加药前Amax-加药后Amax)/加药前Amax ×100％]。同时测定空白阴性对照，加入20μl阿司匹林作为阳性对 照。
判断标准：单体化合物在100uM终浓度，抑制率＜30％为无效， 30-55％为弱效，55-70％为显效，＞70％为强效。
3实验结果
Hhw18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)为强效 抗凝物质，其特点为6-羟基芹菜素为母核。Hhw10(6-羟基山奈酚-3- 氧葡萄糖苷)为弱效抗凝化合物，hhw5(6-羟基山奈酚-3，6，7-三 氧葡萄糖苷)为显效化合物，而hhw17(6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡 萄糖苷)则为无效抗凝化合物。这些化合物都为6-羟基山奈酚为母 核，但由于取代基的不同，所以活性表现出较大的差异。
Hhw5和hhw18进入下一轮的抗氧化应激筛选。而hhw10和hhw17则 在此轮活性筛选中被淘汰。
表1抗ADP诱导的血小板凝集实验
化合物代号 名称 抑制率(％) Hhw5 6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷 59.19±3.9* Hhw10 6-羟基山奈酚-3-氧葡萄糖苷 48.17±1.7 Hhw17 6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡萄糖苷 27.80±2.9 Hhw18 6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷 71.52±6.1** Aspirin 阿司匹林 42.17±4.2
实验例5红花化学成分对过氧化氢诱导的PC12细胞毒性模型的抗氧 化活性测定
一仪器与药品
1.1试剂药品
人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株(PC12)购自中科院上海细胞所。 胎牛血清购自杭州四季青公司。马血清购自Hyclone公司。培养基购 自迈晨公司。过氧化氢，MTT购自Sigma公司；红花提取物中系列化 合物由实施例1制备方法分离得到：hhw-11(6-羟基山奈酚-3-氧芸 香糖苷)、hhw-18(6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷)、 hhw-20(6-羟基山奈酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷)。hhw5(6-羟基 山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷)。Hhw10(6-羟基山奈酚-3-氧葡萄糖 苷)和hhw17(6-羟基山奈酚-6，7-二氧葡萄糖苷)。
1.2仪器全自动酶标仪(biorad公司)
二实验方法
2.1PC12细胞培养
PC12细胞所使用1640培养基加入体积分数10％的小牛血清、体积 分数5％的马血清以及抗生素1×105U·L-1、，5％CO2，37℃培养细胞。 待细胞增长至80％融合时，用0.5g·L-1胰蛋白酶消化传代，1∶3分瓶 传代，每4d传代一次。每隔2d换液一次。
2.2实验分组与药物处理
PC12细胞分为以下各组(1)空白对照组：除了培养基外，不加 任何药物；(2)模型组：培养液中加入200μM的H2O2，处理30min；(3) 给药组(5％DMSO配制)：用化合物预处理后加入H2O2，处理6h；各组细 胞培养所需观察时间后，进行细胞存活率测定。
2.3细胞存活率测定
以5×104的密度浓度接种于96孔板中，每组3个复孔，进行药物 处理后，继续孵育6h，除对照组外各组加入200μM的H2O2，处理30min。 之后每孔加入终浓度为0.5g/L的MTT，培养4h后吸去培养液，加 入10％SDS终止反应，每孔加入DMSO 200μl，充分吹打震荡，待蓝 色颗粒完全溶解后用半自动酶标仪测定570nm处的吸光度值(A570 nm)，用于定量反映细胞的存活率。
三实验结果
实验结果如表2所示，从表2中数据可以看出，Hhw5化合物无抗氧 化活性，在此轮中被淘汰。另外的三种化合物(Hhw11、Hhw18和 Hhw20)有明显的抗氧化作用，与模型组相比具有显著性差异，能够 对抗过氧化氢诱导引起的PC12细胞损伤。PC12细胞常用于抗帕金森病 化合物药效的体外筛选，这提示从红花中所分离的这3种化合物具有 抗帕金森病的药理作用。
表2过氧化氢诱导的PC12细胞毒性模型的抗氧化活性实验结果
*P＜0.05；**P＜0.01vs模型组
Hhw10和hhw17的抗氧化活性实验结果见图7，Hhw10和hhw17的不 同浓度的细胞存活率与过氧化氢诱导损伤的模型组相比没有显著性 差异，因此Hhw10和hhw17不具有抗氧化活性。
实验例6QCM试验
一、试验材料
1、供试化合物：hhw5(6-羟基山奈酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷)。
2、其它化合物：氯仿；H2O2/H2SO4(mol/mol＝1/3)，DMSO。
二、试验方法
1、用H2O2/H2SO4(mol/mol＝1/3)作为洗涤剂洗涤石英芯片，洗 涤后用蒸馏水冲洗，吹打干净。
2、固定化合物：将4ul的1uM供试化合物样本溶于适量氯仿中， 直到氯仿完全挥发。
3、取8mlPBS置于样品池中，固定石英芯片，使之浸入样品池 中。
4、启动计算机，然后调整相关参数。
5、待基线平稳后，取1mg/ml的蛋白溶液8ul，加入样品池， 标记，记录1h的曲线。
6、根据得到的曲线，判断化合物是否与DJ-1蛋白有相互作用。
三、试验结果
通过QCM实验进一步证明了hhw5号化合物与帕金森病DJ-1靶点 也没有结合，所以最终证明该化合物不具有抗帕金森作用的活性(图 8)。
以上对本发明各种实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术 人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明精神， 均应属于本发明所附权利要求所限定的范围。