本申请涉及2003年7月15日提交的美国临时申请系列号 60/487,43l并要求其优先权，其公开内容通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及结合神经生长因子(NGF)的人单克隆抗体。本发明还 描述了用以治疗疼痛和疼痛相关疾病的组合物和方法。
发明背景
美国每天有两百多万人因慢性疼痛而致残(Jessell和Kelly，1991， “Pain and Analgesia”，PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE，第3版， (Kandel，Schwartz和Jessell编辑)，Elsevier，New York)。不幸的是，目 前的疼痛治疗只是部分有效，而且这些治疗中有许多本身会导致人虚 弱或者导致危险的副作用。例如，虽然非类固醇抗炎药(“NSAID”)， 如阿司匹林、布洛芬和吲哚美辛对炎性疼痛有中度的效果，但它们同 时也是肾脏毒素，剂量高时往往会导致胃肠刺激、溃疡、出血和精神 错乱。用阿片类治疗的患者也常常遭遇精神错乱，且长期使用阿片类 与伴随出现药物耐受性和依赖性。局部麻醉剂如利多卡因和美西律在 抑制疼痛的同时导致正常感觉的丧失。
疼痛是一种基于从周围环境接受并由神经系统传递和解释的信 号的感知(有关综述参见Millan，1999，Prog.Neurobiol.57：1-164)。有害 的刺激如热觉和触觉会促使皮肤中的专用感受器将信号传输到中枢神 经系统(“CNS”)。这个过程称作伤害感受，介导这个过程的周围感觉 神经元即伤害感受器。取决于来自伤害感受器的信号强度以及CNS对 该信号的提取和解析，人可能会或者可能不会将有害刺激感受为疼痛 刺激。当一个人对疼痛的感知与刺激的强度正确校准时，疼痛能发挥 其预期的保护功能。但是，某些类型的组织损害会导致称为痛觉过敏 或早期痛觉(pronociception)的现象，其中相对无害的刺激被感知为强烈 疼痛，这是因为人的疼痛阈已降低。炎症和神经损害均会引起痛觉过 敏。受炎症疾病影响的人往往会体验到疼痛感觉增强，所述炎症例如 晒伤、骨关节炎、结肠炎、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管病(其 包括类风湿性关节炎和狼疮)等。同样，创伤、外科手术、截肢、脓肿、 灼痛、胶原血管病、脱髓鞘病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、 中风、丘脑疼痛综合征、糖尿病、疱疹感染、获得性免疫缺陷综合征 (“AIDS”)、毒素和化学疗法会造成神经损伤，导致过度疼痛。
随着对伤害感受器在正常和痛觉过敏条件下转导外界信号的机 制的认识加深，可以把目标指向牵涉痛觉过敏的过程，以抑制疼痛阈 的下降，从而减少所体验到的疼痛的量。
已显示神经营养因子在生理和病理疼痛的传递中发挥重要的作 用。神经生长因子(NGF)看来似乎特别重要(有关综述参见McMahon， 1996，Phil.Trans.R.Soc.Lond.351：431-40；及Apfel，2000，The Clinical Jourstal of Pain 16：S7-S11)。已显示局部性和全身给予NGF能引起痛 觉过敏和异常性疼痛(Lewin等，1994，Eur.JNeurosci.6：1903-1912)。在 人类中静脉输注NGF产生全身肌痛，而局部给予时除了会引起全身效 应外，还会引起注射部位痛觉过敏和异常性疼痛(Apfel等，1998， Neurology 51：695-702)。还有大量的证据暗示内源NGF牵涉到以疼痛 为主要特征的疾病。例如，出现周围神经损伤之后，NGF在背根神经 节(DRG)神经膜细胞中被上调至少2个月，已报告在患有各种关节炎 模型的动物关节中NGF水平提高(例如Aloe等，1993，Growth Factors 9：149-155)。在人类中，患有类风湿性关节炎或者其他类型关节炎的患 者的滑液中NGF水平提高(例如Aloe等，1992，Arthritis和Rheumatism 35：351-355)。此外，还已证明，在神经性和慢性炎性疼痛模型中，对 NGF功能的拮抗能防止痛觉过敏和异常性疼痛。例如，神经性疼痛的 动物模型(例如神经干或脊神经结扎)中，全身注射抗NGF中和抗体能 防止异常性疼痛和痛觉过敏(Ramer等，1999，Eur.J.Neurosci.11：837- 846；及Ro等，1999，Pain 79：265-274)。本领域公知的抗NGF抗体的 实例包括例如PCT公开WO 01/78698、WO 01/64247、WO 02/096458 和WO 2004/032870；美国专利第5,844,092号、第5,877,016号和第 6,153,189号；Hongo等，2000，Hybridoma 19：215-227；Hongo等，1993， Cell.Mol.Biol.13：559-568；及GenBank检索号U39608、U39609、 L17078或L17077。
显然，需要安全有效的新型疼痛治疗法，特别是把目标指向小分 子的疼痛介体或恶化体(exacerbator)如NGF的治疗法。
发明概述
本发明提供在治疗上用于控制疼痛的新型人单克隆抗体。具体的 说，本发明提供结合神经生长因子(NGF)的单克隆抗体。优选所述单克 隆抗体是人单克隆抗体，能中和NGF的生物活性，可用于改善NGF 介导的疼痛反应的效应。本发明还提供生产本发明单克隆抗体、最优 选还将单克隆抗体分泌到细胞培养基中的细胞。本发明抗体除了在治 疗和控制疼痛中的用途之外，还用于治疗神经病性反应和炎性疼痛相 关反应。
本发明进一步提供包含抗体Fc区序列和一个或多个标识为以下 的序列的融合蛋白：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和 SEQ ID NO：79-130。可使用例如在国际专利申请公开WO 00/24782中 描述的方法制备这种分子，所述专利申请通过引用结合到本文中。这 种分子可例如在哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)或者细菌细胞 (例如大肠杆菌细胞)中表达。
