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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710138478.4 (22)申请日 2017.03.09 (71)申请人 吉林修正药业新药开发有限公司 地址 130000 吉林省长春市高新区顺达路 1369号 (72)发明人 许艳茹 白冰 于艳辉 徐建 石菊 周俊佟 唐晓桐 (74)专利代理机构 吉林省长春市新时代专利商 标代理有限公司 22204 代理人 丁洪学 (51)Int.Cl. A61K 36/86(2006.01) A61K 9/16(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名。
2、称 中成药二丁颗粒的新用途 (57)摘要 一种中成药二丁颗粒的新用途， 二丁颗粒是 由紫花地丁、 蒲公英、 板蓝根、 半边莲混合后的水 煎提取物加辅料制成的治疗火热毒盛所致的热 疖痈毒、 咽喉肿痛、 风热火眼的中成药。 其新用途 是在治疗冠状动脉粥样硬化症中的药用用途。 本 发明的积极效果是： 为现有中成药扩大了适应症 范围， 为心脑血管方面的常见病增补了新药， 该 中药组合物针对患者需要可制备不同剂型， 携带 方便， 易服用。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107050201 A 2017.08.18 CN 107050201 A 1.中成药二丁颗粒的新用途， 其特征是： 治疗火热毒盛所。
3、致的热疖痈毒、 咽喉肿痛、 风 热火眼的中成药二丁颗粒用于治疗冠状动脉粥样硬化症的药用用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107050201 A 2 中成药二丁颗粒的新用途 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及治疗火热毒盛所致的热疖痈毒、 咽喉肿痛、 风 热火眼的中成药 “二丁颗粒” 在保护动脉粥样硬化方面的新用途。 背景技术 0002 冠状动脉粥样硬化心脏病已成为危害人类健康最重要疾病之一， 其主要病因是动 脉粥样硬化的形成， 动脉粥样硬化斑块的不稳定， 最后血管破裂导致出现心脑血管事件。 动 脉粥样硬化是一类多病因相互作用而产生的疾病， 动脉粥样硬化形成的机。
4、制比较复杂， 高 脂血症是其发生的一个重要原因， 另外在动脉粥样硬化的形成和发展进程中血管内皮细胞 损伤也起着关键作用。 0003 目前中西医治疗中， 均已开发出大量的药物并在临床上使用， 但西药存在过敏反 应、 消化道反应等不良反应， 长期服用毒副作用明显增加。 在临床治疗过程中， 传统中药越 来越受到患者的青睐， 而某些中成药中含有冰片， 易伤阳耗气， 长期使用反而会使心脏功能 减弱。 0004 二丁颗粒目前收载中国药典2015年版1部， 由紫花地丁、 蒲公英、 板蓝根、 半边莲份 组成功能与主治为清热解毒。 用于火热毒盛所致的热疖痈毒、 咽喉肿痛、 风热火眼。 作为清 热解毒类中药， 主。
5、要用于火热毒盛所致的热疖痈毒、 咽喉肿痛、 风热火眼， 清热类药物对动 脉粥样硬化的保护作用中医自古就有关于胸痹心痛热毒证候的论述研究， 例如 内经 中就 有许多关于热邪致心痛的记载热与胸痹、 心痛相关；医林改错心痛 中也明确指出热 邪可以煎熬致淤等。 近年来有人提出关于心血管疾病的 “热毒” 病机学说， 并用清热解毒法 治疗心血管系统疾病。“毒” ， 指对机体生理功能有不良影响的物质。 毒邪易与火、 热、 痰、 瘀、 湿诸邪胶结， 尤其毒邪最易与火邪相兼为病， 且毒瘀更能郁而化火， 灼伤血脉。 这些理论为 清热解毒药作为保护动脉粥样硬化的一类药物提供了理论基础。 发明内容 0005 本发明目。
6、的在于提供一种中成药二丁颗粒的新用途， 扩大现有成药的适应症范 围， 为常见的动脉粥样硬化病增加可选择治疗药品种。 0006 本发明的技术方案是： 治疗火热毒盛所致的热疖痈毒、 咽喉肿痛、 风热火眼的中成 药 “二丁颗粒” 用于治疗冠状动脉粥样硬化症的药用用途。 0007 用法用量： 开水冲服。 一次1袋， 每日3次。 1个月为1个疗程。 0008 经药效学实验证实， 二丁颗粒用于治疗动脉粥样硬化具有良好的效果， 为现有中 成药扩大了适应症范围， 为心脑血管方面的常见病增补了新药， 该中药组合物针对患者需 要可制备不同剂型， 携带方便， 易服用。 0009 药效学试验。 0010 1、 实验药。
