《一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系的制备方法及应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系的制备方法及应用.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710962069.6 (22)申请日 2017.10.16 (71)申请人 郑州大学 地址 450001 河南省郑州市高新技术开发 区科学大道100号 (72)发明人 张慧娟 张振中 张晓戈 陈俭娇 张红岭 (74)专利代理机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 代理人 胡雨薇 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 41/00(2006.01) A。
2、61P 35/00(2006.01) A61K 49/22(2006.01) A61K 49/18(2006.01) A61K 49/12(2006.01) (54)发明名称 一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁 士蓝纳米粒载药体系的制备方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种中空介孔门控型透明质酸 修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系制备方法及应 用， 可有效解决肿瘤的治疗用药问题， 解决的技 术方案是， 透明质酸与普鲁士蓝纳米粒通过化学 键连接， 在水介质中形成纳米层， 光敏剂吲哚箐 绿通过物理作用进入普鲁士蓝的介孔结构内； 本 发明制备方法简单， 材料易得， 制备的载药体系 可使TAM表型由辅助。
3、肿瘤恶性转化的M2型转化为 具有肿瘤杀伤抑制功能的M1型， 高效补充激光诱 导ICG产生活性氧所需的氧气， 增强自产氧光动 力学治疗效果； 载体具有门控释药及主动靶向功 能； 肿瘤部位生成的HPBs可进行核磁共振成像和 光声成像， 实现肿瘤的诊疗一体化。 权利要求书3页 说明书7页 CN 107496377 A 2017.12.22 CN 107496377 A 1.一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系的制备方法， 其特征 在于， 透明质酸与普鲁士蓝纳米粒通过化学键连接， 在水介质中形成纳米层， 光敏剂吲哚箐 绿通过物理作用进入普鲁士蓝的介孔结构内； 其制备方法包括以下步骤：。
4、 （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将1-50g聚乙烯吡咯烷酮K30和10-200mg 铁氰化钾溶 于30-50ml质量浓度0.01-0.1M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 70-90反应20-30h， 10000-14000rpm离心8-12min， 蒸馏水洗涤2-3次， 70-90下烘干， 得普鲁士蓝纳米粒， 将 0.1-10mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于0.5-1.5ml质量浓度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下， 再加 入0.1-10mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌2-3h， 130-150下反应3-5h， 10000-14000rpm离心 8-12min， 蒸馏水洗涤2-3次， 冷冻。
5、干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取1-5mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入5- 20ml超纯水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入0.1-5mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌20-30h， 透 析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取10-100mg的聚醚酰亚胺修饰的 介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入40-60ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁 士蓝纳米粒溶液； 分别将300-400mg N-羟基琥珀酰亚胺、 180-250mg 1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入3-5ml甲酰胺溶解， 再加入到聚。
6、醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士 蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应8-12h； 取10-100mg的透明质酸， 加入8-12ml甲酰胺溶解， 再加入150-200 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温 搅拌反应20-30h， 加入反应液3-4倍体积量的预冷的丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油 滤， 用丙酮洗涤3-5遍， 再用3-4ml超纯水溶解， 放入截留分子量MWCO=3kDa的透析袋中透析 2-3天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将5-20mg透明质酸修饰 的普鲁士蓝。
7、纳米粒作为载体， 加入到2-40ml去离子水中， 探头超声溶解， 与1-5ml质量浓度 2mg/ml的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理25-35min， 室温搅拌后放入截留分子量 MWCO=3kDa的透析袋中透析2-3天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士 蓝纳米粒载药体系。 2.根据权利要求1所述的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系， 其特征在于， 其制备方法包括以下步骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将1g聚乙烯吡咯烷酮K30和10mg 铁氰化钾溶于30ml 质量浓度0.01M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 70反应30h， 10000rp。
