技术领域
本发明涉及槲皮素，具体是槲皮素脂质体的制备方法及其应用。
背景技术
槲皮素是天然的黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜及水果中。槲皮素具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化作用，并影响多种酶的活性，是一种潜在的化疗药物。由于槲皮素不溶于水，难于吸收，极大地限制了其在体内吸收、给药和生物利用。国外Ⅰ和Ⅱ期临床试验证实了槲皮素在体内能抑制多种肿瘤进展，然而，其溶剂二甲亚矾，会导致人体溶血，肝肾损害及难闻的气味，限制了槲皮素用于临床。解决这个问题方法之一通过对槲皮素进行化学修饰，然而这需要多步骤化学反应，修饰后的槲皮素结构不稳定，降低槲皮素的抗瘤效果。
发明内容
本发明的目的之一是：提供槲皮素脂质体的制备方法。
本发明的目的之二是：公开槲皮素脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之三是：公开槲皮素脂质体在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。
本发明槲皮素脂质体的制备方法，采用旋转蒸发法，具体步骤如下：
（1）称取槲皮素:胆固醇:卵磷脂:聚乙二醇4000按重量比6:4:13:1放入圆底烧瓶中；
（2）在负压旋转蒸发仪上加入按3:1体积比的三氯化甲烷及甲醇，蒸干，在瓶底形成黄色膜状物；
（3）向烧瓶中加入去离子水，0℃超声破碎，悬液在4℃下水化24h，然后再水浴超声仪处理20min，使之扩散形成平均粒径小于200nm的脂质体；
（4）旋转恒温负压蒸发仪上，分装冷冻保存，得到槲皮素脂质体。
本发明将不溶于水的槲皮素用纳米脂质体包裹，制备成槲皮素脂质体，通过实验研究槲皮素脂质体（LQ）对糖尿病大鼠肾脏糖基化终产物（AGEs）及其受体（RAGE）和TGF-β1表达的影响，以及其对DM 大鼠肾脏的影响，并与氨基胍（Aminoguanidine，AG）对比，探讨LQ 对DM 肾脏的干预作用。实验表明，槲皮素脂质体能够在一定程度上减轻糖尿病肾病的形态病理学改变，改善STZ性DM大鼠的一般状况，有降血糖的作用。本发明为槲皮素脂质体的下一步临床应用研究打下基础，同时也对探索DM的临床中药治疗提供新的思路和理论依据。
附图说明
图1为实验例中各组大鼠肾脏免疫组化PAS染色情况（×400）照片；
图2为实验例中各组大鼠肾脏免疫组化AGEs表达情况（×400）照片；
图3 为实验例中各组大鼠肾脏免疫组化TGF-β1表达情况（×400）照片；
图中，A-F分别为N组、DM组、LQ-L组、LQ-M组、LQ-H组、AG组。
图4 为实验例中各组大鼠肾组织 RAGE mRNA表达情况；
图5为实验例中各组大鼠肾组织 TGF-β1mRNA表达情况；
图中，marker左侧为β-actin，marker右侧为RAGE mRNA，1-6分别为N组、DM组、LQ-L组、LQ-M组、LQ-H组、AG组。
具体实施方式
下面结合实验例和附图对本发明内容作进一步的详细说明。
实验例：槲皮素脂质体的制备及其应用
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 实验动物
SPF级65只雄性SD健康成年清洁大鼠，体质量190～220 g，6～8周龄，由桂林医学院动物实验室（SPF级）提供，在桂林医学院动物实验室饲养。饲养条件：室温18～25℃，保持空气流通，相对湿度55～70%，12h光照维持，模拟昼夜循环，每日清洗笼子换垫料保持其生活环境清洁干燥。
1.2 实验方法
1.2.1 槲皮素脂质体的制备
本实验用旋转蒸发法制备，具体制备步骤如下：
（1）称取槲皮素：胆固醇：卵磷脂：聚乙二醇4000按重量比6:4:13:1放入圆底烧瓶中；
（2）在负压旋转蒸发仪上加入按3:1体积比的三氯化甲烷及甲醇，蒸干，在瓶底形成黄色膜状物；
（4）向烧瓶中加入去离子水，0℃超声破碎，悬液在4℃下水化24h，然后再水浴超声仪处理20min，使之扩散形成平均粒径小于200nm的脂质体；
（4）旋转恒温负压蒸发仪上，分装冷冻保存，得到脂质体槲皮素，同时制备空白脂质体，方法同前，配方中无槲皮素；
