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1、(10)授权公告号 CN 101011575 B (45)授权公告日 2011.04.06 CN 101011575 B *CN101011575B* (21)申请号 200610025485.5 (22)申请日 2006.04.06 A61K 45/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (73)专利权人 上海交通大学医学院附属新华医 院 地址 200092 上海市杨浦区控江路 1665 号 (72)发明人 王长谦 何清 吕宝经 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 丁纪铁 黄河等 .RNA 干扰研究进展 . 实用预防医学 13 1.。
2、2006,13(1), 第 206 页 . 张俊峰等 . 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 在巨噬和泡沫细胞中的表达 . 上海交通大学学报 （医学版） 26 3.2006,26(3), 第 225-228 页 . Thorsten Hagemann et al.“Macrophages Induce Invasiveness of Epithelial Cancer CellsVia NF-KB and JNK“1197 1205.The Journal of Immunology.2005, 第 1197 页摘要 . 张珍珠等.RNA干扰技术及其应用.高师理科 学刊 26 1.2006,26(1。
3、), 第 72 页 . 钱颖等.RNA干扰及其技术的应用.浙江中医 学院学报 30 1.2006,30(1), 第 104-105 页 . (54) 发明名称 预防和治疗动脉粥样硬化病的 RNA 干扰药 物 (57) 摘要 本发明公开了一种预防和治疗动脉粥样硬化 病的药物，该药物含有适于通过 RNA 干扰抑制 胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (EMMPRIN) 基因 表达的双链核糖核酸 (dsRNA)，所述药物中的 dsRNA 能有效抑制单核 / 巨噬细胞中 EMMPRIN 基因的表达，为动脉粥样硬化病的治疗及急性冠 脉事件的防治提供新的治疗靶点和有效新药。 (51)Int.Cl. (56)对比文。
4、件 审查员 陈红霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 CN 101011575 B1/1 页 2 1. 预防和治疗动脉粥样硬化病的药物， 其特征在于， 该药物含有适于通过 RNA 干扰抑 制胞外基质金属蛋白酶诱导因子 EMMPRIN 基因表达的双链核糖核酸 dsRNA， 所述 dsRNA 由 SEQ ID NO.1 序列的 S1 链和 SEQ ID NO.2 序列的 S2 链构成， 或由 SEQ IDNO.3 序列的 S1 链 和 SEQ ID NO.4 序列的 S2 链构成， 或由 SEQ ID NO.5 序列的 S1 。
5、链和 SEQ ID NO.6 序列的 S2 链构成。 2. 如权利要求 1 所述的药物， 其特征在于， 所述 S1 链与基因的初级或加工的 RNA 转录 本互补。 权 利 要 求 书 CN 101011575 B1/6 页 3 预防和治疗动脉粥样硬化病的 RNA 干扰药物 技术领域 0001 本发明涉及预防和治疗动脉粥样硬化病的药物， 尤其涉及一种治疗动脉粥样硬化 病的 RNA 干扰药物。 背景技术 0002 动脉粥样硬化及其所致冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是心血管最常见疾 病， 是人类致死的主要原因。近年研究表明， 动脉粥样硬化斑块的稳定性很重要。不稳定 冠状动脉粥样硬化斑块易发生破裂。
6、或破溃， 表面血栓形成， 是造成急性冠脉综合征 (acute coronary syndromes， ACS， 包括不稳定性心绞痛、 急性心肌梗死、 猝死 ) 的主要机制， 而急 性冠脉综合征则是冠心病致死致残的主要原因。 不稳定动脉粥样硬化斑块相对稳定斑块而 言有以下特点 ： 第一， 斑块内部含有较大的脂质核心 ( 40斑块体积 ) ； 第二， 斑块的纤 维帽较薄 ； 第三， 斑块内有较多单核 / 巨噬细胞浸润。研究表明， 存在于粥样硬化斑块局部 的基质金属蛋白酶类 (Matrix metalloproteinase， MMPs) 与动脉粥样硬化斑块的稳定性 密切相关。因此， 抑制 MMPs。