在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选单克隆抗 体、最优选人抗体和人单克隆抗体，其中重链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免 疫功能性免疫球蛋白片段，重链的可变区包含SEQ ID NO：10表示的 氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。优选 重链包含SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列。
在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选人抗体， 更优选单克隆抗体，最优选人单克隆抗体，其中重链包含选自IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE重链恒定区或其任何等位变异的 重链恒定区(如在Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunologica1 Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出 版号91-3242中所讨论，该文献通过引用结合到本文中)，重链的可变 区包含SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段。优选本发明抗体包含SEQ ID NO：4表示的 IgG2重链恒定区氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球 蛋白片段。
在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，优选人抗体， 更优选单克隆抗体，最优选人单克隆抗体，其中轻链包含SEQ ID NO： 8表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，轻链可变区包含SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列，或其抗原结 合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明抗体包含重链和轻链，其中重链可变区包含 SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性 免疫球蛋白片段。在其他方面，轻链可变区包含SEQ ID NO：12表示 的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。在 另外的方面，重链包含任何SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋 白片段。在还其他方面，轻链包含任何SEQ ID NO：16、20、24表示 的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本发明还提供特异性结合NGF的抗体，其中重链包含的可变区包 含SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能 性免疫球蛋白片段，轻链包含的可变区包含SEQ ID NO：12表示的氨 基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段。
本发明进一步提供特异性结合NGF的分离人抗体，其中所述抗体 包含：
(a)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO：79 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：80 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段；
(b)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO：81 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：82 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段；
(c)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO：83 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：84 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段；或者
(d)具有重链可变区的重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO：86 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，和具有轻链可变区的轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：87 表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段。
