(一)技术领域：
本发明涉及荔枝核黄酮类、多酚类化合物的应用，具体地说是荔枝核黄酮 类多酚类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用。
(二)背景技术：
流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道传染病，以发病率高、流 行广泛、传播迅速为主要特点。目前临床使用的抗流感病毒药物不少，但多数 毒性较大，易损害宿主细胞和易导致耐药毒株出现。当前以病毒唑的治疗效果 最佳，但也有一定的副作用，少数病人口服或静注时有口干，软便或稀便，白 细胞减少等症状，动物实验有致癌作用，故妊娠初期三月内禁用。
(三)发明内容：
本发明的目的是要公开毒副作用低的荔枝核提取物——荔枝核黄酮类多酚 类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用。
本发明是将荔枝核黄酮类、多酚类化合物应用于防治流感病毒感染性疾病。
所述的荔枝核黄酮类多酚类化合物在防治流感病毒感染性疾病上的应用， 是将荔枝核黄酮类、多酚类化合物制成药剂学上的任何剂型应用于防治流感病 毒感染性疾病。
将荔枝核黄酮类、多酚类化合物制成荔枝核注射液，荔枝核黄酮类多酚类 总含量为100mg/ml，每支2.0ml，临床用于防治流感病毒引起的疾病，用法： 每次2.0ml、肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天2次，5天一个疗程。
也可将荔枝核黄酮类、多酚类化合物制成荔枝核片片剂，荔枝核黄酮类多 酚类总含量100mg/0.3g/片，临床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次2-4 片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。
本发明用荔枝核黄酮类、多酚类化合物抗流感病毒是用不同浓度的荔枝核 黄酮类、多酚类化合物分别作用于MDCK细胞和接种在MDCK细胞上的流感病毒， 以病毒唑为对照药，观察荔枝核黄酮类、多酚类化合物对MDCK细胞的毒性作用 和对流感病毒抑制作用的情况，其药物抗MDCK细胞的半数毒性浓度TC50为 347.3μg/ml，对照为351.3μg/ml，抗流感病毒的半数有效浓度IC50为63.2μg/ml， 对照为62.7μg/ml，治疗指数为5.5，对照为5.6。应用结果证实荔枝核黄酮类、 多酚类化合物对流感病毒有明显的抑制作用，且存在明显的量效关系，随药物 浓度增加，其抗病毒活性增强，抑制率升高，经直线回归分析，P＜0.05，与病 毒唑无明显差异，荔枝核黄酮类、多酚类化合物浓度在160μg/ml以上时，对流 感病毒引起的细胞病变的抑制率可达50％以上。
发明应用的具体步骤是：
1、所用的药物为荔枝核黄酮类(Flavonoids)、多酚类化合物(Polyphenol)， 病毒为流感病毒鼠适应株，细胞为MDCK细胞；
2、用细胞培养技术培养MDCK细胞，用胰酶将生长良好的MDCK细胞分散成 单个细胞悬液，按1×105/ml浓度分种于40孔板，每孔0.1ml。置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后备用；
3、观察药物对MDCK细胞的毒性作用
根据Mosmnna建立的四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对MDCK细胞的毒 性作用。
在培养好长成单层的细胞孔板上，换含不同浓度的含大黄蒽醌类化合物药 液，每种浓度重复4孔，并设正常细胞对照。继续培养48h后，弃培养液上清， 每孔加含5mg/mlMTT的不含血清的MEM培养基50μl，置CO2培养箱中继续培养 2～3h后，弃MTT上清，PBS洗3次，每孔加溶解液(DMSO∶乙醇体积比为1∶1) 100μl，振荡5～10分钟，待结晶完全溶解，置96孔酶标测定仪上，测定570nm 波长处的光密度OD值，并根据下式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无 毒浓度范围。
细胞存活率(％)＝(实验孔OD值/对照孔OD值)×100％
药物对MDCK细胞的毒性作用表现为：细胞粘连、皱缩、脱落并且吸光值明 显下降，吸光度OD值在0.10以下。将不同浓度的药物作用于细胞，结果见表1：