7、 的表达和活性， 稳定动脉粥样硬化斑块， 很可能是防治 ACS 的 一种有效途径。MMPs 是一个内源性锌依赖性酶家族， 可降解多糖以外的所有细胞外基质成 分， 在转录水平， 多种炎症因子如IL-6、 TNF-可诱导MMPs表达， 基质金属蛋白酶诱导因子 (extracellular matrixmetalloproteinase inducer， EMMPRIN) 也具有诱导 MMPs 表达的 作用。 0003 EMMPRIN 属于免疫球蛋白超家族， 是高度糖基化的跨膜蛋白质， 首次在人类肿瘤 细胞表面被发现， 接着又在人单核细胞表面被发现， 而且在单核细胞向巨噬细胞转化过程 中， GM-C。
8、SF 的刺激使 EMMPRIN 基因表达增加 5 8 倍 ； 另一方面， 在人类动脉粥样硬化斑块 中巨噬细胞富集区 EMMPRIN 基因的表达也显著增加， 且其表达量的增加与局部 MMP-9 活性 的增强一致， 提示 EMMPRIN 可能通过调节斑块局部 MMPs 的分泌和活性， 进而影响动脉粥样 硬化斑块的稳定性。在富含单核细胞源性巨噬细胞的不稳定斑块中， 巨噬细胞表达的大量 EMMPRIN， 刺激周围细胞表达更多的 MMPs， 从而降低斑块稳定性， 且增加斑块破裂及其所致 急性冠脉事件的发生概率。 0004 RNA 干扰 (RNA interference， RNAi) 是新近发展起来的一。
9、种封闭基因表达的有效 方法。它采用与目的基因同源的短片段双链干扰 RNA(small interfering RNA， siRNA) 转 染至靶细胞， siRNA 双螺旋解开双链产生的单链 siRNA 结合到 RNA 诱导的基因沉默复合物 (RNA-induced silencing complex， RISC) 中， 形成 RISC 复合物， RISC 以 siRNA 为模板特异 地识别其同源基因 mRNA 并对其进行递进式剪切， 形成强有效的瀑布效应， 诱导序列特异性 的 mRNA 降解， 细胞表现特定基因的缺陷表型。该策略可以将动脉粥样硬化病相关的基因关 闭， 而仅有一个碱基突变则丧失 。
10、RNA 干扰作用， 对正常细胞影响甚微， 特异性强。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种预防和治疗动脉粥样硬化病的 RNA 干扰药 说 明 书 CN 101011575 B2/6 页 4 物， 通过 RNA 干扰技术， 针对 EMMPRIN 的 mRNA 序列构建的 siRNA， 能有效抑制单核 / 巨噬细 胞中 EMMPRIN 基因的蛋白表达。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明通过如下技术方案实现 ： 0007 预防和治疗动脉粥样硬化病的药物， 该药物含有适于通过 RNA 干扰抑制胞外基质 金属蛋白酶诱导因子 (EMMPRIN) 基因表达的双链核糖核酸 (dsRNA。
11、)。 0008 优选的， dsRNA 的 S1 链显示出一个能至少部分地与少于 25 个连续核苷酸构成的 EMMPRIN 基因互补的的区域。 0009 dsRNA 的互补区域可按照递升的优选顺序， 具有 19 24 个， 20 23 个， 20 或 21 个核苷酸， 且特别优选具有 20 或 21 个核苷酸， 拥有此结构的 dsRNA 在抑制 EMMPRIN 基因时 尤其有效。dsRNA 的 S1 链可按照递升的优选顺序， 具有少于 30 个， 少于 25 个， 19 23 个， 特别优选 21 个核苷酸。 0010 当 dsRNA 的至少一个末端具有一个由 1 4 个， 特别是 2 或 3 。
12、个核苷酸构成的单 链突出端时是非常有利的。除 S1 链外， dsRNA 优选地还具有 S2 链， 当本发明的 dsRNA 的 S1 链和 S2 链都具有 21 个核苷酸， 且该两条链的 3 末端都具有一个由 2 个核苷酸组成的单链 突出端时， 包含该 dsRNA 的药物是特别有效的。S1 链可与基因的初级或加工的 RNA 转录本 互补。最佳地， 本发明的 dsRNA 由具有 SEQ ID NO.1 序列的 S1 链和具有 SEQ ID NO.2 序列 的 S2 链构成， 或由具有 SEQ ID NO.3 序列的 S1 链和具有 SEQID NO.4 序列的 S2 链构成， 或 由具有 SEQ 。
