技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及地高辛在制备治疗哺乳动物黄病毒科病毒感染的药物中的应用。
背景技术
黄病毒属(Flavivirus)是黄病毒科(Flaviviridae)家族成员，包括70多种病毒。这些病毒分布广泛，除南极洲外，世界各个大洲均有病例报道。经过蚊子叮咬传播的黄病毒(即蚊媒病毒)，例如流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)1-4型、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)，这些病毒在所流行的区域均可引起人较高的发病率和死亡率。近年来的全球气候变化影响到黄病毒传播媒介的地理分布，以及病毒基因某些位点的突变使其适应新的传播媒介，因此黄病毒感染呈现出进一步蔓延的趋势。黄病毒对人类健康造成了重大威胁，研发抗黄病毒感染药物的需求日益迫切。
乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染人体后引起流行性乙型脑炎，主要分布在亚洲、西太平洋国家以及澳大利亚北部。乙型脑炎病毒是一种虫媒病毒，主要由库蚊传播，在水鸟及猪体内扩增，终宿主为马和人。每年约有六万多感染病例报道，约50％的幸存者罹患永久性神经后遗症例如记忆丧失、认知障碍、行为障碍、抽搐等。乙型脑炎病毒对人类的健康造成了严重的威胁，目前并无治疗乙型脑炎的有效药物，因此研制安全有效的抗病毒药物是治疗该病的关键措施。
西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)是一种蚊媒病毒，1937年于乌干达的West Nile地区分离，因此得以命名。WNV由科学家首次在西半球分离得到，能在库蚊和鸟类之间传播，感染人、马，以及其他脊椎动物，并引起脊椎动物脑膜炎疾病。该病毒最初仅在非洲、欧洲中东地区零星爆发，后于1999年登陆美洲大陆。至2003年导致美国数十个州中近万人感染和数百人死亡，2008年进一步蔓延到加拿大和阿根廷，导致成千上万的感染者死亡或残疾，从而引起全球的普遍关注。
登革热(Dengue fever,DF)是由抗原性存在明显差异的四种不同血清型的登革病毒(DENV)感染引起，分别为DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4。四种血清型均能引起登革热，表现出发热、皮疹、头疼、肌肉和关节疼痛、恶心等症状。目前已经确定DENV的第五个血清型，其相关性质还需要进一步研究。登革热病毒感染后引起不同严重程度的症状，有些病毒株感染人后为无症状的隐性感染，有些病毒株可造成严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)，以及可能以死亡转归的登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)，造成血管渗漏、出血以及休克等危及生命的病症。在过去的十年中，登革热的暴发频率逐年增加，受威胁的人口数量也不断增加。全球近三分之一的人面临DENV感染的威胁，每年有3.9亿的感染病例，其中9,600万感染者表现出明显的临床症状，造成12,500-25,000的感染者死亡。
寨卡病毒(zika virus,ZIKV)最先于1947年在乌干达ZIKV森林一只发热的猴子体内分离，并以该森林的名字命名。该病毒自分离后，至2007年很少出现感染人的现象，最初该病的流行具有明显的区域限制，仅在非洲和东南亚地区流行，因此并未引起人们的关注。2007年4至7月，位于西太平洋密克罗尼西亚的雅浦岛上185例患者出现发热、头痛、皮疹、结膜炎和关节痛等症状，其中49例确诊为ZIKV感染，这是有史以来最大的一次ZIKV病毒感染人类事件，但无接受医学治疗或死亡的严重患者。2013-2014年，法属波利尼西亚ZIKV暴发流行，当地约11％的居民被感染。2015年该病毒入侵巴西，并通过埃及伊蚊传播，迅速在南美洲大规模流行，至今全球62个国家已出现ZIKV的流行。该病毒的传播流行与传染媒介活动区域和季节相一致，目前认为蚊子是ZIKV病毒最主要的传播媒介，因而夏季是ZIKV病毒暴发流行最为严重的季节。ZIKV病毒流行范围较广，已先后于非洲、亚洲和环太平洋地区暴发和流行。流行病学和血清学研究表明，只有大约20％的ZIKV感染者表现出临床症状，临床症状比较轻微并且通常自愈，表现为体温稍升高、关节疼、皮疹、结膜炎、头疼、肌肉疼。目前尚无有效的疫苗和药物用于ZIKV病毒感染的预防和治疗。
