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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610565800.7 (22)申请日 2016.07.18 (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 章晓波 陈玉磊 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 林超 (51)Int.Cl. A61K 31/7105(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 35/04(2006.01) C12N 15/113(2010.01。
2、) (54)发明名称 对虾miR-35在对虾抗病毒和抑制人肿瘤转 移中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种对虾miR-35在对虾抗病 毒和抑制人肿瘤转移中的应用。 对虾miR-35为对 虾 特 有 的 m i R N A ， 其 碱 基 序 列 为 5 - AACUGUGAGAAGUUCCGGU-3 ， 虾病害防治针对的是 对虾白斑综合症病毒(WSSV)， 抑制人肿瘤转移针 对的肿瘤细胞是乳腺癌细胞MDA-MB-231。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 106176795 A 2016.12.07 CN 106176795 A 1.对虾miR-35在对虾病害防治和抑制。
3、人肿瘤转移中的应用。 2.根据权利要求1所述的对虾miR-35为对虾特有的miRNA， 其碱基序列为SEQ ID NO.1： 5 -AACUGUGAGAAGUUCCGGU-3 。 3.根据权利要求1所述的对虾病害防治的应用针对的是对虾白斑综合症病毒(WSSV)。 4.根据权利要求1所述的抑制人肿瘤转移的应用针对的肿瘤细胞是乳腺癌细胞MDA- MB-231。 5.根据权利要求1所述的抑制人肿瘤转移中的应用， 其特征在于对虾miR-35抑制作用 的靶基因为人单核细胞系THP-1细胞诱导分化后的M2型巨噬细胞中的CHI3L1基因。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106176795 A 2。
4、 对虾miR-35在对虾抗病毒和抑制人肿瘤转移中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一条miRNA的应用， 尤其是涉及了一种对虾miR-35在对虾抗病毒和抑 制人肿瘤转移中的应用， 这更有利于了解miRNA跨物种调控的机制。 背景技术 0002 MicroRNA(miRNA)是小的非编码RNA， 约由18-25个核苷酸组成， 很多miRNA在不同 物种中都是高度保守的。 MiRNA是调控基因表达的重要因子， 它们参与基因转录后水平的调 控。 它们通过种子序列与靶基因3 端非编码区域(3 UTR)直接结合， 从而抑制靶基因的翻译 或介导靶基因的降解。 0003 对虾作为重要的水产品之一， 具有。
5、很大的商业价值。 然而， 由于对虾白斑综合症病 毒(WSSV)等病毒感染而引起的对虾疾病成为对虾养殖的棘手问题。 在病毒感染对虾后， 对 虾体内miRNA的表达谱发生明显变化， 说明miRNA可能参与对虾的抗病毒免疫反应。 因此， 可 以将宿主和病毒miRNA作为靶点， 通过影响对虾体内病毒的感染和复制来减轻病毒感染引 起的对虾疾病， 同时提高对虾的免疫防御能力。 0004 以往研究表明， 水稻的miR-168a能够抑制哺乳动物低密度脂蛋白受体衔接蛋白基 因(LDLRAP1)的表达水平， 这个基因表达的下降会促使肝脏低密度胆固醇水平的上升； 金银 花编码的miR-2911， 能够广泛作用于流感。
6、病毒(包括H1N1、 H5N1和H7N9)； 外源的miRNA可以 通过胎盘传递给胎儿， 影响胎儿的基因表达。 这说明植物miRNA能够进入动物体内并 “跨界” 影响动物的生理活性， 发挥生物学功能。 前期研究结果表明， 巨噬细胞分泌的CHI3L1蛋白可 以促进肿瘤细胞的迁移。 因此， 可以将巨噬细胞中的CHI3L1蛋白作为肿瘤治疗的靶点。 发明内容 0005 为了解决背景技术中存在的问题， 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述 不足， 而筛选获得到一条miRNA(miRNA-35)， 这条miRNA既能抑制WSSV病毒对对虾的感染， 又 能通过作用于CHI3L1 3 UTR来抑制肿瘤细胞。
