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1、(10)申请公布号 CN 103251667 A (43)申请公布日 2013.08.21 CN 103251667 A *CN103251667A* (21)申请号 201310164839.4 (22)申请日 2013.05.07 A61K 36/28(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 19/02(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 张卫东 苏娟 单磊 李慧梁 沈云享 叶霁 林珊 曹邦静 张淑琴 (74)专利代理机构 上海。
2、新天专利代理有限公司 31213 代理人 王巍 (54) 发明名称 土木香总倍半萜内酯在制备治疗类风湿性关 节炎药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了土木香总倍半萜内酯在制备防 治类风湿关节炎的药物中的应用， 所述土木香总 倍半萜内酯含有土木香内酯和异土木香内酯， 两 酯的含量之和为 60-90%。本发明进行动物药效试 验， 结果显示均可抑制 CIA（胶原诱导的关节炎） 的临床发病， 明显抑制了 CIA 的发病率， 明显降低 IFN- 的水平， 显著抑制 IL-17 的生成。因此， 土 木香总倍半萜内酯及其中的土木香内酯及异土木 香内酯均可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。 本发明所述药物是。
3、由土木香总倍半萜内酯作为 活性成分与药用辅料组成的片剂、 胶囊剂、 软胶囊 剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射剂、 粉针剂或气雾剂等。本 发明提供了新的治疗类风湿关节炎的药物， 疗效 显著， 副反应少， 原料来源方便， 制备方法简单， 有 较大的临床应用价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103251667 A CN 103251667 A *CN103251667A* 1/1 页 2 1. 土木香总倍半萜内酯在制备防治类风湿关节炎。
4、的药物中的应用， 其特征在于， 所述 土木香总倍半萜内酯含有土木香内酯和异土木香内酯 ； 所述土木香内酯和异土木香内酯含 量之和为 60-90% ； 所述土木香内酯和异土木香内酯的结构式如下 ： 2. 根据权利要求 1 所述土木香总倍半萜内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应 用， 其特征在于， 所述土木香总倍半萜内酯通过下列方法制得 ： 土木香药材粉碎后， 在常压提取装置中用 60 90乙醇回流提取 2-3 次 , 每次 1 3 小时， 合并提取液过滤浓缩得浓缩液 ； 浓缩液加25倍体积的水稀释后,加入到大孔吸附 树脂柱上， 依次以10-20倍体积的去离子水洗脱大极性杂质， 再以10-20倍。
5、体积的4065% 乙醇进行洗脱， 继以 10-20 倍体积的 70 90% 的乙醇溶液洗脱得到洗脱液， 80 -100常 压干燥 12-24 小时， 即得土木香总倍半萜内酯 ； 所述土木香总倍半萜内酯再经硅胶色谱分 离， 可制备得到土木香内酯和异土木香内酯。 3. 根据权利要求 1 所述土木香总倍半萜内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应 用， 其特征在于， 所述治疗类风湿关节炎的药物是由土木香总倍半萜内酯作为活性成分与 药用辅料组成的药物组合物。 4. 土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。 5. 根据权利要求 4 所述土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用， 其特征 在于。