在某些方面，本发明还提供包含重链和轻链的抗体，其中重链包 含重链可变区，且其中重链可变区包含与SEQ ID NO：10表示的氨基 酸序列有至少75％、优选80％、更优选至少85％、甚至更优选至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、最优选约 99％一致性的序列，其中轻链包含轻链可变区，且其中轻链可变区包 含与SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列有至少80％、优选至少85％、 更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 最优选约99％一致性的序列，其中所述抗体特异性结合NGF。
本发明还提供特异性结合NGF的抗体，其中重链包含SEQ ID NO： 14表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片 段，轻链包含SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段 或免疫功能性免疫球蛋白片段。
在某些方面，本发明提供包含重链和轻链的抗体，其中重链包含 重链可变区，且其中重链可变区包含与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18 或SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列有至少75％、优选80％、更优选 至少85％、甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、最优选约99％一致性的序列，其中轻链包含轻链可变区， 且其中轻链可变区包含与SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列有至少 80％、优选至少85％、更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、最优选约99％一致性的氨基酸序列，其中所述抗体 特异性结合NGF。
本发明还提供单链抗体、单链Fv抗体、F(ab)抗体、F(ab)’抗体和 F(ab’)2抗体。
在具体方面，本发明提供包含SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列 或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的轻链。
另外，本发明提供包含任何SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18或 SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免 疫球蛋白片段的重链。
本发明还涉及特异性结合NGF的分离人抗体，其中所述抗体包含 (a)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区和人重链CDR3 区；及(b)人轻链构架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链 CDR3区。在某些方面，人重链CDR1区可以是SEQ ID NO：22所示 的称为4D4的单克隆抗体(mAb)的重链CDR1区，人轻链CDR1区可 以是SEQ ID NO：24所示的mAb 4D4的轻链CDR1区。在其他方面， 人重链CDR2区可以是SEQ ID NO：18所示的mAb 4D4的重链CDR2 区，人轻链CDR2区可以是SEQ ID NO：20所示的mAb 4D4的轻链 CDR2区。在还其他方面，人重链CDR3区是SEQ ID NO：14所示的 mAb 4D4的重链CDR3区，人轻链CDR3区是SEQ ID NO：16所示的 mAb 4D4的轻链CDR3区。
本发明还提供特异性结合神经生长因子的分离人抗体，所述分离 人抗体包含重链和轻链，其中重链包含的重链可变区包含SEQ ID NO： 10、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85 或SEQ ID NO：87表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能 性免疫球蛋白片段。
本发明也提供特异性结合NGF的分离人抗体，所述分离人抗体包 含重链和轻链，其中轻链包含的轻链可变区包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO： 131表示的氨基酸序列，或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白 片段。
本发明抗体的特征为拮抗与NGF多肽相关的至少一种体外和/或 体内活性的能力。优选本发明提供能与NGF多肽高亲和性结合的分离 抗人NGF人抗体，其中所述抗体结合人NGF多肽并以约50×10-12M 或更低的解离常数(KD)(用KinExA测定)与人NGF多肽解离，或者在 体外中和试验中所述抗体以约1×10-8M或更低的IC50抑制NGF诱导 的存活。
在优选的实施方案中，本发明提供具有以下特征的分离抗人NGF 人抗体：
a)在体外中和试验中以约1×10-9M或更低的IC50抑制NGF诱导 的存活；
b)具有包含SEQ ID NO：14氨基酸序列的重链CDR3；
c)具有包含SEQ ID NO：16氨基酸序列的轻链CDR3。
本发明还提供以高亲和性特异性结合NGF的分离人抗体或其抗 原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗体或者片段以 约1×10-9或更低的KD与人NGF多肽解离，在标准的体外试验中以约 1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活性，且其中所述抗体或者 片段包含的重链可变区包含：
a)包含下式氨基酸序列的CDR1区：
a1a2a3a4a5
其中：
a1是极性亲水性氨基酸残基；a2是芳族氨基酸残基；a3是脂族、 极性疏水性、芳族氨基酸残基；a4是中性疏水性或脂族氨基酸残基； a5是脂族或极性亲水性氨基酸残基；