地高辛(digoxin)，化学名为3β-[[O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基]氧代]-12β,14β-二羟基-5β-心甾-20(22)烯内酯，是一种从毛地黄属植物中提取的强心苷，被广泛用于治疗心脏病。地高辛能有效地加强心肌收缩力，减慢心率，抑制心脏传导。特点是排泄快，蓄积性较小。主要用于充血性心力衰竭，室上性心动过速，心房颤动和扑动。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供了小分子化合物地高辛在制备治疗或预防黄病毒科病毒感染药物中的应用，从而为临床上JEV、DENV、WNV、ZIKV、YFV的治疗提供一种安全有效的小分子化合物。地高辛在无毒性范围内能够有效地抑制病毒感染细胞，可进一步开发为治疗或预防黄病毒科病毒感染的药物，具有广泛的应用前景。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及地高辛在制备治疗哺乳动物黄病毒科病毒感染的药物中的应用。
地高辛(digoxin)，化学名为3β-[[O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基]氧代]-12β,14β-二羟基-5β-心甾-20(22)烯内酯，结构式如图1所示。
根据本发明的第二方面，本发明还涉及一种在体外抑制黄病毒科病毒活性的方法，将含有黄病毒科病毒的物体与有效剂量的地高辛接触。
所述方法可用于对物体(例如食品、公共设施、医疗设备等)进行消毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
地高辛是小分子化合物，其CC50大于100μM。
对于JEV，地高辛能够剂量依赖性地抑制JEV感染，其IC50为109.9nM；
对于ZIKV，地高辛能够剂量依赖性地抑制ZIKV感染，其IC50为15.20nM。
实验证实对DENV和WNV也有抑制作用。而且地高辛已经在临床上有数十年的应用，安全性良好。这说明地高辛是安全有效的抗黄病毒科病毒的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为地高辛化学结构式；
图2为乌本苷化学结构式；
图3为本发明的一个实施例中地高辛体外抑制JEV的效果；
图4为本发明的一个实施例中乌本苷体外抑制JEV的效果；
图5为本发明的一个实施例中地高辛体外抑制ZIKV效果；
图6为本发明的一个实施例中乌本苷体外抑制ZIKV的效果；
图7为本发明的一个实施例中乌本苷降低JEV引起的死亡率；
图8为本发明的一个实施例中地高辛的细胞毒性；
图9为本发明的一个实施例中乌本苷的细胞毒性。
具体实施方式
黄病毒属病毒是黄病毒科病毒的一种，是具有包膜的单正链RNA病毒。这类病毒通常通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播。研究发现，地高辛或乌本苷对黄病毒属病毒的抗感染能力较强。
本发明涉及地高辛或乌本苷在制备治疗哺乳动物黄病毒科病毒感染的药物中的应用。
优选的，如上所述的应用，所述黄病毒科病毒具体为黄病毒属病毒。
优选的，如上所述的应用，所述黄病毒属病毒选自乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革热病毒(Dengue viru，DENV)以及黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)。
优选的，如上所述的应用，所述哺乳动物为灵长类动物。
优选的，如上所述的应用，所述灵长类动物为人。
优选的，如上所述的应用，所述药物的剂型为经胃肠道给药剂型；
所述经胃肠道给药剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
优选的，如上所述的应用，所述药物的剂型为非经胃肠道给药剂型；
所述非经胃肠道给药剂型选自注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。
在一些实施方式中，所述药物为注射给药剂型、呼吸道给药剂型、滴鼻剂、皮肤给药剂型、黏膜给药剂型或腔道给药剂型。
在一些实施方式中，注射给药剂型选自：如注射剂(包括静脉注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射多种注射途径)。
在一些实施方式中，呼吸道给药剂型选自：如喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等。
在一些实施方式中，皮肤给药剂型选自：如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等，给药后在局部起作用或经皮吸收发挥全身作用。
在一些实施方式中，黏膜给药剂型选自：如滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂等，黏膜给药可起局部作用或经黏膜吸收发挥全身作用。
在一些实施方式中，腔道给药剂型选自：如栓剂、气雾剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等，腔道给药可起局部作用或吸收后发挥全身作用。
