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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810429894.4 (22)申请日 2018.05.08 (71)申请人 张晓帆 地址 450007 河南省郑州市中原区桐柏路 239号 (72)发明人 张晓帆 王福芳 李树凯 李海波 常晟舸 李海涛 常学东 王浩林 刘冲 张俊英 (74)专利代理机构 郑州中民专利代理有限公司 41110 代理人 姜振东 (51)Int.Cl. A61K 38/17(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/42(。
2、2017.01) A61K 47/10(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61K 35/39(2015.01) A61K 33/00(2006.01) (54)发明名称 一种生物活性胰岛调糖宝制剂及制备方法 (57)摘要 本发明提供的是一种生物活性胰岛调糖宝 制剂及制备方法， 该制剂是以动物 （猪、 牛、 羊） 胰 岛活性细胞和胰脏蛋白多肽为主要原料， 加入药 用辅料组成， 其具体制备方法为： 从健康动物胰 脏中经过分离、 纯化、 扩增培养、 包被和超滤等一 系列集成化工艺制备高活性胰岛细胞包被液、 胰 蛋白多肽液，将二者按比例合。
3、并后加入稳定剂和 促吸收剂， 最终经冷冻干燥制成冻干燥粉， 也可 制成肠溶胶囊。 本发明通过生物学手段直接对机 体补充胰岛活性细胞和胰蛋白多肽， 使体外培养 的大量活性胰岛细胞、 蛋白多肽通过机体吸收 后， 在体内充分发挥生物学群体效应， 维持正常 糖代谢水平， 还可有效控制糖尿病并发症。 权利要求书2页 说明书5页 CN 108524915 A 2018.09.14 CN 108524915 A 1.一种生物活性胰岛调糖宝制剂， 其特征在于， 它是以动物胰脏提取的胰岛活性细胞 和胰脏蛋白多肽为主要原料， 加入药用辅料组成口服制剂， 具体组成为每1000 mL制剂中 含： 胰岛细胞包被液30-。
4、50%； 胰蛋白多肽液20-40%； 甘胆酸钠 3-5%； 血浆白蛋白 1-5%； 羧 甲基壳聚糖1-3%； 木糖醇 5-10%， 余量为醋酸盐缓冲液； 充分混合后调pH值为7.0-7.5。 2.根据权利要求1所述的生物活性胰岛调糖宝制剂， 其特征在于： 所述动物胰脏为猪、 牛、 羊的胰脏。 3.一种如权利要求1所述生物活性胰岛调糖宝制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： （1） 动物胰脏的处理 取新鲜或冷冻胰脏， 去除包膜、 血管、 结缔组织， 分离出胰岛组织放入4PBS溶液中浸 泡1-2h； 其余胰脏组织依次用绞肉机、 胶体磨制成胰浆， 加入胰浆体积2-3倍的86-88%的乙 醇。
5、和占胰浆重量5%的草酸， 在10-15条件下搅拌提取3h， 离心， 上层为胰蛋白多肽乙醇液， 下层沉淀为胰渣， 可作为提取胰酶的原料另做处理； （2） 胰岛细胞包被液的制备 胰岛细胞的分离及纯化 采用细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离， 将研磨浆放入4 Hanks液中， 过 500 m金属不绣钢网； 将收集的过滤物在4环境中， 用1500r/min离心5min， 收集细胞沉淀 物， 用常规葡聚糖不连续密度梯度离心法纯化， 将纯化细胞与RPMI-1640混匀， 取样镜检， 观 察胰岛细胞形态、 活性、 纯度、 数量、 成活率； 从分离到纯化结束应控制在5h左右； 胰岛细胞的扩增培养 在RPM。