表1荔枝核黄酮类(Flavonoids)多酚类(Polyphenol)化合物对MDCK细胞的毒性作用 药物 compounds 不同药物浓度(μg/ml/ml)时的细胞存活率(％) The survival rate of cell(％) at various concentrations(μg/ml) of the compounds 50％毒性 浓度TC50 10 20 40 80 160 320 640 800 1600 Flavonoids & Polyphenol Ribavirin 100.0 100.0 86.2 86.6 70.3 71.3 60.5 62.5 42.3 46.5 32.5 31.2 28.4 26.5 15.3 14.2 8.6 8.5 347.3 351.3
4、观察药物对流感病毒增殖的抑制作用：
于已长成单层MDCK细胞的40孔板上，每孔接种50μl 100TCID50的流感病 毒液，于35℃吸附90min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在药物无 毒浓度范围内，加入不同浓度的含药维持液每孔0.2ml，然后将流感病毒培养板 置35℃、5％CO2培养，每日观察CPE。隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常 细胞对照组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和中药样品组。
CPE记录方法为：一为无CPE，+为25％细胞出现CPE；++为50％细胞出现CPE； +++为75％细胞出现CPE：++++为100％细胞出现CPE。约在病毒对照+++～++++时 弃培养液上清，每孔加入含5mg/ml MTT的培养液50μl，继续培养2～3h后洗去 MTT上清，加DMSO溶解液每孔100μl，混匀，5～10分钟后，用酶标仪测570nm 波长处的光密度OD值。并按下述公式计算药物对流感病毒抑制率(Inhibitive rate)。
流感病毒对MDCK细胞CPE表现为细胞皱缩，变园、壁厚、脱落、拆光性增 强，在无毒浓度范围内，将药物以不同的浓度进行抑制流感病毒实验，其病毒 抑制率见表2。
表2荔枝核黄类(Flavonoids)多酚类(Polyphenol)化合物的抗流感病毒作用 药物 compounds 不同药物浓度(μg/ml)时的病毒抑制率(％) The inhibitory rate of influenza virus(％)at various concentrations μg/ml)of the compounds 50％有效 浓度IC50 治疗指数 TI 5 10 20 40 80 160 Flavonoids & Polyphenol Ribavirin 4.3 4.5 10.2 10.5 25.5 26.2 40.1 40.0 52.5 53.3 100.0 100.0 63.2 62.7 5.5 5.6
5、结合细胞毒性实验结果，用统计软件SPSS10.0的probit回归法计算药 物对MDCK细胞的半数毒性浓度TC50为347.3μg/ml，对照为351.3μg/ml，抗流感 病毒的半数有效浓度IC50为63.2μg/ml，对照为62.7μg/ml，药物的治疗指数TI 为5.5，对照为5.6，证明荔枝核黄酮类、多酚类化合物在MDCK细胞中对流感 病毒有抑制作用。
荔枝核黄酮类、多酚类化合物是从荔枝核中提取分离得到的，荔枝核本属 废弃物，为废物再利用，来源广，加工提取工艺成熟，荔枝核黄酮类、多酚类抗 流感病毒作用强，与病毒唑无明显差异，而对人体的毒副作用小，可以制成针剂， 片剂等多种剂型，应用到流感病感染性疾病的防治上，应用前景非常广阔。
(四)具体实施例：
实施例1：将荔枝核黄酮类、多酚类化合物制成针剂荔枝核注射液，荔枝核 黄酮类多酚类总含量100mg/ml，每支2.0ml，临床用于防治流感病毒引起的疾 病，用法：每次2.0ml、肌肉注射、静脉注射或静脉点滴，每天2次，5天一个 疗程。
实施例2：将荔枝核黄酮类、多酚类化合物制成荔枝核片片剂，荔枝核黄酮 类多酚类总含量100mg/0.3g/片，临床用于防治流感病毒引起的疾病。用法每次 2-4片，口服，每天2-3次，7天为一疗程。