技术领域
本发明涉及一种利用大肠杆菌表达系统生产的高活性可溶重组人 内皮抑素注射剂的制备方法，以及这种方法的制品在抗血管生成治疗中 的应用，属于基因工程生物制品技术领域。
背景技术
鼠内皮抑素(endostatin)基因最早是在1997年被Folkman博士领 导的科研小组研究发现，这是一种内源性血管内皮细胞增殖抑制剂[O′ Reilly MS，et al，Endostatin：An endogenous inhibitor of angiogensis and tumor growth，Cell，1997，88(2)：277]，并且是一种从大肠杆菌表达系统生产 的高活性不溶性重组鼠内皮抑素，采用皮下注射这种不溶性内皮抑素抑 制小鼠肿瘤生长作用十分明显。内皮抑素的结构特征具有特殊性，偏酸 性稳定性和有二对二硫键，使其在中性和碱性环境下活性和溶解性不稳 定，易失活，导致自然折叠率很低，通常状况下99％的重组内皮抑素以 沉淀形式存在。为了使其可溶，人们想了不少办法。美国首先改用酵母 表达系统以产生可溶性分泌性重组人内皮抑素，现处于II期临床阶段。 但内皮抑素可溶并不代表活性高，采用酵母表达系统生产的重组内皮抑 素在临床研究中未显示出人们期望的高活性和高疗效。我国也有从大肠 杆菌表达系统产生的可溶性融合蛋白人血管内抑素，但由于结构上作出 的微小变化会产生不同的活性变化，融合蛋白部分有时会在体内产生抗 体而使活性减弱和疗效降低。我国还有采用分子伴侣及16℃-25℃发酵 等方法解决重组人内皮抑素可溶问题的报道，但这些均不能满足工业化 大规模高活性可溶重组蛋白的制备问题。
发明内容
本发明的目的是：通过改进重组人内皮抑素的制备工艺，提供一种 以重组大肠杆菌为原料，制备高活性可溶重组未改构的天然人内皮抑素 注射剂的方法，进而以该方法为基础形成日产规模克级以上、年产千克 级规模、高活性可溶重组蛋白纯度大于96％的高收率大规模生产技术， 以满足该产品在临床应用中毫克级大剂量、较长时期重复使用的需求， 从而有效地推动重组人内皮抑素在抗血管生成疾病治疗中的临床应用。
为实现本发明的目的，高活性可溶重组人内皮抑素注射剂的制备方 法，以表达人皮抑素基因的重组大肠杆菌菌体为原料，经过提取、复性 和纯化的工业化处理过程获得重组人内皮抑素蛋白，进而配制成重组人 内皮抑素注射剂，其特征在于：所述工业化处理过程具体包含以下两个 步骤——
(1)从菌体中提取纯度大于82％的包涵体蛋白：首先将包涵体用 洗涤液A及异丙醇分别离心沉淀，去除杂蛋白、脂质及核酸，再用提取 液B溶解包涵体，用稀释液C稀释使目的蛋白析出，分离后将沉淀物用 缓冲液洗涤，并用溶解液溶解，获得纯度大于82％的内皮抑素包涵体；
(2)向步骤(1)获得的纯度大于82％的内皮抑素包涵体当中缓慢 滴入复性液D进行复性，然后超滤浓缩，再用阴离子交换树脂和阳离子 交换树脂进行分离纯化，获得纯度为96％以上的重组人内皮抑素蛋白。
进一步地，上述的高活性可溶重组人内皮抑素注射剂的制备方法， 其中步骤(1)进行二次提取包涵体的过程当中，所述的洗涤液A含有 1-50mmol/L的Tris-HCL、0.5-10mmol/L的EDTA、0.5-10mmol/L的2- 巯基乙醇、0.01-1Wt％的Triton X-100以及20-50Wt％的异丙醇，并分 3-7步离心洗涤包涵体；所述的提取液B含有1-6mol/L的盐酸胍、0.5-2％ 的巯基乙醇；所述的稀释液C含有1-50mmol/L的Tris-HCL、0.1-1mol/L 的NaCl，其pH值为7.0-8.0。步骤(2)进行复性过程当中，所述的复 性液D含有2-50mmol/L的醋酸钠-醋酸缓冲液、0.1-2mmol/L的还原型 谷胱甘肽、0.05-1mmol/L的氧化型谷胱甘肽；并且，步骤(2)中所述 阴离子交换树脂是DEAE-Sepharose，阳离子交换树脂是SP-Sepharose， 它们均为每天可以对10克以上样品进行分离纯化并能获得纯度≥96％ 的重组蛋白的大容量分离树脂。