6、I-1640培养液加入生长因子纤维连接蛋白， 每升培养基加入 5-10 mg， 于5%CO2培 养罐培养， 24 -48h换一次培养液， 检测细胞活性， 形态、 胰岛素释放量等； 使细胞总数达到 5-8105个， 活力95%以上； 胰岛细胞包被液的制备： 在培养合格的胰岛细胞液中添加钨酸钠溶液使该细胞液中的钨酸钠浓度为50 -500 mol/L， 添加占胰岛细胞液体积8-10%的聚乙二醇4000-8000， 制成胰岛细胞包被液； 这样既 保护了胰岛细胞， 同时也为胰岛细胞在体内充分发挥生物学效应创造良好的条件； （3） 胰蛋白多肽液的制备 将步骤 （1） 中胰脏处理后的蛋白多肽乙醇液在30-4。
7、0以下减压蒸去乙醇， 然后用生 理盐水稀释至蛋白含量2%左右， 调pH至7.5-8.0， 过滤， 收集过滤液； 将过滤液通过截留分子量1万的超滤装置， 截留液与 （1） 中胰渣合并用于提取胰酶； 收集透过液即为胰蛋白多肽液； （4） 生物活性胰岛调糖宝成品的制备： 按比例取各成分： A、 胰岛细胞包被液： 30-50% B、 胰蛋白多肽液：20-40% C、 血浆白蛋白： 1-5%； 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 108524915 A 2 D、 甘胆酸钠： 3-5%； E、 羧甲基壳聚糖： 1-3%； F、 木糖醇： 5-10%： 余量为醋酸盐缓冲液； 各组份充分混合后调pH值为。
8、7.0-7.5； 制备步骤： 先将A、 B、 C三种分别用生物膜过滤除菌然后混合得混合物1， 冷藏保存待用； 然后将D、 E、 F三种混合均匀， 用高温消毒法灭菌， 制成混合物2； 最后将混合物1和2 合并， 用灭菌醋酸 盐缓冲液稀释至1000 mL， 调pH值为7.0-7.5， 制成冷冻预混液； 将冷冻预混液放入冷冻干燥 机， 制成冷冻干燥粉， 在冷藏条件下密封保存待用； 按市场需求和规格要求， 制成冻干制剂或肠溶胶囊制剂， 即得成品。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 108524915 A 3 一种生物活性胰岛调糖宝制剂及制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物制备技术领域，。
9、 尤其涉及一种生物活性胰岛调糖宝制剂及制备方 法。 背景技术 0002 糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足， 导致血糖过高， 出现糖尿， 进而引起脂肪和 蛋白质代谢紊乱， 临床上可出现多尿、 烦渴、 多饮、 多食、 消瘦等表现， 糖尿病时长期存在的 高血糖， 导致各种组织， 特别是眼、 肾、 心脏、 血管、 神经的慢性损害、 功能障碍。 由于经济的 发展、 人们饮食结构的改变以及人口老龄化， 使糖尿病患者迅速增加， 糖尿病成为危害人类 健康的全球性疾病， 发病率为3-5%； 死亡率仅次于心血管病和肿瘤， 预测到2025年全世界糖 尿病患者将达到3亿人。 因为糖尿病具有病程长、 并发症多、 致残率。