7、物： 二丁颗粒： 拟日服用量为0.36g生药， 日服用按1倍、 2倍、 4倍量设计。 0011 2、 实验材料： 细胞系人脐静脉内皮细胞HUVEC， 购于中国医科大学肿瘤研究所， 复 说 明 书 1/5 页 3 CN 107050201 A 3 苏后用含20胎牛血清的DEME高糖培养基于37， 5CO2饱和湿度培养箱中静置培养， 24h 换液1次。 DMEM高糖培养基、 胎牛血清、 0.25EDTA胰蛋白酶(赛默飞世尔生物化学制品有限 公司)； 二甲基亚砜(Sigma公司)； MTT(Sigma公司)； 青链霉素混合液(北京鼎国昌盛生物技 术有限责任公司)。 SOD、 GSH-Px、 NOS、。
8、 NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 6-酮-前 列环素(6-Keto-PGFl )试剂盒、 一氧化氮(NO)试剂盒、 内皮素-1(ET-1)试剂盒由北京北方 生物技术研究所提供。 血浆P选择素(PPS)纤溶酶原激活抑制物(PAl-1)试剂盒由上海太阳 生物技术公司提供。 0012 3、 .实验仪器： SMP500-18272-LSIO酶标仪： Manufactured in China Designed in California USA； NIB-100F型倒置显微镜： 宁波永新光学股份有限公司； LD5-2A型低速离心 机： 北京医用离心机厂； HHS型电热恒温水浴锅： 上海博讯。
9、实业有限公司医疗设备厂； JA1103N型电子天平： 上海民桥精密科学仪器有限公： MCO-18AIC型CO2培养箱： 日本三洋； W- CJ-1F型洁净工作台： 苏净集团安泰公司。 0013 具体实施如下： 0014 1、 对血管内皮细胞的保护作用 0015 1.1方法HUVEC细胞培养用含l0胎牛血清， 青霉素(1105IUL-1)/(链霉素 100mgL-1)的DMEM高糖培养基于37、 5CO2饱和湿度培养箱内培养。 取对数生长期细胞， 瓶底细胞达80时用0.25胰蛋白酶消化制成单细胞悬液， 调整细胞浓度为1105个ml -1， 接种于96孔板中， 每孔200 l， 96孔板周围一圈只。
10、加培养液不加细胞以防止边缘效应， 分 组实验。 0016 1.1.1细胞分组及MTT检测HUVEC细胞按1105个/孔接种于96孔板， 培养24h贴壁 后将细胞随机分为5组： 正常对照组、 H2O2模型组、 二丁颗粒(12.5mgL-1)、 中(25mgL-1)、 高(50mgL-1)剂量组； 首先分别用含有12.5、 25、 50mgL-1浓度中药组合物培养基预培养 24h。 对照组和模型组用培养基代替预培养相同时间后， 去除原培养液， 用PBS清洗2次。 除正 常对照组其余各组细胞换含有400 moL-1H2O2培养基刺激12h， 终止后去掉培养基， 加入含 有0.5gL-1MTT无血清培。
11、养基， 孵育4h后， 弃上清液， 加入150 l二甲基亚砜， 振荡混匀后于 酶标仪上测定492nm波长下吸光度， 计算细胞活力。 0017 1.1.2培养液中NO含量测定 0018 细胞按 “1.1” 方法分组处理后， 收集上清液， 按照试剂盒说明书描述的方法， 测定 各组细胞上清中NO含量， 所有实验至少重复3次。 0019 1.1.3细胞裂解液中SOD、 GSH-Px、 NOS活性测定 0020 细胞按 “1.1” 方法分组处理后， 用0.25胰蛋白酶消化细胞， PBS洗涤2次， 将细胞 混悬于RIPA裂解液， 冰上放置30min， 4， 14000rmin-1离心10min， 收集细胞裂。
12、解液， 按照 试剂盒说明书中所述的方法， 测定OD、 GSH-Px、 NOS活性。 0021 2、 对实验性动脉粥样硬化血管内皮损伤的保护作用 0022 2.1方法： 健康雄性新西兰兔30只， 体重2.0-2.5kg， 月龄3-4个月， 随机分为5组： 正 常组用普通饲料喂养， 同时于实验第13周至16周末， 生理盐水10mlkg-1灌胃； 模型组用高脂 饲料喂养， 高脂饲料是在普通饲料中加入1胆固醇、 5猪油， 同时于实验第13周至16周 末， 生理盐水10mlkg-1灌胃； 中药组合物低剂量(5.6gkg-1)组饲料同模型组， 同时于实 验第13周至16周末， 10mlkg-1灌胃； 中药。
13、组合物高剂量组(11.2gkg-1)饲料同模型组， 同 说 明 书 2/5 页 4 CN 107050201 A 4 时于实验第13周至16周末， 10mlkg-1灌胃； 阳性对照组饲料同模型组， 同时于实验第13周 至16周末， 阿伐他汀钙(0.9mgkg-1)， 10mlkg-1灌胃。 0023 2.2 16周末麻醉家兔分离测血清测定TC、 TG、 HDL-C、 LDL-C、 PPS、 NO， 枸橼酸钠抗凝 分离血浆， 酶联免疫法测定ET-1、 6-Keto-PGFl 。 空气栓塞处死动物， 立即打开胸腔和腹腔， 取出主动脉， 标本用10福尔马林溶液浸泡固定， 0024 常规取材、 石蜡包。