b)包含下式氨基酸序列的CDR2区：
b1b2b3b4b5b6b7b8b9b10b11b12b13b14b15b16b17
其中：
b1是脂族、极性疏水性或芳族氨基酸残基；b2是脂族琉水性氨基 酸残基；b3是极性亲水性或芳族氨基酸残基；b4是极性亲水性、疏水 性或芳族氨基酸残基；b5-b9独立是极性亲水性或脂族氨基酸残基；b10是极性亲水性、芳族或脂族氨基酸残基；b11是芳族或疏水性氨基酸残 基；b12是脂族疏水性或极性亲水性氨基酸残基；b13是脂族、疏水性或 极性亲水性氨基酸残基；b14和b16独立是极性亲水性氨基酸残基；b15是脂族或芳族疏水性氨基酸残基；b17是脂族酸性氨基酸残基；
c)包含下式氨基酸序列的CDR3区：
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
其中：
c1不存在或者是脂族氨基酸残基；c2不存在或者是极性亲水性或 芳族疏水性氨基酸残基；c3和c4独立是不存在或者极性亲水性、芳族 疏水性或脂族氨基酸残基；c5不存在或者是极性亲水性、脂族或芳族 氨基酸残基；c6不存在或者是极性亲水性或脂族氨基酸残基；c7是极 性亲水性或脂族氨基酸残基；c8是极性亲水性、疏水性或芳族氨基酸 残基；c9是极性亲水性、脂族或芳族疏水性氨基酸残基；c10是极性亲 水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基；c11-c13独立是极性亲水 性或芳族疏水性氨基酸残基；c14是脂族或芳族疏水性氨基酸残基；c15是极性亲水性或中性疏水性氨基酸残基；c16不存在或者是极性亲水性 氨基酸残基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基。
在一个方面，a1是极性亲水性氨基酸残基；a2是芳族疏水性氨基 酸残基；a3是脂族疏水性氨基酸残基；a4是中性疏水性；a5是极性亲 水性氨基酸残基；b1是脂族或芳族氨基酸残基；b2是Ile；b3是极性亲 水性氨基酸残基；b4是极性亲水性或芳族氨基酸残基；b5-b9独立是极 性亲水性或脂族氨基酸残基；b10是脂族氨基酸残基；b11是Tyr：b12是脂族疏水性氨基酸残基；b13是脂族或极性亲水性氨基酸残基；b14和b16独立是极性亲水性氨基酸残基；b15是脂族疏水性氨基酸残基； b17是脂族酸性氨基酸残基；c1不存在或者是脂族氨基酸残基；c2不存 在或者是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；c3和c4独立是不存在 或者极性亲水性、芳族疏水性或脂族氨基酸残基；c5不存在或者是极 性亲水性氨基酸残基；c6不存在或者是极性亲水性或脂族氨基酸残 基；c7是极性亲水性或脂族氨基酸残基；c8是极性亲水性、疏水性或 芳族氨基酸残基；c9是极性亲水性、脂族或芳族疏水性氨基酸残基； c10是极性亲水性、芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基；c11-c13独立 是极性亲水性或芳族疏水性氨基酸残基；c14是脂族或芳族疏水性氨基 酸残基；c15是极性亲水性或中性疏水性氨基酸残基；c16不存在或者是 极性亲水性氨基酸残基；c17是芳族疏水性或脂族疏水性氨基酸残基。
在一个具体方面，a1是Ser、Asp或Thr；a2是Tyr；a3是Ala、Ser、 Trp或Gly；a4是Met或Ile；a5是His、Gly或Asn；b1是Tyr、Gly、 Ile或Asp；b2是Ile；b3是Ser、Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro； b5是Ser、Asn或Gly；b6是Ser、Arg、Asp或Gly；b7是Ser、His或 Gly；b8是Ser、Ile、Asp或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly、 Lys或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp、Gly或Pro；b14是Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是 脂族氨基酸残基；c2不存在或是Tyr；c3和c4独立是不存在、Tyr、Asn、 Val或Glu；c5是不存在、Ser、Gly或Trp；c6是不存在、Ser、Gly、 Glu或Leu；c7是Gly、Arg或Asp；c8是Trp、Pro、Ser或Thr；c9是His、Gly或Tyr；c10是Val、Tyr或Arg；c11-c13独立是Ser、Phe、 Tyr、Asp或Asn；c14是Phe、Val或Gly；c15是Met或Asp；c16是不 存在、Asp或Asn；c17是Tyr或Val。
在另一个具体方面，a1是Ser或Asp；a2是Tyr；a3是Ala或Ser； a4是Met或Ile；a5是His或Asn；b1是Tyr或Gly；b2是Ile；b3是Ser、 Thr、Tyr或Asn；b4是Trp、Arg或Pro；b5是Ser或Asn；b6是Ser 或Arg；b7是His或Gly；b8是Ile或Thr；b9是Leu、Ile或Thr；b10是Gly或Phe；b11是Tyr；b12是Ala或Ser；b13是Asp或Gly；b14是 Ser；b15是Val或Phe；b16是Lys或Gln；b17是Gly；c1不存在或是 Gly；c2不存在或是Tyr；c3和c4独立是不存在、Tyr、Gly或Val；c5不存在或是Ser；c6是Ser或Gly；c7是Gly或Arg；c8是Trp或Pro； c9是His、Gly或Tyr；c10是Val或Tyr；c11-c13独立是Ser、Tyr、Phe 或Asp；c14是Phe或Val；c15是Met或Asp；c16不存在或是Asp；c17是Tyr或Val。
在其他具体方面：