6、， 所述治疗类风湿关节炎的药物是由土木香内酯作为活性成分与药用辅料组成的药物 组合物。 6. 异土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述异土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用， 其特 征在于， 所述治疗类风湿关节炎的药物是由异土木香内酯作为活性成分与药用辅料组成的 药物组合物。 8.根据权利要求3、 5或7所述的应用， 其特征在于， 所述药物组合物为片剂、 分散片、 含 片、 口崩片、 缓释片、 胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射剂、 粉针剂或气雾剂。 权 利 要 求 书 CN 103251667 A 2 1/7 页 3 土木香总倍半萜。
7、内酯在制备治疗类风湿性关节炎药物中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及药物， 具体涉及从中药旋覆花属土木香中制备得到的土木香总倍半萜 内酯在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。 背景技术 0002 类风湿性关节炎 （Rheumatoid Arthritis， RA） 是一种病因尚未明了的慢性全身性 炎症性疾病， 以慢性、 对称性、 多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现， 属于自身免疫 炎性疾病。该病好发于手、 腕、 足等小关节， 易反复发作， 并呈对称性分布。患病早期有关节 红肿热痛和功能障碍表现， 到达晚期时， 关节可出现不同程度的僵硬畸形， 并伴有骨和骨骼 肌的萎缩， 极易致残。从病。
8、理改变的角度来看， 类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜 （以后可波及到关节软骨、 骨组织、 关节韧带和肌键） ， 其次为浆膜、 心、 肺及眼等结缔组织的 广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外， 还有发热、 疲乏无力、 心 包炎、 皮下结节、 胸膜炎、 动脉炎、 周围神经病变等。但是， 类风湿性关节炎至今尚无特效疗 法， 仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。 0003 旋覆花属 (Inula L.) 植物是菊科 （Compositae） 中的一属， 全世界约有 100 种， 分 别产于亚洲、 欧洲和非洲， 以地中海地区为主。中国有 20 余种， 本属的多种植物常供药用， 如土木。
9、香 (I.helenium) 可作为健胃、 利尿、 祛痰和驱虫药 ； 大花旋覆花 (I.britannica) 具 有消痰、 下气、 软坚、 行水等功效。倍半萜类化合物是本属植物的特征性成分， 以桉烷型、 吉 马烷型和愈创木烷型为主， 还包括伪愈创木烷型、 裂环桉烷型、 榄烷型、 苍耳烷型和少量的 无环倍半萜及倍半萜二聚体。 研究表明， 该属植物中的倍半萜类化合物具有驱虫杀虫、 抗菌 抗肿瘤、 抗病毒、 免疫抑制的功效。土木香 （Inula Radix） 药材是菊科旋覆花属植物土木香 Inula helenium L. 的干燥根， 辛、 苦、 温， 具有健脾和胃、 行气止痛的功效， 为 201。
10、0 版 中国 药典 收载。 土木香药材中含有较多的倍半萜内酯类成分， 该类成分具有较好的抗肿瘤活性 以及抗炎活性而日渐被关注。从土木香中分离得到的倍半萜内酯类成分包括土木香内酯、 异土木香内酯、 木香烃内酯、 二氢木香烃内酯、 凤毛菊内酯等， 其中土木香内酯和异土木香 内酯的含量较高。 有文献报道 （李雪莲， 朴惠善， 土木香的化学成分及药理作用研究进展， 中 国现代中药， 2007,9（6） :28-29） 土木香中的倍半萜类化合物具有抑制肿瘤细胞、 驱虫、 抗 菌、 抑制平滑肌、 降血糖和利胆等作用。 0004 有研究报道， TNF- 与 IFN- 在体外共同刺激纤维原细胞和人微血管内皮细。