（5）脂质体槲皮素的理化分析：在电子显微镜下检测脂质体槲皮素的大小，高效液相色谱法（HPLC）检测脂质体槲皮素载药量和包封率。
1.2.2 动物模型建立
65 只SD 大鼠饲养1 周，记录每只大鼠24 h 尿量。采用随机数字表法选取8 只作为正常组，普通饲料喂养，剩余全部食用高糖高脂饲料，饲料配方参照文献[13]。4 周后禁食12 h，腹腔注射STZ 40 mg/kg（临用前溶于0.1 mmol/L、pH4.2～4.5 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中）诱导2型糖尿病模型。N 组注射同剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。饲养3 d 后，每日清晨7:00 采尾静脉血检测血糖，连续测3 次血糖均≥16.7 mmol/L 认为DM模型成功建立。将成功建立2 型糖尿病模型的大鼠继续饲养2 周后留取24 h 尿液，达到以下条件则定为糖尿病肾病模型建立成功：（1）空腹血糖持续≥16.7 mmol/L；（2）尿白蛋白排泄率>20 μg/min；（3）尿量是健康状态时的1.5 倍；最终52 只成模。
1.2.3 动物模型分组
将成模的大鼠采用随机数字表法选取50 只成模大鼠分为以下5 组：DM 组，LQ-低（LQ-L）组、中（LQ-M）组、高（LQ-H）组，AG 组，各组均为10 只。按以下剂量给予相应的药物：LQ-L 组50 mg/(kg·d)，LQ-M 组150 mg/(kg·d)，LQ-H 组250 mg/(kg·d)，AG 组用氨基胍100mg/(kg·d)，DM 组和N 组用蒸馏水100 mg/(kg·d)。定于每日约10:00 灌胃。每3 d 监测血糖和称体质量1 次。实验期间DM 组和LQ-L 组大鼠各死亡2 只，LQ-H 组和AG 组各死亡1 只，统计数据时将死亡大鼠数据剔除。
1.2.4 标本的收集
灌胃处理8 周后，将大鼠单独置于代谢笼中，采集每只大鼠24 h 尿液，并以3 000 r/min 离心5 min，取上清液6 mL 用于测定24 h 尿微量白蛋白。禁食12 h 后，分别测定空腹血糖和称体质量。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速腹主动脉取血4~5 mL，取2 mL 测血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），剩余以12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清备待测AGEs、SOD、MDA。剖腹取双侧肾脏标本，剔除肾周包膜，并用0.9% NaCl 溶液洗净，干净滤纸吸收水份，称肾质量，计算肾脏肥大指数（KI）=双侧肾质量/体质量×100%。快速液氮保存左肾，-80 ℃冰箱保存；右肾从纵轴面对半切开，4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋备用，制备成3 μm 厚切片，用于PAS 染色及免疫组化。
1.2.5 生化指标的检测
罗氏血糖仪及配套试纸检测血糖，全自动生化分析仪检测BUN、Scr；用分光光度计法检测SOD、MDA，用ELISA 法检测血清AGEs表达水平和24h尿微量白蛋白，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，并根据相应的检测方法及计算公式计算出标本中各指标的相应浓度。
1.2.6 PAS 染色观察肾脏病理改变
前期准备的大鼠的糖尿病肾病蜡块，蜡块切片脱蜡至水→流水冲洗→1%过碘酸溶液10min→流水冲洗→吹干→schiff氏液37℃孵育10min→镜观→流水冲洗→苏木精染核5min→流水冲洗→盐酸酒精分化10-15s→流水冲洗→弱氨水返蓝10-15s→流水冲洗→系列酒精脱水-二甲苯I、II分别透明10min左右→树胶封固，并在显微镜下观察肾小球、肾小管、基质增生、基膜厚度等情况。
1.2.7 免疫组化法检测肾脏AGEs 及TGF-β1的表达