10、高等原因， 给个人、 家庭 和国家带来极大的负担。 0003 糖尿病目前尚无治愈的有效方法， 控制患者血糖水平、 预防并发症的发生是治疗 糖尿病的关键措施。 通过直接注射胰岛素可明显降低血糖含量， 但长期注射胰岛素可使局 部皮肤红肿、 发痒、 硬结、 感染、 皮下脂肪萎缩或纤维化增生。 每天注射胰岛素不仅给患者带 来不便及痛苦， 更重要的是胰岛素的应用仅能控制高血糖， 无法预防其慢性并发症的发生。 目前临床上常用的口服降糖药具有一定的副作用， 可引起消化系统的不良反应， 有些还会 引起麻疹、 贫血、 白细胞和血小板减少症、 头晕乏力等症状。 因此寻找开发能有效地控制血 糖和糖尿病并发症且副作用。
11、低的新产品已引起人们的关注。 0004 胰岛素是由胰岛 细胞分泌的， 当体内各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减 退、 胰岛素抵抗， 或者胰岛 细胞受到细胞介导性， 使自身免疫性被破坏， 就会引起血中胰岛 素绝对或相对缺乏， 所以机体胰岛 细胞能不能正常分泌足量代谢所需的胰岛素是血糖恢 复健康水平的关键因素。 本发明另辟蹊径， 通过生物学手段直接对机体补充胰岛活性细胞 和胰蛋白多肽， 使体外培养的大量活性胰岛细胞通过机体吸收后， 在体内充分发挥生物学 效应， 释放胰岛素， 保护胰岛营养水平， 调节糖代谢， 有效地控制血糖生态平衡和糖尿病并 发症， 目前尚未发现有胰岛活性细胞调糖口服剂的使用、 。
12、销售及报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种生物活性高、 无副作用、 能规模化生产的生物活性胰 岛调糖宝口服制剂。 该制剂是从动物 （猪、 牛、 羊） 新鲜胰脏分离出的胰岛细胞， 应用无血清 培养技术进行大量扩增培养， 得到具有高活性和高纯度的动物胰岛细胞， 并按比例加入了 联产工艺中提取的胰脏蛋白多肽， 同时添加了稳定剂和促吸收剂， 使体外培养的胰岛细胞 能够保持高活性， 在体内能够被充分吸收， 发挥生物学群体效应， 释放胰岛素， 有效的调节 血糖水平。 同时提供其相应的便于规模化生产、 绿色环保的制备方法是本发明的另一个发 明目的。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案来。
13、实现的： 一种生物活性胰岛调糖宝制剂， 是 说 明 书 1/5 页 4 CN 108524915 A 4 以动物胰脏提取的胰岛活性细胞和胰脏蛋白多肽为主要原料， 加入药用辅料组成口服制 剂， 具体成分为每1000 mL制剂中含： 胰岛细胞包被液30-50%； 胰蛋白多肽液20%-40%； 甘胆 酸钠 3-5%； 血浆白蛋白 1-5%； 羧甲基壳聚糖1-3%； 木糖醇 5-10%， 余量为醋酸盐缓冲液， 各 组份充分混合后调pH值为7.0-7.5。 0007 所述动物胰脏为猪、 牛、 羊的胰脏。 0008 本发明的生物活性胰岛调糖宝制剂的制备方法， 包括以下步骤： （1） 动物胰脏的处理 取新鲜。
14、或冷冻胰脏， 去除包膜、 血管、 结缔组织， 分离出胰岛组织放入4 PBS溶液中浸 泡1-2 h； 其余胰脏组织依次用绞肉机、 胶体磨制成胰浆， 加入胰浆体积2-3倍的86-88%的乙 醇和占胰浆重量5%的草酸， 在10-15条件下搅拌提取3h， 离心， 上层为胰蛋白多肽乙醇液， 下层沉淀为胰渣， 可作为提取胰酶的原料另做处理； （2） 胰岛细胞包被液的制备 胰岛细胞的分离及纯化 采用细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离， 将研磨浆放入4 Hanks液中， 过 500 m金属不绣钢网； 将收集的过滤物在4环境中， 用1500r/min离心5min， 收集细胞沉淀 物， 用常规葡聚糖不连续密度。