8、m离心12min， 蒸馏 水洗涤2次， 70下烘干， 即得普鲁士蓝纳米粒， 将0.1mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于0.5ml质量浓 度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再加入0.1mg聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌2h， 130下反应 5h， 10000rpm离心12min， 蒸馏水洗涤2次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取1mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入5ml超纯 水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入0.1mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌20h， 透析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取10mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米。
9、 粒， 加入40ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分别 将300mg N-羟基琥珀酰亚胺、 180mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入 3ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应 权 利 要 求 书 1/3 页 2 CN 107496377 A 2 12h； 取10mg的透明质酸， 加入8ml甲酰胺溶解， 再加入150 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚胺 修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应20h， 加入反应液3倍体积量的预冷的丙 酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜。
10、油滤， 丙酮洗涤3遍， 再用3ml超纯水溶解， 放入截留分子量 MWCO=3kDa的透析袋中透析2天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将5mg透明质酸修饰的普 鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到2ml去离子水中， 探头超声溶解， 与1ml质量浓度2mg/ml的光 敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理25min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的透析 袋中透析2天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系。 3.根据权利要求1所述的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系。
11、， 其特征在于， 其制备方法包括以下步骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将30g聚乙烯吡咯烷酮K30和132mg 铁氰化钾溶于 40ml质量浓度0.05M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 80反应24h， 12000rpm离心10min， 蒸馏水洗涤3次， 80下烘干， 得普鲁士蓝纳米粒， 将1.0mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于1.0ml质量 浓度为1.0M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再加入5mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌3h， 140下 反应4h， 12000rpm离心10min， 蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取3。
12、mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入10ml超 纯水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入3mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌24h， 透析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取45mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米 粒， 加入50ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分别 将346mg N-羟基琥珀酰亚胺、 206mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入 4ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应 10h； 取50mg的透明质酸， 加入10ml甲酰胺溶解， 再加入180 l三乙。
13、胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚 胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应24h， 加入反应液4倍体积量的预冷的 丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油滤， 丙酮洗涤4遍， 再用3ml超纯水溶解， 放入截留分子 量MWCO=3kDa的透析袋中透析2天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将10mg透明质酸修饰的 普鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到10ml去离子水中， 探头超声溶解， 与3ml质量浓度2mg/ml 的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理30min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的 透。