根据本发明的第二方面，本发明还涉及一种在体外抑制黄病毒科病毒活性的方法，将含有黄病毒科病毒的物体与有效剂量的地高辛或乌本苷接触。
优选的，如上所述的方法，所述黄病毒科病毒具体为黄病毒属病毒。
优选的，如上所述的方法，所述黄病毒属病毒选自乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革热病毒(Dengue viru，DENV)以及黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
为了更好的了解本发明的实质，下面将用地高辛和乌本苷在治疗黄病毒科病毒感染的药物的药理实验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
噬斑减少实验检测药物抑制病毒感染效果：
1)确认地高辛和乌本苷对JEV病毒的抑制作用，具体步骤如下：
用胰酶消化Vero细胞，并用细胞计数仪计数，96孔板每孔加入细胞1.0×104个。
培养16小时后，吸弃上清，将稀释好的药物(12.25nM、196nM以及784nM)通过12通道排枪加入到对应的细胞孔中，并在37℃细胞培养箱中处理1小时。
每孔加入20μL JEV病毒(MOI＝0.8)，感染1小时，并每隔15分钟摇匀一次。
吸弃上清，用PBS洗涤3次，再将含有药物的维持培养基加入到细胞孔中，继续培养24小时。
培养24小时后，收取细胞上清，并冻存在-80℃冰箱中。
通过噬斑实验检测上述培养24小时后细胞上清子代病毒滴度；结果如图3和图4所示所示，将浓度梯度的地高辛和乌本苷处理Vero细胞24h后，细胞上清中的子代病毒滴度明显下降。
2)确认地高辛和乌本苷对ZIKV病毒的抑制作用，具体步骤如下：
用胰酶消化Vero细胞，并用细胞计数仪计数，96孔板每孔加入细胞1.0×104个。
培养16小时后，吸弃上清，将稀释好的药物(12.25nM、196nM以及784nM)通过12通道排枪加入到对应的细胞孔中，并在37℃细胞培养箱中处理1小时。
每孔加入20μL ZIKV病毒(MOI＝0.8)，感染1小时，并每隔15分钟摇匀一次。
吸弃上清，用PBS洗涤3次，再将含有药物的维持培养基加入到细胞孔中，继续培养24小时。
培养48小时后，收取细胞上清，并冻存在-80℃冰箱中。
通过噬斑实验检测上述培养48小时后细胞上清子代病毒滴度；；结果如图5和图6所示所示，将浓度梯度的药物处理Vero细胞48h后，细胞上清中的子代病毒滴度明显下降。药物处理组结果显示，地高辛和乌本苷能有效抑制病毒感染。
药物处理组结果显示，地高辛和乌本苷能有效抑制病毒感染。
注：上述1)和2)中，噬斑实验的具体做法为：
将BHK-21细胞分至12孔板中，密度为1.0×105个/mL。
16小时后，准备噬斑实验，首先将样品做10倍梯度稀释，然后每孔加入100μL样品感染，每隔15分钟摇匀一次，感染1小时。
感染完成后，吸弃上清再加入含1.0％甲基纤维素和2％FBS的培养基。
培养3天后，取出细胞板，吸弃细胞覆盖物，加入甲醛溶液，固定细胞12小时。
吸弃甲醛溶液，加入含0.1％的结晶紫染色液，处理细胞30分钟。
回收结晶紫染色液，用自来水冲洗细胞板，并在烘箱中烘干。随后拍照并计噬斑个数。
实施例2
本发明采用的体内技术方案是：
乌本苷3mg/kg，一日一次腹腔注射4周龄小鼠，攻毒剂量为1000000PFU，监测小鼠死亡率，结果如图7所示，乌本苷能有效抑制JEV引发的小鼠死亡。
实施例3
细胞毒性测定实验：MTT法测定细胞的活性。
MTT能够被细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶还原形成结晶甲瓒Formazan，这种物质不溶于水，而易溶于DMSO。用DMSO溶解后，可以用酶标仪检测其492nm的吸光度，从而定量这种物质。琥珀酸脱氢酶的活性反应了细胞的活性，因而检测甲瓒的量可以反应细胞的活性。为了测定药物的半数致死浓度CC50，药物设定5个浓度分别是100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，方法具体步骤如下：
1)将Vero细胞铺到96孔板中，细胞密度为1.0×105个/mL。
2)将梯度稀释的抑制剂(稀释在含2％FBS的DMEM培养基中加入到细胞中，培养24小时。
3)吸弃细胞上清，每孔加入25μL MTT溶液(5mg/mL),并继续在37℃培养4小时。
4)孵育完毕后，吸弃残余MTT溶液，并每孔加入50μL DMSO。
5)在室温下充分溶液15分钟后，通过酶联免疫检测仪492nm波长检测每孔吸光度。
6)计算各孔吸光度与对照组吸光度的比值，计算各个浓度下对细胞活性的影响。
实验结果分别如图8和图9所示，从图可知，6.25μM～100μM的地高辛和乌本苷对细胞均无明显毒性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。