13、ID NO.5 序列的 S1 链和具有 SEQ ID NO.6 序列的 S2 链构成。 0011 本发明的药物施用方式可以是口服、 全身施用 ( 例如， 透过皮肤、 鼻吸入或者用栓 剂 ) 或肠胃外施用 ( 例如， 肌肉内、 静脉内或皮下 )。 0012 本发明的药物也可被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的 水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和胶囊之类的药物， 可通过常规方法进行制备。 针 剂、 溶液、 片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外， 本发明的预防和治疗动脉粥样硬化病的 药物还可与其他治疗剂一起使用。 0013 本发明的预防和治疗动脉粥样硬化病的RNA干扰药物能有。
14、效抑制单核/巨噬细胞 中 EMMPRIN 基因的表达， 且在巨噬源性泡沫细胞中 EMMPRIN 表达被抑制后细胞内 MMP-9 的 蛋白表达明显减少， 这些实验证据为动脉粥样硬化病的治疗及急性冠脉事件的防治提供新 的治疗靶点和有效新药。 附图说明 0014 图 1 是本发明的 EMMPRIN-siRNA 电转染人单核细胞 THP-1 细胞株 24h 后 10 倍光 镜下观察转染效率图 ； 0015 图 2 是本发明的 EMMPRIN-siRNA 电转染人单核细胞 THP-1 细胞株 24h 后 10 倍荧 光显微镜下观察转染效率图 ； 0016 图 3 是 Real-time PCR 检测本发。
15、明的 EMMPRIN-siRNA 抑制 THP-1 细胞中 EMMPRIN 基因表达柱状图 ； 0017 图 4 是 Western Blot 检测本发明的 EMMPRIN-siRNA 抑制 THP-1 细胞中 EMMPRIN 蛋白的 Western Blot 结果图 ； 0018 图 5 是图 4 的柱状统计图。 说 明 书 CN 101011575 B3/6 页 5 具体实施方式 0019 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 0020 实施例 1 细胞培养和电转染 0021 针对 EMMPRIN 基因 mRNA 的 siRNA 的设计合成过程是， 在 GenBank 中查出人。
16、源 EMMPRIN mRNA 的序列 (NM_001728、 NM_198589、 NM_198590、 NM_198591)， 分析其共同编 码区序列， 由 Ambion 公司在线 siRNA 设计并化学合成三对 siRNA 序列， 分别是 siRNA-A、 siRNA-B、 siRNA-C， siRNA-A 由 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.2 序列构成， siRNA-B 由 SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.4 序列构成， siRNA-C 由 SEQ ID NO.5 和 SEQ ID NO.6 序列构成。另设 随机序列作为阴性对照 ( 对照 -siRNA)。
17、。 0022 THP-1 人单核细胞株 ( 购自中科院上海细胞所 )， 采用含 10小牛血清 (PAA， Labs， 奥地利 )， 2 Hepes， 1双抗的 RPMI 1640 培养基 (PAA， Labs， 奥地利 ) 培养， 调整细胞数 至 1106/ml， 按照 Ambion 公司电转染 protocol(siPORTTM siRNAElectroporation Kit) 将 siRNA-A， siRNA-B， siRNA-C 及对照 -siRNA 电转染至 THP-1 单核细胞， 转染后的细胞移入 60mm 培养皿， 加入无双抗含10小牛血清RPMI 1640培养基继续培养， 24。