14、析袋中透析2天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系。 4.根据权利要求1所述的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系， 其特征在于， 其制备方法包括以下步骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将50g聚乙烯吡咯烷酮K30和200mg 铁氰化钾溶于 50ml质量浓度0.1M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 90反应20h， 14000rpm离心8min， 蒸 馏水洗涤3次， 90下烘干， 即得普鲁士蓝纳米粒， 将10mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于1.5ml质量 浓度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再加入10mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌3h， 。
15、150下反 应3h， 14000rpm离心8min， 蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取5mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入20ml超 纯水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入5mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌30h， 透析， 冷冻干燥， 权 利 要 求 书 2/3 页 3 CN 107496377 A 3 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取100mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳 米粒， 加入60ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分 别将400mg N-羟基琥珀酰亚胺、 250mg 。
16、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加 入5ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反 应12h； 取100mg的透明质酸， 加入12ml甲酰胺溶解， 再加入200 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰 亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应30h， 加入反应液4倍体积量的预冷 的丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油滤， 丙酮洗涤5遍， 再用4ml超纯水溶解， 放入截留分 子量MWCO=3kDa的透析袋中透析3天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合。
17、成： 将20mg透明质酸修饰的 普鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到40ml去离子水中， 探头超声溶解， 与5ml质量浓度2mg/ml 的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理35min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的 透析袋中透析3天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系。 5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝 纳米粒载药体系的粒径为150-300 nm。 6.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝 纳米粒载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。 7.权利要求1或2-4任一项所。
18、述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝 纳米粒载药体系在制备核磁成像剂和光声成像剂中的应用。 权 利 要 求 书 3/3 页 4 CN 107496377 A 4 一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 特别是一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米 粒载药体系的制备方法及应用。 背景技术 0002 肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 是指肿瘤组织中侵润的巨噬细胞， 它是肿瘤微环境中的 重要组成部分。 在不同的肿瘤微环境信号调节下， TAM能够被极化形成具有促炎、 抗肿瘤活 性的M1型巨噬细胞或者形成具有抗炎、。
19、 肿瘤免疫抑制作用的M2型巨噬细胞。 而TAM的不同亚 型对抗肿瘤治疗方法的影响不同： M1型可增强一些抗肿瘤疗法的治疗效果， M2型巨噬细胞 可抑制一些抗肿瘤疗法的治疗效果。 TAM在恶性肿瘤中通常呈现M2型极化状态。 因此， 调控 巨噬细胞极化方向， 使M2型巨噬细胞逆转为具有抑制肿瘤生长和抗原递呈作用的M1型巨噬 细胞， 对于抑制肿瘤的侵袭与转移、 改善肿瘤患者预后具有重要意义。 0003 光动力学疗法 （PDT） 是一种联合利用光敏剂、 光和氧分子， 通过光动力学反应选择 性地治疗疾病的新型疗法， 因其治疗效果明显、 毒性小、 对人体副作用小等优点越来越受关 注， 开发具有制备简单、 。
20、成本低、 结构稳定、 生物安全性可靠并且具有一定肿瘤靶向性的新 型光热转换剂纳米材料已近成为国内外学者的研究热点。 0004 普鲁士蓝 （PB） 是一种历史悠久的染料， 具有优良的光物理、 电光学以及磁性等性 能， 已经在许多领域得到了广泛的应用， 如核磁共振造影剂、 光声成像造影剂以及光热治疗 等。 普鲁士蓝制备过程简单， 反应条件温和， 成本低， 表面容易修饰， 化学结构稳定， 更是一 种治疗放射性中毒的临床用药， 已得到FDA的认证。 0005 透明质酸 （HA） 分子是人体内必不可少的一种多聚糖， 不同分子量的HA作用不同， 其中低分子量HA作为免疫激活剂， 具有极好的生物相容性和肿瘤。