本发明突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：大大改进了重 组人内皮抑素大规模制备过程中的提取、复性和纯化工艺，应用本发明 技术方案可以制备获得蛋白纯度在96％以上的高活性可溶重组人内皮抑 素注射剂，每立升发酵物能够得到40-50mg纯品，年制备量可达到数千 克以上。通过体内外活性测定，表明这种工业化制备工艺可从大肠杆菌 中生产出高活性可溶的大批量重组人内皮抑素产品，该产品在治疗依赖 血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的疗效。
附图说明
图1：重组人内皮抑素表达电泳图；
图2：重组人内皮抑素粗包涵体电泳图；
图3：重组人内皮抑素精包涵体电泳图；
图4：重组人内皮抑素DEAE-Sepharose阴离子交换纯化电泳图；
图5：重组人内皮抑素SP-Sepharose阳离子交换纯化电泳图；
图6：重组人内皮抑素纯度电泳图；
图7：重组人内皮抑素HPLC纯度分析图；
图8：重组人内皮抑素体内活性测定。
具体实施方式
重组内皮抑素通过大肠杆菌表达，表达产物99％以上是不溶的，这 种不溶解的沉淀内皮抑素蛋白皮下注射反而活性高，但不能静脉注射。 不同制备方法甚至不同表达系统制备出可溶性重组内皮抑素有的有活 性，有的活性低，有的则没有活性。有的可溶性不稳定需要添加溶解辅 助剂助溶，有的溶解性好的重组内皮抑素静脉注射反而活性低，疗效低。 以至于国际上出现对内皮抑素作用的许多学术争论和一些疗效疑问。另 外I期临床试验采用剂量达30-240mg/m2，II期-III期临床试验中采用 7.5mg/m2到15mg/m2以上，与一般重组蛋白微克级用量相比，重组人内 皮抑素用量较大，使用周期又需要较长时间抑制肿瘤血管生长，所以必 须具备大规模工业化生产出高活性可溶千克级规模以上重组人内皮抑 素才可满足临床广泛应用的需要。
在利用大肠杆菌发酵表达重组人内皮抑素蛋白的过程中，其可溶性 部分不足1％，99％以上以不溶的包涵体形式存在，除非采用分子伴侣和 在16℃左右进行发酵，或采用助溶剂进行助溶，也有用分泌型载体进行 低温诱导表达。但这样操作难以大规模工业化生产及活性难以控制稳 定。所以如何将不溶的包涵体沉淀蛋白转换成高活性的可溶性蛋白，并 能满足临床毫克级剂量的大量需求，这是本发明的关键技术所在。
本发明采用50-500立升发酵罐常规温度发酵表达，对温控诱导的 DH5α工程菌采用30℃-42℃诱导表达，对IPTG诱导表达的BL21(DE3) 工程菌在37℃常规温度中诱导表达，有利于GMP工厂原有设备条件的 充分利用，不需要进行工艺路线技术改造，并且每升发酵液可获湿菌体 达20克以上(说明：50升发酵罐中仅放35升发酵液，70％---700克湿 菌体)，比低温发酵所获菌量大，大规模发酵中目的蛋白仍可占总菌体 蛋白的30％以上，基因表达效率较高，保证了发酵环节可获足够量的菌 体和目的蛋白，产品收率1升发酵液获纯品40mg以上，满足千克级重 组蛋白大规模工业化生产的需要。
湿菌通过洗涤和加入溶菌酶后通过超声破碎或高压匀浆机破碎，使 菌体内部的内皮抑素包涵体全部释放出来。将包涵体分别通过含 Tris-HCl、EDTA、2-巯基乙醇、TritonX-100、尿素、异丙醇等不同成分 的洗涤液多步洗涤，分别除去杂质、脂质、杂蛋白和脂多糖，将经多步 洗涤后的包涵体粗品用含盐酸胍和巯基乙醇的复性液提取溶解包涵体， 溶解后的包涵体称包涵体初提取液。再向包涵体初提取液中加入含 Tris-HCl和NaCl的稀释液稀释到重组蛋白再次析出，通过该步的析出获 得沉淀再溶解，这称为二步包涵体提取法，通过这特殊工艺处理最终制 备的重组内皮抑素耐受NaCl处理，并使后续工艺中制品稳定性和溶解 性提高，使包涵体纯度大大提高，可达纯度82％以上，为后续的蛋白质 复性和离子交换纯化工艺提供了方便，也有利于大规模工业化纯化。