7、的迁移。 0006 本发明的对虾miR-35为对虾特有的miRNA， 通过测序获得其碱基序列为SEQ ID NO.1： 5 -AACUGUGAGAAGUUCCGGU-3 。 0007 本发明对虾病害防治的应用针对的是对虾白斑综合症病毒(WSSV)。 0008 本发明抑制人肿瘤转移的应用针对的肿瘤细胞是乳腺癌细胞MDA-MB-231。 0009 所述的对虾miR-35抑制作用的靶基因为人单核细胞系THP-1细胞诱导分化后的M2 型巨噬细胞中的CHI3L1基因。 0010 本发明的有益效果是： 0011 本发明对虾miRNA-35不仅可以抑制病毒在对虾体内的感染和复制， 发挥抗病毒作 用， 还能与。
8、CHI3L1mRNA 3 UTR相互作用， 敲低巨噬细胞内CHI3L1基因的表达， 从而影响肿瘤 细胞的转移。 说 明 书 1/4 页 3 CN 106176795 A 3 附图说明 0012 图1是miR-35对对虾体内WSSV拷贝数的影响。 0013 图2是miR-35对对虾死亡率的影响。 0014 图3是miR-35对M2型巨噬细胞内CHI3L1基因表达量的影响。 0015 图4是miR-35对M2型巨噬细胞内CHI3L1蛋白表达量的影响。 0016 图5是miR-35对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的影响。 具体实施方式 0017 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 001。
9、8 本发明的实施例如下： 0019 实施例先制备实验样本： 0020 对虾miR-35、 阴性对照miRNA和control miRNA具体均是利用In vitro Transcription T7Kit(Takara)体外转录获得。 0021 制备用于对虾病害防治实施例的阴性对照miRNA， 阴性对照miRNA的碱基序列为 SEQ ID NO.2： 5 -UAAGCGUAGUAUUGCAGCG-3 。 0022 制备用于抑制人肿瘤转移实施例的control miRNA， control miRNA的碱基序列为 SEQ ID NO.3： 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3 。。
10、 0023 实施例1 0024 1)配制实验组和对照组： 0025 实验组， 将对虾miR-35与稀释于磷酸盐缓冲溶液(PBS)的WSSV病毒液同时注射到 对虾体内， 对虾miR-35注射30 g miRNA的剂量， WSSV病毒液中含有104个WSSV病毒粒子； 0026 第一对照组， 将阴性对照miRNA与稀释于磷酸盐缓冲溶液(PBS)的WSSV病毒液同时 注射到对虾体内， 阴性对照miRNA注射30 g miRNA的剂量， WSSV病毒液中含有104个WSSV病 毒粒子； 0027 第二对照组， 将稀释于磷酸盐缓冲溶液(PBS)的WSSV病毒液单独注射到对虾体内， WSSV病毒液中含有1。
11、04个WSSV病毒粒子； 0028 第三对照组， 将磷酸盐缓冲溶液(PBS)单独注射到对虾体内， PBS溶液中不含WSSV 病毒粒子。 0029 2)然后按照以下方式进行两方面的实验： 0030 A)实验组、 第一对照组、 第二对照组和第三对照组中， 在注射对虾24h、 36h和48h 后， 收集各组对虾的腮丝， 提取腮丝中的基因组， 通过real-time PCR检测其中的病毒拷贝 数。 0031 病毒拷贝数结果如图1所示， 图中可见将对虾miR-35与WSSV病毒液同时注入对虾 之后， 对虾体内的病毒拷贝数较只注射WSSV病毒液组和同时注射阴性对照miRNA与WSSV病 毒液组均有显著下降。
12、， 说明对虾miR-35可以有效抑制病毒的感染和复制。 0032 B)实验组、 第一对照组、 第二对照组和第三对照组中， 在注射对虾12h、 24h、 36h、 48h和72h后， 计数各组对虾的死亡率。 0033 对虾的死亡率结果如图2所示， 图中可见将对虾miR-35与WSSV病毒液同时注入对 说 明 书 2/4 页 4 CN 106176795 A 4 虾之后， 对虾的死亡率较只注射WSSV病毒液组和同时注射阴性对照miRNA与WSSV病毒液组 均有显著下降， 说明对虾miR-35可以有效提高对虾的存活率。 0034 实施例2 0035 1)获得M2型巨噬细胞， M2型巨噬细胞由THP-。