肾脏组织经石蜡包埋切片后，在60 ℃烤箱中烤片2 h，以0.4%胃酶修复、山羊血清封闭、PBS 冲洗，一抗分别按以下浓度稀释（AGEs 1∶100，TGF-β1 1:200），二抗（生物素标记的羊抗兔IgG）及三抗先后在37 ℃下孵育20 min，DAB显色，适时终止；复染、分化、脱水、风干、封片。阳性标本（抗体公司提供的大鼠动脉粥样硬化斑块玻片）作为阳性对照，PBS 作为阴性对照，光镜下阳性反应部位为棕黄色，细胞核呈淡蓝色。观察低倍视野（×100）下反应情况，各例随机读取5 个高倍视野（×400），通过Image-Pro Plus6.0 获得阳性表达的平均光密度（MOD）。
1.2.8 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肾脏AGEs mRNA及TGF-β1mRNA的表达
根据柱式法提取肾组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度后，将总RNA根据TaKaRa 逆转录说明书逆转录成cDNA后进行扩增，β-actin 为内参。PCR 扩增反应系统包括25 μL Premix Taq，cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2μL，RNase-Free Water 19 μL，共50 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30min，循环30次数左右；72 ℃延伸1 min。取PCR产物6 µL用浓度为1.5%琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙啶）电泳鉴定，用SensiAnsys凝胶成像系统摄影并定量分析，计算目的基因与内参基因光密度值的比值。
1.2.8 统计学方法
采用SPSS 18.0 进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 槲皮素脂质体的理化性质
槲皮素脂质体在显微镜下观察其粒径分布在（128.8±18.05）nm，高效液相色谱法检测其载药量约为（58±7）%，包封率为（87.1±2.7）%。
2.2 各组大鼠血糖、体质量、KI 的比较
与N 组比较，DM、LQ-L、LQ-M、LQ-H 和AG 组的血糖显著升高，体质量明显降低，KI 增大（均P < 0.05）。与DM组对比，LQ-L 组血糖差异无统计学意义，LQ-M、LQ-H 和AG 组血糖降低（均P < 0.05）；与DM 组比较，LQ 各剂量组体质量增加，血糖、KI 降低（均P< 0.05），见表1；
表1 各组大鼠空腹血糖、体质量及KI 的比较（）
＊＊P<0.01；a与N组比较，P<0.01； b与DM组比较，P<0.05。
2.3 各组大鼠生化指标的比较
与N 组比较，DM、LQ-L、LQ-M、LQ-H、AG 组BUN、Scr、MDA含量、血清AGEs、24 h 尿微量白蛋白水平均增高，血清中SOD活性水平明显降低（均P < 0.05）；与DM组比较，LQ-L、LQ-M、LQ-H、AG 组BUN、Scr、MDA含量、血清AGEs、24h尿微量白蛋白降低，血清中SOD活性水平明显升高，其中以LQ-M组改善最为明显（均P < 0.05），见表2、表3。
表2 各组大鼠BUN、Scr、MDA、SOD 的比较（）
＊＊P<0.01；a与N组比较，P<0.01； b与DM组比较，P<0.05。
表3 各组大鼠血清AGEs、24h尿微量白蛋白 的比较（）
＊＊P<0.01；a与N组比较，P<0.01； b与DM组比较，P<0.05。
2.4 各组大鼠肾脏的病理改变
PAS 染色显示N组肾小管结构、肾小球基底膜正常，系膜基质均匀；DM 组见肾小球结构紊乱，肾小球体积明显萎缩，肾小球系膜区基质增多，基底膜增厚；LQ 各剂量组肾脏的上述病理改变较DM 组有所改善，以中剂量组改善最明显，见图1。
2.5 免疫组化检测各组大鼠肾脏AGEs和TGF-β1蛋白的表达情况
免疫组化结果显示，AGEs和TGF-β1在N 组大鼠肾小管有一定程度的表达；与N 组比较，DM 组表达增多，肾小管上皮细胞包膜和（或）胞浆呈棕黄色强阳性；与DM 组比较，LQ 各剂量组表达减少，以中剂量组减少最明显，且中剂量组与AG 组效果类似，AGEs表达见图2、TGF-β1表达见图3，表4。