15、梯度离心法纯化， 将纯化细胞与RPMI-1640混匀， 取样镜检， 观 察胰岛细胞形态、 活性、 纯度、 数量、 成活率； 从分离到纯化结束应控制在5h左右； 胰岛细胞的扩增培养 在RPMI-1640培养液加入生长因子纤维连接蛋白， 每升培养基加入 5-10 mg， 于5%的 CO2培养罐37 培养， 24-48 h换一次培养液， 检测细胞活性， 形态、 胰岛素释放量等； 使细 胞总数达到8105个， 活力95%以上； 胰岛细胞包被液的制备： 在培养合格的胰岛细胞液中添加钨酸钠溶液使该细胞液中的钨酸钠浓度为50 -500 mol/L， 添加占胰岛细胞液体积8-10%的聚乙二醇4000-8000。
16、， 制成胰岛细胞包被液； 这样既 保护了胰岛细胞， 同时也为胰岛细胞在体内充分发挥生物学效应创造良好的条件； （3） 胰蛋白多肽液的制备 将步骤 （1） 中胰脏处理后的蛋白多肽乙醇液在30-40以下减压蒸去乙醇， 然后用 生理盐水稀释至蛋白含量2%左右， 用NAOH调pH至7.5-8.0， 过滤， 收集过滤液。 0009将过滤液通过截留分子量1万的超滤装置截留液与 （1） 中胰渣合并用于提取胰 酶； 收集透过液即为胰蛋白多肽液； （4） 生物活性胰岛调糖宝成品的制备： 按比例取各成分 （1000 mL） ： A、 胰岛细胞包被液： 30-50% B、 胰蛋白多肽液： 20-40% C、 血清白。
17、蛋白： 1-5%； D、 甘胆酸钠： 3-5%； E、 羧甲基壳聚糖： 1-3%； F、 木糖醇： 5-10%： 说 明 书 2/5 页 5 CN 108524915 A 5 余量为醋酸盐缓冲液； 各组份充分混合后调pH值为7.0-7.5； 制备步骤： 先将A、 B、 C三种分别用生物膜过滤除菌然后混合得混合物1， 冷藏保存待用； 然后将D、 E、 F三种混合均匀， 用高温消毒法灭菌， 制成混合物2； 最后将混合物1和2 合并， 用灭菌醋酸 盐缓冲液稀释至1000 mL， 制成冷冻预混液； 将冷冻预混液放入冷冻干燥机， 制成冷冻干燥 粉， 在冷藏条件下密封保存待用； 按市场需求和规格要求， 制。
18、成冻干制剂或肠溶胶囊制剂， 即得成品。 0010 本发明产品中加入从胰脏中提取的蛋白多肽， 不但可为胰岛细胞提供良好的营养 环境， 维持胰岛细胞的活性， 还可以为机体补充蛋白、 多肽， 激活免疫系统， 增强人体免疫能 力， 促进和维持细胞正常的新陈代谢， 调节脂代谢， 抗动脉硬化， 改善微循环； 调节体内糖代 谢紊乱， 改善胰岛功能， 解除细胞对胰岛的抵抗， 改善三多一少、 浮肿等症状， 有效控制并发 症。 0011 本发明产品中加入的甘胆酸钠可促进机体对多种给药途径如鼻腔、 直肠、 小肠、 大 肠、 口颊、 舌下及口服胰岛素的吸收， 常作为胰岛素的促吸收剂， 对血糖降低具有明显的帮 助效果；。