21、靶向性， 能引起M2型巨噬 细胞转化为M1巨噬细胞。 此外， 经HA修饰的纳米粒不仅可以改善其亲水性和稳定性， 延长血 液循环时间， 达到持续缓释释药的目的， 并能提高纳米粒的肿瘤主动靶向性， 降低其对正常 细胞的毒副作用， 从而实现癌症的靶向治疗。 0006 吲哚箐绿 （ICG） ， 一种在近红外波长区域有高吸收性、 荧光性以及高效反应性的功 能性染料， 已经被广泛作为探针用于诊断和治疗应用中， 可通过其光敏化特性产生单价态 氧离子来摧毁癌细胞通道， 从而可以用于光动力学治疗。 ICG不仅作为荧光成像的示踪剂， 也可在近红外光下产生热和活性氧， 进行光热和光动力学治疗。 0007 肿瘤微环境。
22、具有低氧、 高压、 酸性等特点， 低氧是众多恶性肿瘤发生发展过程中所 必然经历的微环境条件之一， 低氧作为实体瘤普遍存在的一个重要微环境已经被证实在 TAM的浸润中发挥着重要作用。 巨噬细胞趋向于浸润到肿瘤低氧区域。 发明内容 0008 针对上述情况， 为克服现有技术之缺陷， 本发明之目的就是提供一种中空介孔门 说 明 书 1/7 页 5 CN 107496377 A 5 控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系制备方法及应用， 可有效解决肿瘤的治疗用 药问题。 0009 解决的技术方案是， 一种中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系， 透明质酸与普鲁士蓝纳米粒通过化学键连接， 。
23、在水介质中形成纳米层， 光敏剂吲哚箐绿 通过物理作用进入普鲁士蓝的介孔结构内； 其制备包括以下步骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将1-50g聚乙烯吡咯烷酮K30和10-200mg 铁氰化钾溶 于30-50ml质量浓度0.01-0.1M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 70-90反应20-30h， 10000-14000rpm离心8-12min， 蒸馏水洗涤2-3次， 70-90下烘干， 得普鲁士蓝纳米粒， 将 0.1-10mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于0.5-1.5ml质量浓度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下， 再加 入0.1-10mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌2-3h， 130-1。
24、50下反应3-5h， 10000-14000rpm离心 8-12min， 蒸馏水洗涤2-3次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取1-5mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入5- 20ml超纯水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入0.1-5mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌20-30h， 透 析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取10-100mg的聚醚酰亚胺修饰的 介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入40-60ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁 士蓝纳米粒溶液； 分别将300-400mg N-羟基琥珀酰亚胺、 180-250。
25、mg 1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入3-5ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士 蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应8-12h； 取10-100mg的透明质酸， 加入8-12ml甲酰胺溶解， 再加入150-200 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温 搅拌反应20-30h， 加入反应液3-4倍体积量的预冷的丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油 滤， 用丙酮洗涤3-5遍， 再用3-4ml超纯水溶解， 放入截留分子量MWCO=3kDa的透析袋中透析 2-3天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒；。
26、 （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将5-20mg透明质酸修饰 的普鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到2-40ml去离子水中， 探头超声溶解， 与1-5ml质量浓度 2mg/ml的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理25-35min， 室温搅拌后放入截留分子量 MWCO=3kDa的透析袋中透析2-3天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士 蓝纳米粒载药体系。 0010 所述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系的粒 径为150-300 nm。 0011 所述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系在制 备抗肿瘤药物。
27、中的应用。 0012 所述方法制备的中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系在制 备核磁成像剂和光声成像剂中的应用。 0013 本发明制备方法简单， 材料易得， 制备的载药体系可使TAM表型由辅助肿瘤恶性转 化的M2型转化为具有肿瘤杀伤抑制功能的M1型， 并产生大量的H2O2， 在肿瘤乏氧环境中与有 过氧化氢酶活性的HPBs反应释放出大量O2， 缓解肿瘤乏氧状态的同时， 中和H+改善了肿瘤的 酸性环境， 高效补充激光诱导ICG产生活性氧所需的氧气， 增强了自产氧光动力学治疗效 果； 载体具有门控释药及主动靶向功能； 肿瘤部位生成的HPBs可进行核磁共振成像和光声 说 明 书 2/7 。