11、胞 可协同诱导趋化因子 CXCL10 的产生， RA 病人滑液中大量 CXCL10 的表达导致活化 Th1 细胞 及自然杀伤细胞的浸润， 对组织造成损伤。 （1、 Ueno A,Yamamura M,Iwahashi M,Okamoto A,Aita T,Ogawa N,Makino H.The production of CXCR3-agonistic chemokines by synovial fibroblasts from patients with rheumatoid arthritis.Rheumatol Int.2005 Jun;25(5):361-7。2、 Bedard P。
12、A,Golds EE:Cytokine-induced expression of mRNAsfor chemotactic factors in human synovial cells and fibroblasts.J Cell 说 明 书 CN 103251667 A 3 2/7 页 4 Physiol1993,154:433-441） 在类风湿关节炎的模型中升高的IL-15可通过诱导IL-17而发 挥其促炎症细胞因子的特性， IL-15 可能通过环孢菌素 A 和类固醇敏感的途径， 导致关节中 的 IL-17 过度分泌。IL-17 除了可刺激滑膜细胞释放各种炎症介质外， 还可通过刺激 。
13、RANKL 与 RANK 结合， 刺激骨吸收， 是目前认识到的在类风湿性关节炎骨破坏病理中最重要的细胞 因子之一。 本发明人对土木香进行了系统的研究， 制备了土木香总倍半萜内酯， 发现土木香 总倍半萜内酯及其内酯类成分具有较好的抗类风湿性关节炎活性， 因此， 可进一步开发治 疗药物。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于研究设计土木香总倍半萜内酯及其内酯类化合 物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。 0006 本发明提供了土木香总倍半萜内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。 0007 本发明所述土木香总倍半萜内酯含有土木香内酯和异土木香内酯。 土木香内酯和 异土木香内酯含量之。
14、和为 60-90% 0008 本发明所述土木香总倍半萜内酯是通过下列方法制备得到的 ： 0009 土木香药材粉碎后， 在常压提取装置中用 60 90乙醇回流提取 2-3 次 , 每 次 1 3 小时， 合并提取液过滤浓缩得浓缩液 ； 浓缩液加 2 5 倍体积的水稀释后 , 加入 到大孔吸附树脂柱上， 依次以 10-20 倍体积的去离子水洗脱大极性杂质， 再以 10-20 倍体 积的 40-65% 乙醇进行洗脱， 继以 10-20 倍体积的 70 90% 的乙醇溶液洗脱得到洗脱液， 80 -100常压干燥 12-24 小时， 即得土木香总倍半萜内酯原料， 其中土木香内酯和异土 木香内酯的含量之和。
15、为 60 90%。木香总倍半萜内酯原料经硅胶色谱分离， 可制备得到土 木香内酯和异土木香内酯。本发明中土木香内酯和异土木香内酯的结构式如下 ： 0010 0011 0012 本发明采用土木香总倍半萜内酯及其中的土木香内酯和异土木香内酯进行动 物药效试验， 结果显示土木香总倍半萜内酯、 土木香内酯及异土木香内酯均可抑制 CIA （Collagen-Induced Arthritis， 胶原诱导的关节炎） 的临床发病， 明显抑制了 CIA 的发病 严重程度和发病率， 说明土木香总倍半萜内酯、 土木香内酯及异土木香内酯对 CIA 具有明 显的保护作用。并能下调脾细胞上清液中 TNF-（肿瘤坏死因子 。
16、） 、 IL-17（白介素 17） 、 IFN-（干扰素 ） ， 抑制促炎细胞因子 TNF-、 IFN- 和 IL-17 的分泌， 从而对 CIA 疾病 具有保护作用。TNF- 和 IFN- 在 RA 发病机制中起着重要作用。TNF- 可直接诱导蛋 白水解酶的合成， 造成基质结构的破坏。实验结果也表明， 土木香总倍半萜内酯、 土木香内 酯及异土木香内酯可较大程度降低脾脏细胞分泌 TNF-。用抗 TNF- 疗法在治疗 RA 上 取得了良好的效果， 不但阻止了骨组织破坏而且也抑制了 IL-17 的产生。土木香总倍半萜 说 明 书 CN 103251667 A 4 3/7 页 5 内酯、 土木香内酯。