19、 羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物， 具有高分子天然材料属性， 抗菌性强， 是一种两性聚电解质， 稳定性强， 在医药中常作为稳定剂； 血清白蛋白合成于肝脏， 是脊椎 动物血浆中含量最丰富的蛋白质， 羧甲基壳聚糖和血清白蛋白相溶可形成载血清白蛋白壳 聚糖微球， 具有明显的球状结构， 可提高蛋白药物的稳定性， 控制其释放速度， 延长药物作 用时间,提高药物生物利用度。 在制备胰岛细胞包被液中加入的钨酸钠是一种微量元素， 近 年来研究发现钨酸钠具有很强的降糖作用， 而且钨酸钠毒性低， 生物利用度高， 具有促进细 胞有丝分裂的作用， 促进胰岛细胞的增值分化， 并能增强胰岛细胞的功能， 增加胰岛素的。
20、分 泌。 包被液中加入的辅料聚乙二醇4000-8000对人体无毒、 无刺激性、 具有优良的水溶性、 相 溶性、 粘接性和热稳定性， 它常作为细胞、 蛋白质和多肽的保护剂， 可避免蛋白质、 细胞和酶 等活性物质的失活， 还能促进机体对有效成分的吸收， 提高其生物利用度。 本发明产品中加 入了木糖醇， 可有效改善口服剂的口感， 使产品适口性好， 食用木糖醇后血糖值不会上升， 这将会大大提高该产品的食用舒适性， 且木糖醇生物稳定性好， 还会起到防龋齿的作用。 0012 与现有技术相比， 本发明专利的创新点有： （1） 本发明另辟蹊径， 通过生物学手段直接对机体补充胰岛活性细胞， 使体外培养的大 量活。
21、性胰岛细胞通过机体吸收后， 在体内充分发挥生物学群体效应， 释放胰岛素， 进而降低 血糖水平， 可有效地控制血糖和糖尿病并发症。 0013 （2） 本发明产品中加入从胰脏中提取的蛋白和多肽， 不但可为胰岛细胞提供良好 的营养环境， 维持胰岛细胞的活性， 还可以为机体补充蛋白、 多肽， 激活免疫系统， 增强人体 免疫能力， 调节体内糖代谢紊乱， 有效控制并发症。 实属生物资源有效综合利用的创新。 0014 （3） 本发明采用联产工艺， 生产过程中无废弃物排放， 绿色环保。 既从动物胰脏中 分离胰岛细胞， 应用无血清培养技术， 扩增大量具有活性和高纯度动物胰岛细胞， 制成胰岛 细胞包被液； 这样既。
22、保护了胰岛细胞， 同时也为胰岛细胞在体内充分发挥生物学效应创造 良好的条件。 同时从胰脏中提取胰脏蛋白多肽作为降糖剂配料， 而截留分子量一万以上的 胰蛋白液与胰渣合并则可作为提取胰酶的原料， 生产副产品。 所以该发明具有良好的经济 说 明 书 3/5 页 6 CN 108524915 A 6 效益和社会效益。 0015 （4） 本发明产品通过科学配伍， 各种成分协同发挥作用， 保证胰岛细胞具有高度活 性。 加入的辅料有的可提高药物的稳定性， 控制其释放速度， 延长药物作用时间， 提高药物 生物利用度； 有的可促进胰岛细胞的增值分化， 并能增强胰岛细胞的功能， 增加胰岛素的分 泌； 有的可避免蛋。
23、白质、 细胞和酶等活性物质的失活， 还能促进机体对有效成分的吸收， 提 高其生物利用度； 有的可有效改善降糖口服剂的口感， 使产品适口性好， 大大提高该药物的 食用舒适性。 （5） 本发明制备的口服调糖剂属纯天然产品。 长期服用无副作用， 无不良反应， 可补充 口服化学降糖剂的的不足与缺陷。 0016 （6） 本发名产品主原材料来源广， 充分利用了绿色资源， 纯天然、 无刺激性， 无化学 残留， 安全有效且价格低廉， ， 为患者减轻经济负担， 也容易为市场和患者所接受， 具有广阔 的市场前景。 具体实施方式 0017 下面结合具体实施例， 对本发明作进一步的说明。 0018 实施例1 一种生物。