a)重链CDR1具有SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列，重链CDR2 具有SEQ ID NO：18表示的氨基酸序列，重链CDR3具有SEQ ID NO：14表示的氨基酸序列；
b)重链CDR1具有SEQ ID NO：92表示的氨基酸序列，重链CDR2 具有SEQ ID NO：93表示的氨基酸序列，重链CDR3具有SEQ ID NO：94表示的氨基酸序列；
c)重链CDR1具有SEQ ID NO：98表示的氨基酸序列，重链CDR2 具有SEQ ID NO：99表示的氨基酸序列，重链CDR3具有SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列；
d)重链CDR1具有SEQ ID NO：104表示的氨基酸序列，重链 CDR2具有SEQ ID NO：105表示的氨基酸序列，重链CDR3具有 SEQ ID NO：106表示的氨基酸序列；
e)重链CDR1具有SEQ ID NO：110表示的氨基酸序列，重链 CDR2具有SEQ ID NO：111表示的氨基酸序列，重链CDR3具有 SEQ ID NO：112表示的氨基酸序列；
f)重链CDR1具有SEQ ID NO：116表示的氨基酸序列，重链 CDR2具有SEQ ID NO：117表示的氨基酸序列，重链CDR3具有 SEQ ID NO：118表示的氨基酸序列。
本发明还提供特异性结合NGF的分离人抗体或其抗原结合片段 或免疫功能性免疫球蛋白片段，其中所述抗体或其片段包含的轻链可 变区包含：
a)包含下式氨基酸序列的CDR1区：
a1a2a3a4a5a6a7a8a9a10a11a12
其中：
a1是极性亲水性氨基酸残基；a2、a11和a12独立是脂族或疏水性氨 基酸残基；a3、a5、a7和a8独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨基酸 残基；a4是极性亲水性氨基酸残基；a6是脂族或疏水性氨基酸残基；a9不存在，或是脂族或极性亲水性氨基酸残基；a10是脂族、芳族或疏水 性氨基酸残基；
b)包含下式氨基酸序列的CDR2区：
b1b2b3b4b5b6b7
其中：
b1是脂族、极性疏水性或疏水性氨基酸残基；b2是脂族或疏水性 氨基酸残基；b3和b4独立是极性亲水性、脂族或疏水性氨基酸残基； b5是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；b6是极性亲水性或脂族疏 水性氨基酸残基；b7是极性亲水性氨基酸残基；
c)包含下式氨基酸序列的CDR3区：
c1c2c3c4c5c6c7c8c9c10c11c12c13c14c15c16c17
其中：
c1和c2独立是极性亲水性氨基酸残基；c3是极性亲水性、脂族或 疏水性氨基酸残基；c4、c5和c6独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨 基酸残基；c7不存在或者是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；c8是极性亲水性或疏水性氨基酸残基；c9是极性亲水性氨基酸残基，且 其中所述抗体或者片段以约1×10-9或更低的KD与人NGF多肽解离， 在标准的体外试验中以约1×10-8M或更低的IC50中和人NGF生物活 性。
在一个方面，a1、a3、a4、a7和a8独立是极性亲水性氨基酸残基； a2、a6、a11和a12独立是脂族疏水性氨基酸残基；a5是极性亲水性或脂 族氨基酸残基；a9不存在，或是脂族或极性亲水性氨基酸残基；a10是 脂族或芳族氨基酸残基；b1是脂族、极性疏水性或疏水性氨基酸残基； b2是脂族疏水性氨基酸残基；b3、b4和b7独立是极性亲水性氨基酸残 基；b5和b6独立是极性亲水性或脂族疏水性氨基酸残基；c1和c2独立 是极性亲水性氨基酸残基；c3是极性亲水性、脂族或疏水性氨基酸残 基；c4、c5和c6独立是脂族、极性亲水性或疏水性氨基酸残基；c7不 存在或是脂族疏水性氨基酸残基；c8是疏水性氨基酸残基；c9是极性 亲水性氨基酸残基。
在一个具体方面，a1、a3、a4和a7分别是Arg、Ser、Gln和Ser； a2是Ala；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly； a10是Ala、Tyr、Trp或Phe；b1是Asp、Gly、Ala或Val；b2和b3分别 是Ala和Ser；b4是Ser或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln； b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、 Gly或Ser；c5是Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、 Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
在另一个具体方面，a1、a2、a3、a4和a7分别是Arg、Ala、Ser、 Gln和Ser；a5是Gly或Ser；a8是Ser或Ile；a9是不存在、Ser或Gly； a10是Ala或Tyr；b1是Asp或Gly；b2和b3分别是Ala和Ser；b4是Ser 或Asn；b5是Leu或Arg；b6是Glu、Ala或Gln；b7是Ser或Thr；c1和c2是Gln；c3是Phe、Tyr、Arg或Ala；c4是Asn、Gly或Ser；c5是 Ser或Asn；c6是Tyr、Ser、Trp或Phe；c7是不存在、Pro或His；c8是Leu、Trp、Tyr或Arg；c9是Thr。
在其他具体方面：
a)轻链CDR1具有SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列，轻链CDR2 具有SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列；