28、页 6 CN 107496377 A 6 成像， 实现肿瘤的诊疗一体化。 具体实施方式 0014 以下结合实施例对本发明具体实施方式作进一步详细说明。 0015 实施例1 中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系， 其制备方法包括以下步 骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将1g聚乙烯吡咯烷酮K30和10mg 铁氰化钾溶于30ml 质量浓度0.01M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 70反应30h， 10000rpm离心12min， 蒸馏 水洗涤2次， 70下烘干， 即得普鲁士蓝纳米粒， 将0.1mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于0.5ml质量浓 度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再。
29、加入0.1mg聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌2h， 130下反应 5h， 10000rpm离心12min， 蒸馏水洗涤2次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取1mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入5ml超纯 水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入0.1mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌20h， 透析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取10mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米 粒， 加入40ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分别 将300mg N-羟基琥珀酰亚胺、 180mg 1-(3-二甲氨基丙。
30、基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入 3ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应 12h； 取10mg的透明质酸， 加入8ml甲酰胺溶解， 再加入150 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚胺 修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应20h， 加入反应液3倍体积量的预冷的丙 酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油滤， 丙酮洗涤3遍， 再用3ml超纯水溶解， 放入截留分子量 MWCO=3kDa的透析袋中透析2天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将5mg透明质酸修。
31、饰的普 鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到2ml去离子水中， 探头超声溶解， 与1ml质量浓度2mg/ml的光 敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理25min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的透析 袋中透析2天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系。 0016 实施例2 中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系， 其制备方法包括以下步 骤： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将30g聚乙烯吡咯烷酮K30和132mg 铁氰化钾溶于 40ml质量浓度0.05M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 80反应24h， 12000rpm离心10min， 。
32、蒸馏水洗涤3次， 80下烘干， 得普鲁士蓝纳米粒， 将1.0mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于1.0ml质量 浓度为1.0M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再加入5mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌3h， 140下 反应4h， 12000rpm离心10min， 蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取3mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入10ml超 纯水， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入3mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌24h， 透析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取45mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米 粒， 加入50ml甲酰。
33、胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分别 将346mg N-羟基琥珀酰亚胺、 206mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加入 说 明 书 3/7 页 7 CN 107496377 A 7 4ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反应 10h； 取50mg的透明质酸， 加入10ml甲酰胺溶解， 再加入180 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰亚 胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应24h， 加入反应液4倍体积量的预冷的 丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油滤， 丙酮洗涤4遍， 再用3。