13、1单核细胞诱导分化而来， 具体方法 为： 先以320nM丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)处理THP-1细胞6h， 再以20ng/ml白细胞介素4(IL-4) 和白细胞介素13(IL-13)继续处理THP-1细胞18h。 0036 2)配制实验组和对照组： 0037 实验组： 利用lipo RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)将对虾miR-35转染到M2型巨噬 细胞中， 转染48h后， 收集细胞及其培养上清。 0038 第一对照组： 利用lipo RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)将control miRNA转染到 M2型巨噬细胞中， 转染48h后， 收集细胞及其培养上清。 00。
14、39 第二对照组： M2型巨噬细胞不做任何处理， 48h后， 收集细胞及其培养上清。 0040 3)然后按照以下方式进行两方面的实验： 0041 A)对于实验组、 第一对照组和第二对照组， 均提取收集的M2型巨噬细胞中的RNA， 并检测CHI3L1基因的表达情况， 结果如图3所示， 图中可见转染对虾miR-35之后， M2型巨噬 细胞内CHI3L1基因mRNA水平的表达量发生了显著下调， 说明对虾miR-35可以有效抑制 CHI3L1基因的表达。 0042 B)对收集的M2型巨噬细胞进行Western blot试验， 检测CHI3L1蛋白水平的变化。 结果如图4所示， 图中可见转染对虾miR-。
15、35之后， M2型巨噬细胞内CHI3L1蛋白水平的表达量 发生了显著下调， 进一步说明对虾miR-35可以有效抑制CHI3L1基因的表达。 0043 C)将收集的M2型巨噬细胞培养上清与乳腺癌细胞MDA-MB-231于transwell中共培 养， 其中transwell上室铺上无血清培养基重悬的MDA-MB-231细胞， transwell下室为M2型 巨噬细胞培养上清。 共培养12h后， 检测迁移至transwell下层膜的MDA-MB-231细胞， 并用显 微镜计数。 0044 计数获得的乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移结果情况如图5所示， 图中可见当M2型巨 噬细胞中转染对虾miR-。
16、35后， 与之共培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力显著下降， 说明对虾miR-35可以有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移。 0045 由上述实施例可见， 本发明的对虾miRNA-35既能抑制病毒在对虾体内的感染和复 制， 发挥抗病毒作用， 还能与CHI3L1mRNA 3 UTR相互作用， 敲低巨噬细胞内CHI3L1基因的表 达。 0046 本发明涉及到的RNA序列如下： 0047 SEQ ID NO.1： 对虾miR-35 0048 来源： 人工合成 0049 序列： 5 -AACUGUGAGAAGUUCCGGU-3 ； 0050 SEQ ID NO.2： 阴性对照miR。
17、NA 0051 来源： 人工合成 0052 序列： 5 -UAAGCGUAGUAUUGCAGCG-3 ； 0053 SEQ ID NO.3： control miRNA 0054 来源： 人工合成 说 明 书 3/4 页 5 CN 106176795 A 5 0055 序列： 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3 。 说 明 书 4/4 页 6 CN 106176795 A 6 0001 序 列 表 1/1 页 7 CN 106176795 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 8 CN 106176795 A 8 图3 图4 图5 说 明 书 附 图 2/2 页 9 CN 106176795 A 9 。