17、及异土木香内酯对炎症的控制及对关节组织的保护可能与其降低 TNF- 含量有关。 0013 另外， IFN- 主要由浸润在病灶局部的 CD4+T 细胞分泌， 它可以激活巨噬细胞， 活化的巨噬细胞随后表达多种炎症因子， 参与并加重炎症反应 ； IFN- 还可诱导 MIP-1、 MIP-1 和 IP-10 的表达， 这些趋化因子参与淋巴细胞向病灶迁移的过程。本发明的实验 中， 土木香总倍半萜内酯、 土木香内酯及异土木香内酯在体内明显降低了 IFN- 的水平， 有可能与阻断了淋巴细胞的后继迁移有关。本发明中， 土木香总倍半萜内酯及其中的土木 香内酯及异土木香内酯均可显著抑制IL-17的生成， 它们对C。
18、IA有明显的疗效， 可明显抑制 CIA 临床发病， 降低炎性细胞因子 TNF- 及 IFN- 的分泌， 这也是其治疗类风湿关节炎的 机制。因此， 本发明土木香总倍半萜内酯可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。 0014 其中所述的土木香内酯及异土木香内酯也可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。 0015 本发明所述治疗类风湿关节炎的药物是由土木香总倍半萜内酯作为活性成分与 药用辅料组成的药物组合物。 0016 本发明所述治疗类风湿关节炎的药物是由土木香内酯作为活性成分与药用辅料 组成的药物组合物。 0017 本发明所述治疗类风湿关节炎的药物是由异土木香内酯作为活性成分与药用辅 料组成的药物组合物。 0。
19、018 本发明所述药物组合物为片剂、 胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射剂、 粉针剂 或气雾剂等。 0019 本发明提供了一种新的治疗类风湿关节炎的药物， 而且是从中药提取物中制备的 药物， 克服了现有治疗类风湿关节炎药物的不足之处， 疗效显著， 副反应少， 原料来源方便， 制备方法简单， 有较大的临床应用价值。 附图说明 0020 图 1 土木香倍半萜内酯临床评分图 0021 图中模型组对照组土木香总倍半萜内酯 10mg/kg土木香总倍 半萜内酯 30mg/kg土木香内酯 5mg/kg土木香内酯 15mg/kg异土木香内酯 5mg/kg异土木香内酯 15mg/kg 0022 图 2。
20、 脾细胞上清细胞因子结果图 0023 图中 （1） TNF- 检测结果 （2） IL-17 检测结果 （3） IFN- 检测结果 ；空白组 模型组甲氨喋呤组土木香总倍半萜内酯 10mg/kg土木香总倍半萜内酯 30mg/kg 土木香内酯 5mg/kg ；土木香内酯 15mg/kg异土木香内酯 5mg/kg异土木香内酯 15mg/kg 具体实施方式 0024 实施例 1 土木香总倍半萜内酯及土木香内酯、 异土木香内酯的制备 0025 （1） 土木香药材 （市售得到， 产地 ： 河北安国） 10kg 粉碎后， 在加热回流提取罐中用 80L60% 乙醇回流提取二次 （每次 80L） ， 每次 1 小。
21、时， 合并提取液， 85 -90减压浓缩到 8L， 说 明 书 CN 103251667 A 5 4/7 页 6 相当于每 ML 含 0.8g 药材， 加入 16L 水稀释后加入到 D101 大孔吸附树脂柱上， 以 100L 的去 离子水洗脱糖类， 再以100L40%乙醇进行洗脱， 再以100L70%的乙醇进行洗脱， 收集该部分， 85常压干燥 20 小时， 得到土木香总倍半萜内酯 265g， 经 HPLC 法， 以 Agilent Zorbax C18 柱 (4.6*250mm， 5) 进行分析， 流动相为乙腈 -0.05% 甲酸溶液 （55:45） ， 检测波长为 205nm 测定其中土木。