34、ml超纯水溶解， 放入截留分子 量MWCO=3kDa的透析袋中透析2天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将10mg透明质酸修饰的 普鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到10ml去离子水中， 探头超声溶解， 与3ml质量浓度2mg/ml 的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理30min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的 透析袋中透析2天， 冷冻干燥制， 得中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系。 0017 实施例3 中空介孔门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体系， 其制备方法包括以下步 骤。
35、： （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒的合成： 将50g聚乙烯吡咯烷酮K30和200mg 铁氰化钾溶于 50ml质量浓度0.1M的盐酸中， 磁力搅拌成透明溶液后， 90反应20h， 14000rpm离心8min， 蒸 馏水洗涤3次， 90下烘干， 即得普鲁士蓝纳米粒， 将10mg普鲁士蓝纳米粒， 溶于1.5ml质量 浓度为1M的盐酸溶液中， 磁力搅拌下再加入10mg 聚乙烯吡咯烷酮， 磁力搅拌3h， 150下反 应3h， 14000rpm离心8min， 蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥， 得介孔普鲁士蓝纳米粒； （2） 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 取5mg介孔普鲁士蓝纳米粒， 加入20ml超 纯水。
36、， 探超使其分散均匀， 磁力搅拌下加入5mg聚醚酰亚胺， 继续搅拌30h， 透析， 冷冻干燥， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒； 取100mg的聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳 米粒， 加入60ml甲酰胺， 超声振荡溶解， 得聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液； 分 别将400mg N-羟基琥珀酰亚胺、 250mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二甲胺盐酸盐， 各加 入5ml甲酰胺溶解， 再加入到聚醚酰亚胺修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒溶液中， 搅拌， 室温反 应12h； 取100mg的透明质酸， 加入12ml甲酰胺溶解， 再加入200 l三乙胺， 缓慢滴加至聚醚酰 亚胺修饰的介孔普鲁。
37、士蓝纳米粒溶液中， 室温搅拌反应30h， 加入反应液4倍体积量的预冷 的丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 0.22 m油膜油滤， 丙酮洗涤5遍， 再用4ml超纯水溶解， 放入截留分 子量MWCO=3kDa的透析袋中透析3天， 吸出透析液冻干， 得透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒； （3） 负载吲哚箐绿的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒的合成： 将20mg透明质酸修饰的 普鲁士蓝纳米粒作为载体， 加入到40ml去离子水中， 探头超声溶解， 与5ml质量浓度2mg/ml 的光敏剂吲哚箐绿水溶液混合， 超声处理35min， 室温搅拌后放入截留分子量MWCO=3kDa的 透析袋中透析3天， 冷冻干燥制， 得中空介孔。
38、门控型透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒载药体 系。 0018 本发明提供了一种介孔门控型的透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒 （HA-HPBs） 自产 氧载药体系； 本发明采用具有高药物荷载量及生物相容性的中空介孔普鲁士蓝纳米粒 （HPBs） 作为基体材料,以吲哚箐绿 （ICG） 作为模型药物， 并以低分子量透明质酸 （HA） 修饰， 构建一种具有核磁成像、 光声成像双模式成像介导下的光热、 光动力学自产氧功能的肿瘤 精准多机制治疗。 该纳米体系的粒径为150-300nm,尺寸均一、 分散性好； 该体系主要具有以 下特点： 1)该载体在肿瘤弱酸性条件下， HA从HPBs上断开， 从而使介孔中的药物在肿瘤。
39、部位 说 明 书 4/7 页 8 CN 107496377 A 8 定点释放， 达到介孔门控型释放药物的特点； 2） 该给药体系中空介孔型的结构高药物容量， 可使药物在靶部位缓释； 3） 该给药体系可使肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 表型由辅助肿瘤恶性 转化的M2型转化为具有肿瘤杀伤抑制功能的M1型， 并产生大量的H2O2， 在肿瘤乏氧环境与有 过氧化氢酶活性的HPBs反应释放出大量O2， 从而实现递药体系的自产氧功能； 4) 载体具有 门控释药及主动靶向功能； 所述HA为分子量为6276kd的低分子量HA； 5） 靶向肿瘤部位的 HPBs可进行核磁共振成像和光声成像， 实现肿瘤的诊疗一体化； 。
40、透明质酸修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒 （HA-HPBs） 自产氧递药体系。 由中空介孔普鲁士 蓝纳米粒 （HPBs） 和光敏剂吲哚箐绿 （ICG） 组成， 并用透明质酸 （HA） 加以修饰； 利用HA对肿瘤 相关巨噬细胞 （TAM） 有表型转化的功能， 使TAM表型由辅助肿瘤恶性转化的M2型转化为具有 肿瘤杀伤抑制功能的M1型， 构建一种具有超声成像、 光声成像双模式成像介导下的光热、 光 动力学自产氧功能的肿瘤精准多机制治疗。 0019 本发明在HPBs的表面化学修饰上HA； 将HA连接到HPBs的表面， 封堵其介孔结构， 到 达肿瘤部位后， 肿瘤部位的酸性环境和HA酶使得HA分解脱去， 释放I。