表4 各组大鼠肾脏免疫组化AGEs蛋白和TGF-β1蛋白表达的情况（）
＊＊P<0.01；a与N组比较，P<0.01； b与DM组比较，P<0.05。
2.6 RT-PCR法检测肾脏AGEs mRNA及TGF-β1mRNA的表达情况
RT-PCR 结果显示，与N 组比较，DM 组RAGE mRNA和TGF-β1mRNA表达量增加明显；与DM 组比较，LQ 各剂量组表达减少，以中剂量组减少最明显，且中剂量组与AG 组效果类似，RAGE mRNA表达见图4，TGF-β1mRNA表达见图5，表5。
表5 各组大鼠肾脏AGEs mRNA和TGF-β1mRNA表达情况
＊＊P<0.01；a与N组比较，P<0.01； b与DM组比较，P<0.05。
3 槲皮素脂质体对血糖、AGEs和TGF-β1的影响
DN的发病因素尚未完全研究清楚，其中公认的高危因素是持续的高血糖。槲皮素属天然黄酮类化合物，因其具有抗氧化、降血糖、降血脂等作用受到广泛学者的青睐研究。有研究观察发现DM大鼠经Que治疗后，DM大鼠的尿蛋白排泄量及AGEs含量明显下降。本实验中经槲皮素脂质体治疗后大鼠肾小球中AGEs和RAGE的表达明显减少，提示槲皮素脂质体可以抑制肾脏非酶糖基化终产物及其受体的生成，这与相关报道结果相一致。
曾云先等文献报道，腹腔注射Que治疗组大鼠与正常组、模型组相比较，Que能显著降低DM大鼠血糖、血脂、胰岛素水平，但对正常组大鼠无显著影响，并且还发现疗程越久，其降糖效果越好。Gomes等以STZ诱导的糖尿病小鼠模型，经Que治疗4周发现其蛋白尿、尿酸减少和血糖的降低，减缓肾组织的毒性进展。其他相关研究也表明槲皮素能显著降低STZ所诱导的DM大鼠的血糖水平，具有降糖作用，其作用机制与抗氧化作用、清除自由基、抗纤维化等有关。DN诊断的金标准之一是24h尿微量白蛋白，减少尿微量白蛋白能够延缓DN的发生发展。本实验中发现LQ治疗后DM大鼠的血糖降低，而且BUN、Scr、24h尿微量白蛋白、KI等指标均得到改善，说明LQ复合体也能有效改善DM肾功能，达到减轻肾脏损害的作用，其作用机制可能与抑制蛋白激酶C（PKC）活性、醛糖还原酶活性、活性氧簇（ROS）等有关。
也有研究报道，槲皮素可降低线粒体中超氧化物的生成，同时通过稳定线粒体膜和清除已经生成的超氧化物，从而降低线粒体中超氧化物水平，可提高机体抗氧化能力、抑制TGF-β1的信号通路，来发挥其对肾功能的保护作用。Kim等在鼠肾小球细胞的观察中证实，由于Que结构不同，可通过激活不同的通路（PKA、PKC）来发挥其抗氧化活性，进而抑制TGF-β1引起的胶原蛋白的产生。槲皮素抗纤维化作用与其抗氧化活性密切相关。Kedziora等曾报道DM大鼠尿蛋白的排泄量与MDA的含量呈正相关关系。本实验中，在DM组大鼠中抗氧化酶SOD活性明显下降，而MDA含量明显升高，肾脏组织TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达升高，提示糖尿病状态下肾脏发生明显氧化应激，经槲皮素脂质体治疗后，DM大鼠肾脏SOD活性明显提高，MDA含量显著下降，肾脏组织TGF-β1蛋白及TGF-β1mRNA表达下降，表明槲皮素脂质体可保护DM大鼠的抗氧化活性、清除自由基、抑制脂质过氧化反应，减少TGF-β1蛋白及基因的表达，从而延缓DM大鼠肾脏病变的发生发展。此外，DM大鼠肾组织AGEs、RAGE mRNA 表达水平均有明显增高，与孙风娟等研究结果相似；而LQ各剂量组中表达显著下降，其中又以中剂量组下降最为明显，表明槲皮素脂质体也有可能通过抑制AGEs下调RAGE及其蛋白的表达以延缓DN的发生发展。
4. 结论
（1） 槲皮素脂质体能够在一定程度上减轻糖尿病肾病的形态病理学改变，改善STZ性DM大鼠的一般状况，有降血糖的作用；
（2） 槲皮素脂质体通过有效减少BUN、Scr、24h尿微量白蛋白、肾组织中AGEs，下调RAGE mRNA的表达，即通过抑制蛋白质非酶糖基化反应，干预糖尿病肾病的发生发展；
（3） 槲皮素脂质体通过减少MDA的含量，增加SOD的氧化活性等抗氧化指标，抑制炎性细胞因子的表达，从而减少肾组织TGF-β1蛋白及基因表达，对糖尿病大鼠肾病具有保护作用。
本实验为槲皮素脂质体的临床应用研究打下基础，同时也对探索DM的临床中药治疗提供新的思路和理论依据。