包涵体精纯化后虽然纯度大大提高，由于重组人内皮抑素含二对二 硫键，需要在适宜条件下重新折叠，还原成具有正确空间构像及分子内 结构的生物活性分子，形成正确的二硫键配对和分子折叠还原成天然正 常的空间构像，从而获得天然的高比活性。这一过程是重组蛋白质下游 处理的关键技术，直接影响到产品的质量和得率。正确的复性技术与复 性剂浓度、重组蛋白的浓度和纯度、所用复性剂的氧化还原体系、pH、 离子强度等多种因素都密切相关，复性条件不适宜，会出现分子内二硫 键错配，分子间共价或疏水结合成聚合体，一方面降低重组蛋白的活性， 同时又会产生析出影响得率。重组蛋白质复性其中最重要的影响因素之 一是重组蛋白质的纯度、浓度及溶解度，重组蛋白质如达不到一定的纯 度，其中的杂蛋白在复性中易于降低重组蛋白质的活性，同时极易聚合 析出，带走大量重组蛋白质，降低得率。一般认为复性时重组蛋白质的 纯度需达到80％以上，本申请的发明人通过两步提取包涵体工艺使重组 蛋白质的纯度达82％以上，并增加了重组蛋白质溶解性和稳定性。因此 在复性过程中可提高复性效率和提高活性。复性过程中将蛋白浓度调整 至7-10mg/ml，并用较大体积复性罐加入含有氧化型谷胱甘肽和还原型 谷胱甘肽的复性液中复性，这种复性方式简便有效，有利于工业化大规 模复性操作，然后将复性液超滤浓缩，通过缓冲液平衡去除复性剂后即 可进行色谱分离。
在解决重组人内皮抑素包涵体纯化和复性问题后，首选的色谱分离 技术为吸附色谱方法，采用二步离子交换法，进一步纯化出纯度达96％ 以上的重组人内皮抑素。由于考虑到该产品临床用量为毫克级，年产需 千克级以上水平才可满足临床用量，所以本发明解决大容量快速和简便 的纯化工艺技术问题，首先选择DEAE阴离子树脂以吸附杂蛋白和去除 热原质，再采用SP阳离子交换树脂进行分离，如采用SP-sepharose吸 附交换重组人内皮抑素的容量较大，采用100ml柱就可达到克级水平的 分离效果。通过二步离子交换纯化，采用醋酸钠缓冲液进行超滤透析， 平衡后进行电泳鉴定和体内外活性测定，就可获得纯度达96％以上高活 性可溶的重组人内皮抑素，并且每100立升发酵物可得到4克以上重组 人内皮抑素纯品。采用500立升发酵罐70％容量发酵，一罐发酵可获15 克以上纯品。通过以上工业化制备工艺就可达到日产克级以上重组蛋白 以供临床应用所需。这么大规模的重组蛋白工业化制备工艺制备出的产 品，纯度超过一般重组蛋白95％纯度标准要求，可溶性好，并每批次通 过体外、体内活性测定保证了产品的高活性。
本发明达成工业化大规模纯化重组人内皮抑素的制备工艺，使99％ 不溶的内皮抑素蛋白成为高活性可溶重组蛋白，并在依赖血管生成疾病 的抗血管生成治疗中得到应用。血管生成通常有两种方式，正常的血管 生成一般见于创伤愈合、胎儿和胚胎的发育、黄体、子宫内膜和胎盘的 形成。而这里所指的依赖血管生成疾病的血管生成是一种持续的、不受 调节的血管生成，大量见于病态、肿瘤转移和血管内皮细胞异常生长的 疾病依赖性血管生成或称为血管生成相关性疾病。这里所述属于依赖血 管生成疾病类型有以下两类：
(1)用于治疗血管生成介导性、依赖性或相关性疾病：包括但不 限于良性肿瘤，如血管瘤；实体肿瘤；血生肿瘤如白血病；肿瘤转移； 听觉神经瘤；毛细血管扩张；类风湿性关节炎；牛皮癣；眼血管生成疾 病如糖尿病性视网膜病，早熟性视网膜病，黄斑变性，新血管性青光眼， 晶状体后的纤维组织形成；蚀斑新血管化；冠状侧突；大脑侧突；动静 脉畸形；局部缺血性肢血管生成；血友病患者关节病；血管纤维瘤；生 脓性肉芽肿；瘢痕瘤。
(2)也用于治疗内皮细胞的过量或异常刺激引起的疾病，例如： 动脉粥样硬化；硬皮病；肠粘连；肥大性疤痕；猫抓病；幽门螺杆菌引 起的胃溃疡。
下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不 限制本发明的保护范围。
实施例1：纯度大于82％的内皮抑素包涵体的提取
基因工程菌DH5α或Bl21(DE3)由本单位保藏，内皮抑素重组质粒 pBV220-Endostatin或pET9c-Endostatin由本发明人构建并保藏。利用工 程菌重组内皮抑素大肠杆菌进行发酵并诱导表达，这是公众知晓通用技 术，故描述从略。将发酵诱导表达后的菌体作为本发明的原料。