41、CG， 实现门控效应。 减少 药物在到达肿瘤靶作用部位前的释放， 实现药物的定点输送， 最大程度的提高药物的疗效。 最终达到改善其分散性及生物相容性、 增加载药体系在体内循环时间、 提高对肿瘤的靶向 能力、 实现药物的定点聚集释放目的。 0020 本发明利用低分子量HA可使TAM表型由辅助肿瘤恶性转化的M2型转化为具有肿瘤 杀伤抑制功能的M1型， 同时M1巨噬细胞释放大量的H2O2不仅对肿瘤有杀伤作用， 而且在肿瘤 缺血乏氧的酸性环境与含过氧化氢酶活性的HPBs反应释放出大量O2， 缓解肿瘤乏氧状态的 同时， 中和H+改善了肿瘤的酸性环境， 增强了自产氧光动力学治疗效果。 同时， 肿瘤部位聚 。
42、集的HPBs可显著增强核磁成像和光声成像功能， 实现双模式介导下的肿瘤的诊疗一体化。 0021 本发明利用肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤缺血乏氧区域富集的特点， 合成并靶向递送 多功能HA修饰的介孔普鲁士蓝纳米粒 （HA-HPBs） 到肿瘤缺血乏氧区域， 利用透明质酸对TAM 有表型转化的功能， 使TAM表型由辅助肿瘤恶性转化的M2型转化为具有肿瘤杀伤抑制功能 的M1型， 且转化为M1型的巨噬细胞释放出大量的H2O2不仅对肿瘤有杀伤作用， 而且在肿瘤 缺血乏氧的酸性环境与含过氧化氢酶活性的HPBs反应释放出大量O2， 缓解肿瘤乏氧状态的 同时， 中和H+改善了肿瘤的酸性环境， 增强了自产氧光动力学治疗。
43、效果。 同时利用HPBs的光 声成像和光热治疗功能以及ICG的光热和光动力学效应， 实现双模式成像 （光声成像和核磁 共振成像） 介导下的肿瘤精准多机制诊疗。 0022 所述的HA-HPBs自产氧载药体系， 可以用于注射、 口服或植入给药。 其中注射给药 优选注射剂、 冻干粉针， 口服给药优选自片剂、 胶囊剂、 丸剂、 糖浆剂、 颗粒剂， 植入给药优选 自凝胶剂， 溶液剂。 0023 所述的HA-HPBs自产氧载药体系， 可用于肿瘤部位的靶向给药、 肿瘤PH响应型释 药、 双模式成像介导下的肿瘤的化学治疗和自产氧光动力学治疗的精准多机制治疗。 0024 本发明涉及一种中空介孔门控型透明质酸修饰。
44、的普鲁士蓝纳米粒自产氧光动力 学治疗体系。 方法为通过水热共沉淀法合成多功能介孔普鲁士蓝纳米粒 （HPBs） , 以该材料 为基体 （比表面积大， 容量大， 粒径均一， 有核磁成像和光声成像功能） ， 光敏剂吲哚箐绿 （ICG） 为药物模型， 通过化学键连接低分子量的透明质酸 （HA） 分子 （免疫激活剂） ， 实现肿瘤 靶向性和药物释放的门控作用。 该体系能够使肿瘤相关巨噬细胞表型由辅助肿瘤恶性转化 说 明 书 5/7 页 9 CN 107496377 A 9 的M2型转化为具有肿瘤杀伤抑制功能的M1型， 并产生大量的H2O2， 在肿瘤乏氧环境中与有过 氧化氢酶活性的HPBs反应释放出大量O。
45、2， 缓解肿瘤乏氧状态的同时增强了光动力学治疗效 果。 同时进行核磁成像和光声成像诊断， 实现双模式成像介导下的光热、 光动力学自产氧功 能的肿瘤精准多机制治疗的目的。 0025 本发明经过多次反复实验均取得了一致的结果， 相关实验数据如下 实验1： 透明质酸修饰的普鲁士蓝纳米粒 （HA-HPBs） 载药体系的制备 （1） 介孔普鲁士蓝纳米粒 （HPBs） 的合成： 将3.0g聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP） 和132mg 铁 氰化钾 （K3Fe(CN)6） 溶于40ml浓度为0.01M盐酸， 磁力搅拌成透明溶液之后， 放入电炉80 反应24h。 离心 （12000rpm， 30min） ， 。
46、蒸馏水洗涤3次， 80下真空干燥24h， 即得普鲁士蓝纳米 粒 （PBs） 。 称取1mgPBs， 溶于1ml浓度为1M的盐酸溶液中， 在磁力搅拌下将5mg PVP加入到上 述溶液中， 磁力搅拌三小时后， 把溶液放入到高压釜内， 在140电炉中反应4h。 离心 （12000rpm， 10min） ， 蒸馏水洗涤3次， 冷冻干燥即得HPBs。 0026 （2） HA-HPBs的合成： 精密称取5mgHPBs， 加入20ml超纯水， 探超使其分散均匀， 磁力 搅拌下加入5mgPEI， 继续搅拌24h， 透析， 冷冻干燥记得PEI修饰的HPBs （HPBs-PEI） 。 精密称 取45mg的HPBs。
47、-PEI于烧瓶100ml的烧杯中， 加入50ml甲酰胺， 在超声波下震荡溶解。 分别称 取346mgEDC、 206mgNHS于西林瓶中， 各加入4ml甲酰胺溶解。 将EDC、 NHS加入到HPBs-PEI甲酰 胺溶液中， 烧杯中搅拌， 室温反应过夜。 精密称取50mg的HA于西林瓶中， 加入10ml甲酰胺溶 解， 然后加入180 l三乙胺后用封口膜封盖， 用胶头滴管将其缓慢滴加至活化后的HPBs-PEI 中， 室温搅拌反应24h。 反应停止后， 向反应液中加入34倍量预冷的丙酮， 冰浴冷却， 析晶， 油滤 （0.22 m的微孔滤膜过滤） ， 丙酮洗涤产物35遍。 沉淀用34ml超纯水溶解， 。
48、透析 （截留 分子量MWCO=3kDa) 48h， 每隔8h换液， 除去甲酰胺和多余的HA， 冷冻干燥得HA-HPBs， 于4 冰箱保存备用。 0027 所制得的HPBs粒径均一， 平均粒径在100300nm范围， 电位为-24.4mv； HA修饰的 HA-HPBs粒径均一， 平均粒径在150nm左右， 分散性良好， 电位为-17.6mv。 0028 实验2： HA-HPBs负载ICG的制备： 称取10mg的HA-HPBs， 加入10ml超纯水中， 250W探超10min使其在水中分散均匀备用。 然 后称取10mgICG溶解于超纯水中， 得到ICG母液， 在400W超声， 冰水浴的作用下， 将。
49、ICG母液缓 慢的滴加到HA-HPBs溶液中， 滴加完毕后， 继续超声0.5h， 使ICG在剧烈运动下充分扩散进入 HA-HPBs的介孔孔道与中空结构中， 然后将上述溶液探头超声 （300W， 10次， 每次6s） ， 离心 （7500r/min， 5min） ， 透析除去游离药物， 冷冻干燥48h得到荷载ICG的HA-HPBs （HA-HPBs/ ICG） ， 于4下避光保存备用。 0029 实验3： HA-HPBs/ICG在酸性环境下的药物控释 将HA-HPBs/ICG置于透析袋内 （截留分子量MW=3500Da） 中， 浸入不同pH值的磷酸盐PBS 缓冲液 （7.4： 模拟正常体液、 5.5： 模拟肿瘤组织及4.0： 模拟溶酶体） 以及不同浓度HA酶 （1 g/ml和10 g/ml） 的PBS缓冲液中， 100r/min, 37条件下震荡， 每隔一定时间取出部分， 采 用UV法测定ICG， 测定其浓度并计算释放速度。 结果表明该制剂释药具有明显的酸。