14、埋、 切片、 HE染色， 光学显微镜下观察病理学变化。 0025 3、 实验结果 0026 3.1对血管内皮细胞的保护作用 0027 结果显示H2O2损伤细胞后， 模型对照组细胞吸光度值明显降低， 细胞活力也明显降 低， 表明细胞受到损伤， 而中药组合物中、 高剂量组吸光度值显著增加， 细胞活力有升高至 70左右， 与模型对照组比较有显著差异(p0.05， p0.01)， 见表1。 0028表1对血管HUVEC细胞吸光度值及细胞活力的影响 0029 0030 与模型对照组比较*p0.05， *p0.01 0031 3.2对HUVEC细胞液中NO及细胞内SOD、 GSH-Px、 NOS活性的影响。
15、 0032 结果表明， 模型组细胞内SOD活力明显降低， GSH-Px及NOS含量明显降低， 细胞培养 液中NO含量也下降。 中药组合物中、 高剂量组可以明显提高细胞内SOD活力， 增加GSH-Px及 NOS含量， 升高细胞液中NO含量， 与模型组比较有显著差异(p0.05， p0.01)， 结果见表2 0033表2对HUVEC细胞液中NO及细胞内SOD、 GSH-Px、 NOS活性的影响 0034 0035 与模型对照组比较*p0.05， *p0.01 说 明 书 3/5 页 5 CN 107050201 A 5 0036 3.3对实验性动脉粥样硬化家兔血脂指标的影响 0037 结果显示， 。
16、阳性对照及中药组合物低、 高剂量组可以不同程度的抑制血清中TC、 TG、 LDL-C含量升高， 促进HDL-C含量释放， 对血脂具有保护调节作用， 与模型对照组比较有 显著差异(p0.05， *p0.01， *p0.01)， 结果见表3。 0038表3对血清中TC、 TG、 LDL-C、 HDL-C含量的影响(n6) 0039 0040 与模型对照组比较*p0.05， *p0.01， *p0.01 0041 3.4对家兔血浆PPS、 ET-1、 6-Keto-PGFl 及血清NO含量的影响 0042 结果表明， 阳性对照组及中药组合物低、 高剂量组可以明显抑制血浆中PPS、 ET-1 及血清中。
17、NO释放， 促进6-Keto-PGFl 含量释放， 对凝血因素有一定的调节作用， 与模型对照 组比较有显著差异(p0.05， *p0.01， *p0.01)， 结果见表4。 0043表4对血清中PPS、 ET-1、 NO、 6-Keto-PGFl 含量的影响(n6) 0044 0045 与模型对照组比较*p0.05， *p0.01， *p0.01 0046 3.5病理形态学改变 0047 3.5.1肉眼观察 0048 空白组主动脉管腔光滑完整。 模型组在主动脉根部及分枝血管的开叉处， 形成纵 行的线状病灶和灰黄色的脂质斑块， 表面光滑。 阳性对照组及中药组合物组整个主动脉内 膜呈灰黄色或灰白色。
18、浑浊外观， 有帽针头大小的点状病灶， 与模型组相比较其病理改变减 说 明 书 4/5 页 6 CN 107050201 A 6 轻。 0049 3.5.2光学显微镜观察 0050 空白组动物血管内膜未见异常。 模型组动脉管腔明显变窄凸凹不平， 内皮细胞增 生肿胀， 内弹力膜断续或消失， 内皮下层间隙明显增大， 可见大量脂质沉积， 泡沫细胞、 淋巴 细胞、 浆细胞浸润； 中膜浅层结构紊乱， 肌纤维分离， 弹力板紊乱， 平滑肌细胞肿大增生， 向 管腔侧迁移。 阳性对照组及中药组合物低、 高剂量组动物血管内膜有轻度局限性增生， 内皮 细胞增生， 内皮下层稍有增大、 有少量的腊质沉积： 中膜浅层结构稍。
19、有变化， 与模型组相比 较其病理改变减轻。 0051 结论： 0052 1、 二丁颗粒可以提高氧化应激状态的HUVEC细胞存活率， 并且可以提高细胞内SOD 和GSH-Px、 NOS活性， 增加培养基中NO水平， 说明二丁颗粒可以上调细胞内氧化防御系统的 活性， 清除自由基， 促进内源性NO生成和释放， 从而保护细胞免受氧化应激损伤， 是阻碍动 脉粥样硬化早期发病的关键环节。 0053 2、 二丁颗粒具有保护血管内皮的内分泌功能障碍， 调节血管张力， 抑制血小扳活 化和局部炎症反应， 调节纤溶系统来改善血管内皮功能， 进而阻止动脉粥样硬化的进展。 0054 3、 二丁颗粒能够有效降低血清中TC、 TG、 LDL-C含量， 提高HDL-C含量， 对血脂具有 明显的调节作用， 减少了脂质在组织中的沉积， 进而可以减轻血清及斑块组织的炎症反应， 减少内膜面隆突斑块形成， 发挥抗动脉粥样硬化作用。 0055 综上所述， 二丁颗粒具有显著的抗动脉粥样硬化药理作用， 在临床心脑血管疾病 的预防性治疗中具有应用前景。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107050201 A 7 。