22、香内酯和异土木香内酯的含量之和为 75.3%。 0026 取 （1） 所得土木香总倍半萜内酯原料 20g， 应用硅胶柱色谱， 以体积比为 100 ： 0 2 ： 1 的二氯甲烷 / 甲醇系统梯度洗脱， 薄层色谱检测， 分别收集含有土木香内酯和异土木香 内酯的流分， 经液相色谱制备 （流动相甲醇 ： 水 （70 ： 30） ， 检测波长 203nm， Agilent Zorbax C18制备色谱柱 （9.6*150mm， 5)） ， 流速为2ml/min， 分别得土木香内酯4.5g和异土木香内 酯 6.3g。 0027 实施例 2 动物药效学试验 0028 一、 实验材料 0029 药物与试剂 。
23、0030 鸡 II 型胶原 (C ) ： Chondrex， Redmond， WA98052， USA ； 不完全弗氏完全佐剂 （IFA） Difco Laboratories， Detroit， MI ； 磷酸缓冲盐溶液 （PBS） 配制 : 在 800ml 蒸馏水中 溶解8gNaCl， 0.2g KCl， 1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。 用盐酸调PH至7.4， 加水定容至1L， 过滤除菌后使用 ； DMSO 二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide， DMSO) ： 为 sigma 公司产品 ； 1640 培养基 ： 吉诺生物医药技术有限公司 ； 小牛血。
24、清 ： 民海生物有限公司 ； 96 孔平底板， CORNING 公司 ； 70m细胞研磨滤网， BD Falcon公司 ； 15ml、 50ml离心管， BDFalcon公司 ； 0.22m滤 器， Millipore 公司 ； 1ml 旋口注射器， BD 公司 ； 贝朗三通， 德国贝朗公司 ； 甲氨喋呤片 ： 上海 医药 （集团） 有限公司信谊制药总厂 （080605） ； 0031 土木香总倍半萜内酯、 土木香内酯、 异土木香内酯由实施例 1 制备得到。 0032 动物 0033 DBI/I 型小鼠， 雄性， 6-8 周， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供， 许可证 号 ： SCXK（。
25、沪） 2007-0005， 饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境中。 0034 仪器与设备 0035 高速台式离心机， Eppendorf ； 高速台式低温离心机， HITACHI 公司 ； 倒置显微镜， Nikon 公司 ； 超净台， 苏净集团安泰公司制造 ； 电热恒温鼓风干燥箱， 上海精宏实验设备有 限公司 ； 湿度 CO2培养箱， Heraus 公司 ； 恒温水浴锅， 上海国华电器有限公司。 0036 二、 实验方法 0037 模型的建立 0038 实验准备 0039 完全弗氏佐剂 （CFA） 的制备 ： 在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支杆菌至 终浓度 4mg/ml， 使用之前。
26、充分混匀。 0040 0.01M 冰乙酸制备 ： 11.43l 冰乙酸溶于 20ml 去离子水中， 过滤， 4备用。 0041 C 制备 ： 将 C 溶解于 0.01M 冰乙酸至终浓度 4mg/ml， 4保存。 0042 抗原的乳化 ： 用三通管连接两支玻璃针管， 将 PBS、 完全弗氏佐剂和抗原 C 分别 加入一支针管中 （每 100l 乳化液含 200g C 和 50l 完全弗氏佐剂） ， 排除针管内气 泡后， 来回推动针管约 500 次， 将针管内各成分充分混匀成乳化状态。 说 明 书 CN 103251667 A 6 5/7 页 7 0043 CIA 模型的诱导 0044 第 0 天，。