18、小时后分别于10倍光镜 ( 图 1) 和 10 倍荧光显微镜 ( 图 2) 下观察转染效率， 结果显示转染效率高达 90以上。 0023 实施例 2mRNA 水平检测 RNAi 对 EMMPRIN 基因表达的影响 0024 采用实时定量 (Real time)PCR 进行检测， 具体步骤如下 ： 0025 1)siRNA 转染 THP-1 细胞 24 小时后， TRIzol 法抽提总 RNA。抽提时， 培养细胞 吸到离心管内 600gx5min 离心， PBS 吹洗一次， 再 600gx5min 离心， 加 1ml TRIzol( 购自 Invitrogen 公司 )， 在旋涡震荡器上混匀。再。
19、加入大约 1/5 体积的氯仿， 上下颠倒充分混匀 30 秒左右， 室温下静置 3 分钟。然后， 4， 12000g 离心 15 分钟后小心将上清液转入新的 1.5ml离心管， 加入等体积的异丙醇， 轻轻颠倒混匀， 室温静置10分钟。 再4， 12000g离心 10 分钟后， 去上清， 向沉淀中加入 2/5 体积的 70乙醇， 4， 7500g 离心 5 分钟。去上清， 沉 淀室温晾干后加入适量无 RNA 酶的水充分溶解， 测定 A260 和 A280 值。 0026 2) 取总 RNA 1g， 加入 20L 逆转录反应体系， 用 Omniscript 逆转录试剂盒 (Qiagen公司)进行逆转。
20、录反应， 所有操作在冰浴下进行， 待彻底混合后， 37孵育60分钟， 4终止反应。 0027 3) 根据 Oligo 引物软件合成人 EMMPRIN、 PBGD( 胆色素原脱氨酶 ) 寡核苷酸引 物， 由北京奥科生物技术公司合成， EMMPRIN 引物扩增产物为 164bp， PBGD 引物扩增产物为 200bp。 0028 EMMPRIN(F) ： 上游引物为 5 -tcc tgg gca tcg tgg ct-3 (SEQ ID NO ： 7) ； 0029 EMMPRIN(R) ： 下游引物为 5 -cct ctg gcg gac gtt ctt-3 (SEQ ID NO ： 8)。 0。
21、030 PBGD(F) ： 5 -atc gtg cgt gac att aag g-3 (SEQ ID NO ： 9) ； 0031 PBGD(R) ： 5 -aca gga ctc cat gcc cag g-3 (SEQ ID NO ： 10)。 0032 使 用 TAKARA 公 司Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)Kit 进 行 Real-timePCR， 以 PBGD 作内对照， 反应混合物中各成分为 ： PBGD(F)、 PBGD(R)、 EMMPRIN(F)、 EMMPRIN(R)、Premix Ex TaqTM(2Conc.)、 ROX Re。
22、ference Dye(50Conc.) 和 1LcDNA 模板稀释液， 最后补充 ddH2O 使反应体系为 10L。10l 反应体系包括 ： 说 明 书 CN 101011575 B4/6 页 6 0033 0034 冰浴条件下操作， 彻底混合后放入 ABI7900HT 型荧光定量 PCR 仪， 反应 程序如下 ： (1)50 2min， (2)95 10min， (3)95 15s， 60 60s， 40 个循环， (4)95 15s， 60 15s， 95 15s。反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线， 以目的基因 与 PBGD 拷贝数比值做相对定量分析进行。。
23、 0035 4)Real-time PCR 结果显示， THP-1 细胞经 siRNA 转染 24 小时后， 三条 siRNA 与对 照 -siRNA 相比， EMMPRIN mRNA 表达均被抑制大于 70 ( 图 3)， 在图中，“*” 指 P 0.01， 统计数据见下表， 所有数据是每个实验重复 3 次取的均值， 用均数 标准差表示， 并用 SIGMAPLOT 统计软件对数据进行单因素方差分析 (ANOVA)、 t 检验 (t-test) 处理， 其中， P 0.05 为有显著性差异， P 0.01 为有高度显著性差异。 0036 0037 实施例 3 蛋白质水平检测 RNAi 对 EM。