采用50立升发酵罐进行发酵，获湿菌约700克左右，采用500立 升发酵罐进行发酵，可获湿菌约5公斤以上。按每克湿菌加入10ml、 20mol/L Tris-HCl pH8.0洗涤菌体，4℃离心7000rpm 10分后弃上清，然 后每克湿菌加入溶菌酶1mg/ml，50mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA (pH8.0)缓冲液10ml，4℃搅拌1小时，然后超声破碎菌体或用高压匀 浆机予以破碎，使菌体内部的内皮抑素包涵体全部释放出来。通过镜检， 细菌破壁率达98％，并电泳鉴定，内皮抑素在全菌中表达量超过30％， 超声破碎后上清中内皮抑素可溶性部分占1％以下，99％不溶性内皮抑素 存在于包涵体沉淀之中，见图1。
用同种缓冲液洗涤后，用含2mmol/L的2-巯基乙醇和0.1％的 TritonX-100洗涤包涵体去除脂质，用含2mol/L尿素的缓冲液去除杂蛋 白，用含50％异丙醇的缓冲液去除脂多糖，再用同种缓冲液洗涤包涵体 去除异丙醇成为粗包涵体，见图2。
将上述初纯的包涵体用含6mol/L盐酸胍和1％巯基乙醇的提取液A 溶解包涵体，在溶解液中加入20mol/LTris-HCl和0.9％NaCl液稀释至内 皮抑素重组蛋白再次析出，离心弃上清，去除杂蛋白，沉淀用缓冲液洗 2次后再次溶解，经这种二次提取包涵体步骤后，精包涵体纯度可达82％ 以上，见图3，包涵体回收率也大大提高，可获90％以上回收率，并使 后续纯化工艺中内皮抑素溶解度大大提高，为后续的纯化步骤创造了良 好的条件。
实施例2：连续稀释内皮抑素包涵体低浓度复性
复性溶解的包涵体要在适宜条件下折叠，还原成为具有正确空间构 像及分子内结构的生物活性分子，其中包括重组蛋白质内形成正确的二 硫键，以及分子折叠还原为天然正常的空间构像，从而获得天然的比活 性。包涵体纯化达82％以上纯度、调整蛋白浓度在12mg/ml左右，以连 续稀释法进行稀释复性，所用复性液含有20mmol/L醋酸钠缓冲液， 1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽，在50立升带搅 拌的反应釜中进行复性，连续稀释至最终浓度0.1mg/ml，4℃下缓慢搅 拌1小时以上，4℃复性至检测完全复性后超滤浓缩。
实施例3：纯度大于96％的高活性可溶内皮抑素的色谱分离
取超滤浓缩后内皮抑素复性液采用大容量阴离子DEAE-Sepharose 进行吸附杂蛋白和去除热原质，由于采用吸附法分离，上样后流速以线 速度60cm/hr将样品穿过柱子，收集穿透液后(图4)上阳离子 SP-Sepharose进行分离，用含0.8mol/LNaCl的无热原水进行洗脱，收集 主蛋白峰，进行电泳鉴定(图5)。重组人内皮抑素的纯度通过电泳和 HPLC纯度鉴定。通过阴阳离子树脂大容量分离纯化，避免了上分子筛， 从而满足日产克级以上年产千克级以上重组内皮抑素纯化工艺的需要， 使纯化工艺上可达到大规模工业化生产的需要。通过以上实施例操作， 使最后获得纯度达96％以上的高活性可溶重组人内皮抑素蛋白(图6和 图7)，收率达到每立升发酵物可得纯品40-50mg，日产达到10克以上， 活性测定通过体外测定和体内测定双重测定方法保证了体内外均具有 高活性(图8)，通过选用血管特别丰富的鼠肝癌H22作为体内测定活性 的动物模型，以将生物检定统计法中量反应平行线测定法作为定量换算 方法，建立了重组人内皮抑素体内定量活性测定方法，可换算到具体的 活性单位。并且这种千克级纯化工艺得到的重组人内皮抑素溶解度高， 稳定性好，解决了文献报道中该产品99％不溶，不同制备方法体外有活 性体内无活性或者低活性的问题，也解决了临床上毫克级剂量用量大， 使用周期较长的工业化大规模生产问题，推动了重组人内皮抑素注射剂 在血管依赖性疾病中抗血管生成治疗的临床应用。
总之，本发明通过50至500立升发酵罐发酵表达，改进大肠杆菌 包涵体二次提取工艺技术使包涵体蛋白复性后纯度达82％以上，而且在 小于0.01mol/L的尿素中保持高度的可溶解性。改进工业化变复性工艺 和纯化工艺，使该方法能够制备获得蛋白纯度在96％以上的高活性可溶 重组人内皮抑素注射剂，并使每立升发酵物可得到纯品40-50mg，年制 备量可达到数千克以上。通过体内外活性测定，表明这种工业化制备工 艺可从大肠杆菌中生产出高活性可溶的大批量重组人内皮抑素产品，该 产品在治疗依赖血管生成疾病的抗血管生成方面具有很好的疗效。