24、活性胰岛调糖宝制剂， 是以动物胰脏提取的胰岛活性细胞和胰脏蛋白多肽为 主要原料， 加入药用辅料而制成， 具体成分为每1000 mL制剂中含： 胰岛细胞包被液： 40%； 胰蛋白多肽液35%； 甘胆酸钠： 3%； 血浆白蛋白： 3%； 羧甲基壳聚 糖： 2%； 木糖醇： 10%， 余量为醋酸盐缓冲液； 充分混合后调pH值为7.5。 0019 其具体制备方法为： 1、 动物胰脏 （猪、 牛、 羊） 的处理工艺 取新鲜或冷冻胰脏， 去除包膜、 血管、 结缔组织， 分离出胰岛组织放入4 PBS溶液中浸 泡2h。 其余胰脏组织 （包膜、 血管、 结缔组织等） 依次用绞肉机、 胶体磨制成胰浆， 加入胰浆体。
25、 积3倍的88%的乙醇和占胰浆重量5%的草酸， 在15条件下搅拌提取3h， 离心， 上层为胰蛋白 多肽乙醇液， 下层沉淀为胰渣可作为提取胰酶的原料待用。 0020 2、 胰岛细胞包被液的制备 （1） 胰岛细胞的分离及纯化 采用细胞球珠研磨仪使胰岛与其它胰腺部分脱离， 将研磨浆放入4 Hanks液中， 过 500 m金属不绣钢网； 将收集的过滤物在4环境中， 用1500 r/min离心5 min， 收集细胞沉 淀物， 用常规葡聚糖不连续密度梯度离心法纯化， 将纯化细胞与RPMI-1640混匀， 取样镜检， 观察胰岛细胞形态、 活性、 纯度、 数量、 成活率； 从分离到纯化结束应控制在5h左右。 。
26、0021 （2） 胰岛细胞的扩增培养 应用无血清培养技术， 扩增大量具有活性和高纯度动物胰岛细胞。 0022 （即RPMI-1640培养液加入生长因子纤维连接蛋白， 每升培养基加入 10mg， 于5%的 CO2培养罐37 培养， 24h换一次培养液，（检测细胞活性， 形态、 胰岛素释放量等） 。 0023 （3） 在培养合格的胰岛细胞液中添加钨酸钠溶液使该细胞液中的钨酸钠浓度为 300 mol/L， 添加占胰岛细胞液体积10%的聚乙二醇6000， 制成胰岛细胞包被液。 0024 3、 胰蛋白多肽提取液的制备 说 明 书 4/5 页 7 CN 108524915 A 7 （1） 将胰脏处理后的胰。
27、蛋白多肽乙醇液， 减压35条件下蒸馏除乙醇， 再用生理盐水稀 释至蛋白含量3%， 调pH至8.0， 过滤， 收集过滤液。 0025 （2） 将过滤液通过截留分子量1万的超滤装置， 截留液与胰渣合并用于提取胰酶。 收集透过液即为小分子胰蛋白多肽液。 0026 4、 成品的制备 （在万级净化条件下） 以配1000mL为例 A、 胰岛细胞包被液： 40% B、 胰蛋白多肽液： 35% C、 血浆白蛋白： 3%； D、 甘胆酸钠： 3%； E、 羧甲基壳聚糖； 2%； F、 木糖醇： 10%： 余量为醋酸盐缓冲液； 各组份充分混合后调pH值为7.2。 0027 2） 制备步骤： 先将A、 B、 C三种。
28、分别用生物膜过滤除菌然后混合得混合物1， 冷藏保存待用； 然后将D、 E、 F三种混合均匀， 用高温消毒： 180灭菌2h， 制成混合物2； 最后将混合物1和2 合并， 用灭菌醋酸盐缓冲液稀释至1000mL， 制成冷冻予混液。 将冷 冻预混液放入冷冻干燥机， 制成冷冻干燥粉， 在冷藏条件下密封保存待用。 0028 实施例2 一种生物活性胰岛调糖宝制剂， 是以动物胰脏提取的胰岛活性细胞和胰脏蛋白多肽为 主要原料， 加入药用辅料而制成， 具体成分为每1000 mL制剂中含： 胰岛细胞包被液： 50%； 胰蛋白多肽液25%； 甘胆酸钠： 5%； 血浆白蛋白： 2%； 羧甲基壳聚 糖： 1%； 木糖醇： 6%， 余量为醋酸盐缓冲液； 充分混合后调pH值为7.5。 0029 其具体制备方法同实施例1。 说 明 书 5/5 页 8 CN 108524915 A 8 。