27、 小鼠尾根部 2-3 厘米处给予 100l/ 只乳化好的 C 抗原皮下注射免疫 ； 第21天， 加强免疫 ： 50l C和150l PBS充分混匀， 150ul/只腹腔注射 ； 正常组用生理 盐水同法注射。 0045 三、 实验分组和给药方案 0046 大鼠随机分为 9 组， 每组 12 只， 分别为正常组、 CIA 模型组、 阳性对照组 （甲氨喋呤 2mg/kg） 、 土木香总倍半萜内酯组分为低、 高剂量组 （给药剂量分别为 10mg/kg、 30mg/kg） 、 土 木香内酯分、 高剂量组 （给药剂量分别为 5mg/kg、 15mg/kg） 、 异土木香内酯分低、 高剂量组 （给药剂量分别。
28、为 5mg/kg、 15mg/kg） ， 共计 9 组。于二次免疫前一天 （第 20 天） 至第 34 天土 木香总倍半萜内酯组、 土木香内酯组、 异土木香内酯组分别按照上述剂量连续灌胃给药， 甲 氨喋呤组每两天按 2mg/kg 给药， 正常组和模型组按 10ml/kg 给予饮用水。 0047 1、 多发性关节炎指数 (arthritis index， AI) 评分 0048 二次免疫后， 定期记录小鼠全身关节病变情况， 按 3 级评分法评价， 计算发病率及 平均发病指数。具体评分标准为 ： 0 分 - 关节正常 ； 1 分 - 关节轻微红肿 ； 2 分 - 关节红肿严 重， 累及整个关节， 。
29、活动受限 ； 3 分 - 爪子或关节功能障碍， 关节僵硬。四肢的总和为小鼠的 评分， 最高为 12 分。 0049 2、 淋巴及脾脏单个核细胞 （MNC） 悬液的制备 0050 小鼠处死， 固定， 剪开腹部皮肤， 取两侧腹股沟淋巴结 ； 后打开腹腔， 取出脾脏， 立 即放入装有1640的15ml离心管中， 置于冰上 ； 将脾脏倒入70m的细胞研磨滤网中， 用1ml 注射器针芯充分研磨， 使之成细胞悬液 ； 收集细胞悬液， 4， 1000rpm， 离心 8min， 离心后弃 去上清 ； 打散细胞， 加入 0.83% 氯化铵水 （约 1.0ml/ 脾脏） ， 裂解 5min ； 加入 3 倍体积的。
30、 PBS 终止裂解反应， 并用玻璃吸管去除细胞悬液中的絮状物 ； 4， 1000rpm， 离心 8min， 离心后 弃去上清 ； 打散细胞， 加入 1ml1640 （含小牛血清） ， 混匀后计数， 以 1640 完全培养基 （含小牛 血清） 在 96 孔板中培养， 5106/ml 每孔 100ul， 贴壁 2 小时。 0051 3、 脾细胞 NO 测定 0052 在 96 孔平圆底板中每孔加入 5106/ml 脾脏 MNC100ul， 每组 4 复孔 ； 贴壁 2 小时 后， 换液 DMEM 培养基， 每孔加 LPS（终浓度 1ug/ml） ， 将细胞置于 37， 5 CO2培养箱中培 养 1。
31、8 小时后取出上清液检测 NO。 0053 4、 脾、 淋巴细胞增值测定 0054 在 96 孔平圆底板中分别加入 5106/ml 脾脏及淋巴 MNC100ul， 每组 4 复孔 ； 贴壁 2 小时后， 加 C （100ug/ml） ， 将细胞置于 37， 5 CO2培养箱中培养 72 小时后取出加 MTS 测增值。 0055 5、 脾细胞细胞因子测定 0056 在 96 孔平圆底板中加入 5106/ml 脾脏 MNC100ul， 每组 4 复孔 ； 贴壁 2 小时后， 加 C （100ug/ml） ， 将细胞置于 37， 5%CO2培养箱中培养 48 小时后取上清液检测细胞因子。 0057 。
32、四、 结果 0058 1、 土木香倍半萜内酯可抑制 CIA 的临床发病 0059 在此 CIA 的实验中， 用 C 诱导 CIA 模型， 初次免疫为第 0 天， 第 21 天加强免疫 后小鼠随机分为 9 组。于第 20 天开始给， 阳性对照组每两天给予甲氨喋呤药 2mg/kg， 土木 说 明 书 CN 103251667 A 7 6/7 页 8 香总倍半萜内酯低剂量组给予 10mg/kg， 高剂量组 30mg/kg ； 土木香内酯低剂量组给予 5mg/ kg， 高剂量组15mg/kg， 异土木香内酯低剂量组给予5mg/kg， 高剂量组15mg/kg， 连续给药14 天， 直到实验结束。每天观察。