24、MPRIN 基因表达的影响 0038 THP-1细胞转染siRNA后培养至72小时提取总蛋白， 再采用Western Blot进行检 测， 具体步骤是 ： 用 4预冷裂解液裂解细胞， 蛋白浓度用 BCA 法测定， 取 30ug 总蛋白样品 与上样缓冲液变性后经 10 SDS-PAGE 行垂直电泳， 室温 200V60min， 4 100V120min 转膜， 5牛奶封闭， 室温 1h， 结合一抗 ( 兔抗人 EMMPRIN 单克隆抗体， 购自 Zymed 公司， 用 封闭液 1 1000 稀释 )， 温和振荡 4过夜， 结合二抗 ( 驴抗兔多克隆抗体， 购自 Amersham 公司， 用封闭液。
25、 1 4000 稀释 )， 室温 1h。感光、 洗片， 蛋白条带扫描后进行光密度分析， 图 4 为 Western Blot 结果图， 其中， -actin 为对照内参， EMMPRIN 蛋白的分子量大小约 为5070KD， 光密度分析的数据是由每个实验重复3次取得的均值， 并用均数标准差表 示， 且用SIGMAPLOT统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)、 t检验(t-test)处理， P0.05 为有显著性差异， P 0.01 为有高度显著性差异。Western Blot 结果经统计分析得 ： 与对 照 -siRNA 相比， siRNA-A 的 P 值大于 0.05， 没有显著性差异，。
26、 而 siRNA-B 和 siRNA-C 都是 P 0.05( 见图 5)， 说明 siRNA-B 和 siRNA-C 能有效抑制 THP-1 细胞中 EMMPRIN 蛋白表达， 尤 说 明 书 CN 101011575 B5/6 页 7 其是 siRNA-B， 它的抑制效果最显著。在图 5 中，“*” 指 P 0.05，“*” 指 P 0.01。 0039 序列表 0040 上海交通大学医学院附属新华医院 0041 预防和治疗动脉粥样硬化病的 RNA 干扰药物 0042 NP-10421 0043 10 0044 1 0045 21 0046 RNA 0047 智人 (Homo sapien。
27、s) 0048 1 0049 gccaaugcug ucugguugct t 21 0050 2 0051 21 0052 RNA 0053 智人 (Homo sapiens) 0054 2 0055 gcaaccagac agcauuggct t 21 0056 3 0057 21 0058 RNA 0059 智人 (Homo sapiens) 0060 3 0061 gguucuucgu gaguuccuct t 21 0062 4 0063 21 0064 RNA 0065 智人 (Homo sapiens) 0066 4 0067 gaggaacuca cgaagaacct g 21 。
28、0068 5 0069 21 0070 RNA 0071 智人 (Homo sapiens) 0072 5 0073 agccaaugcu gucugguugt t 21 0074 6 0075 21 0076 RNA 说 明 书 CN 101011575 B6/6 页 8 0077 智人 (Homo sapiens) 0078 6 0079 caaccagaca gcauuggcut c 21 0080 7 0081 17 0082 DNA 0083 人工序列 0084 0085 misc_feature 0086 引物 0087 7 0088 tcc tgg gca tcg tgg ct 。
29、17 0089 8 0090 19 0091 DNA 0092 人工序列 0093 0094 misc_feature 0095 引物 0096 8 0097 cct ctg gcg gac gtt ctt g 19 0098 9 0099 19 0100 DNA 0101 人工序列 0102 0103 misc_feature 0104 引物 0105 9 0106 atc gtg cgt gac att aag g 19 0107 10 0108 19 0109 212DNA 0110 人工序列 0111 0112 misc_feature 0113 引物 0114 10 0115 aca gga ctc cat gcc cag g 19 说 明 书 CN 101011575 B1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101011575 B2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101011575 B3/3 页 11 图 5 说 明 书 附 图 。