33、小鼠并依据评分标准给每只小鼠评分。 0060 C 诱导 CIA， 加强免疫后小鼠陆续出现发病， 对照组与用药组在发病时间上没有 明显差异。发病后， 模型组小鼠疾病严重程度加重较快， 在免疫后第 37 天达到高峰， 而给药 组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和 （图 1） 。从发病率来看， 模型组为 90%， 对照组为 71%， 土木香总倍半萜内酯低、 高剂量分别为 59%、 74% ； 土木香内酯低、 高剂量组分别为 51%、 65% ； 异土木香内酯低、 高剂量组分别为 48%、 61%。由此可见， 土木香倍半萜内酯对 CIA 发病 时间没有明显影响， 但明显抑制了 CIA 的发病严重程度和。
34、发病率， 说明土木香倍半萜内酯 对 CIA 具有明显的保护作用。 0061 2、 土木香倍半萜内酯能下调脾细胞上清液中 TNF-、 IL-17、 IFN- 0062 在体内给予药物治疗 CIA 的实验中， 疾病达到平台期后处死小鼠， 取出脾脏细胞， 制成单细胞悬液， 每孔 1.5106个细胞铺板， 在体外用 20g/ml 的抗原 C 刺激， 培养 48 小时后收集上清， 用 ELISA 方法测量细胞因子 TNF-、 IFN- 的浓度。 0063 如图 2 所示， C 刺激后， 模型组细胞上清中 TNF-、 IFN- 及 IL-17 均高于各个 药物处理组， 与阳性对照组及土木香倍半萜内酯各给药。
35、组相比， 存在统计学差异 （p0.05） 。 说明体内给予药物治疗后， 能够抑制促炎细胞因子TNF-、 IFN-和IL-17的分泌， 并能从 而对 CIA 疾病具有保护作用。 0064 实施例 3 0065 片剂 ： 土木香总倍半萜内酯 30g 0066 乳糖 190g 0067 玉米淀粉 75g 0068 硬脂酸镁 5g 0069 制备方法 ： 将土木香总倍半萜内酯、 乳糖和淀粉混合， 用水均匀湿润， 把湿润后的 混合物过筛并干燥， 再过筛， 加入硬脂酸镁， 然后将混合物压片， 每片重 300mg， 含土木香总 倍半萜内酯原料为 30mg。 0070 实施例 4 ： 0071 软胶囊 ： 0。
36、072 囊心处方 0073 0074 囊壳处方 0075 明胶 200g 说 明 书 CN 103251667 A 8 7/7 页 9 0076 甘油 60g 0077 水 305.2g 0078 黑氧化铁 1.5g 0079 土木香总倍半萜内酯称量前过 100 目筛。取蜂蜡 10g， 加大豆油 300g， 80水浴下 熔融混匀， 冷却至室温 （25） 。加入原料土木香总倍半萜内酯、 叔丁基对羟基茴香醚、 枸橼 酸， 再加大豆油至 500g， 充分混匀， 制备囊心药液待用。 0080 取明胶， 加入适量的水使明胶吸水膨胀。另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至 70-80， 混合均匀， 加入膨胀的。
37、明胶， 搅拌， 熔融， 保温 1-2 小时， 真空抽气以除去气泡， 以 洁净白布过滤， 加入黑氧化铁粉末， 混匀， 保温待用。 0081 将已制好的明胶甘油液和囊心药液装入自动旋转轧囊机中， 胶带温度控制在 40-50， 囊心药液温度控制在 25， 压制出每粒含 500mg 药液的软胶囊， 30-32、 相对湿度 28% 条件下烘干 24 小时， 包装即得。 0082 实施例 5 ： 0083 注射液 ： 土木香内酯 10g 0084 葡萄糖 50g 0085 制备方法 ： 将土木香内酯和葡萄糖溶解于 100L 注射用水中， 过滤所得溶液， 在无 菌条件下装入输液瓶中， 每瓶 100ml 含土木香内酯 10mg。 0086 实施例 6 ： 0087 注射用冻干粉针剂 ： 异土木香内酯 10g 0088 甘露醇 40g 0089 制备方法 ： 将异土木香内酯和甘露醇溶解于 2000ml 注射用水中， 过滤所得溶液， 在无菌条件下装入西林瓶中， 冻干， 每支 50mg 含异土木香内酯 10mg。 说 明 书 CN 103251667 A 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103251667 A 10 。