b)轻链CDR1具有SEQ ID NO：95表示的氨基酸序列，轻链CDR2 具有SEQ ID NO：96表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有SEQ ID NO：97表示的氨基酸序列；
c)轻链CDR1具有SEQ ID NO：101表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：102表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：103表示的氨基酸序列；
d)轻链CDR1具有SEQ ID NO：107表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：108表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：109表示的氨基酸序列；
e)轻链CDR1具有SEQ ID NO：113表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：114表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：115表示的氨基酸序列；
f)轻链CDR1具有SEQ ID NO：119表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：120表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：121表示的氨基酸序列；
g)轻链CDR1具有SEQ ID NO：122表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：123表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：124表示的氨基酸序列；
h)轻链CDR1具有SEQ ID NO：125表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：126表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：127表示的氨基酸序列；
i)轻链CDR1具有SEQ ID NO：128表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：129表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：130表示的氨基酸序列；
j)轻链CDR1具有SEQ ID NO：132表示的氨基酸序列，轻链 CDR2具有SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列，轻链CDR3具有 SEQ ID NO：134表示的氨基酸序列。
同时本发明的一部分是编码新型抗人NGF人抗体的多核苷酸序 列、包含编码抗人NGF人抗体的多核苷酸序列的载体、用掺入编码抗 人NGF人抗体的多核苷酸的载体转化的宿主细胞、包含抗人NGF人 抗体的制剂以及制备和使用所述制剂的方法。
本发明还提供检测生物样品中的NGF水平的方法，所述方法包括 将样品与本发明抗体或其抗原结合片段接触的步骤。本发明的抗NGF 抗体可应用于任何已知的分析测定方法，如竞争性结合测定、直接和 间接夹心测定、免疫沉淀测定及酶联免疫吸附测定(ELISA)(参见Sola， 1987，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147-158页， CRC Press，Inc.)，以对NGF进行检测和定量。本发明抗体能以适合于 所采用的分析测定方法的亲和性结合NGF。
此外，本发明提供与NGF产生提高或者与对NGF敏感性提高有 关的疾病的治疗方法，所述方法包括将药学有效量的包含至少一种本 发明抗体或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段的药物组合 物给予有需要个体的步骤。
由某些优选实施方案的以下更详细描述以及权利要求书，本发明 具体的优选实施方案将变得显而易见。
附图简述
图1描绘的图显示在基于DRG神经元的中和生物测定中，从杂 交瘤条件培养基纯化的4D4单克隆抗体对NGF活性的中和作用。
图2描绘的图显示由人NGF活性刺激的VR1表达，以及在基于 DRG神经元的中和生物测定中，从杂交瘤条件培养基纯化的抗NGF 单克隆抗体(4D4)对NGF活性的中和作用。
图3描绘的图显示在基于DRG神经元的中和生物测定中，在滚 瓶(R)或在旋动瓶(S)培养的细胞中表达为IgG1或IgG2的瞬时表达重组 抗NGF 4D4单克隆抗体对NGF活性的中和作用。
图4描绘神经营养蛋白的序列比对。序列上方的编号和二级结构 元件指的是成熟人NGF。保守残基用星号标示，具有较低序列同源性 的区域用阴影标示。人类NGF是SEQ ID NO：135；小鼠NGF是SEQ ID NO：136；BDNF是SEQ ID NO：137；NT3是SEQ ID NO：138。
图5显示14D10(SEQ ID NO：98)、6H9(SEQ ID NO：104)、7H2 (SEQ ID NO：110)、4G6(SEQ ID NO：116)、14D11(SEQ ID NO：92)和 4D4(SEQ ID NO：22)抗体的抗NGF CDR1重链比对和一致性百分率。
图6显示14D10(SEQ ID NO：99)、6H9(SEQ ID NO：105)、7H2 (SEQ ID NO：111)、4G6(SEQ ID NO：117)、14D11(SEQ ID NO：93)和 4D4(SEQ ID NO：18)抗体的抗NGF CDR2重链比对和一致性百分率。
图7显示14D10(SEQ ID NO：100)、6H9(SEQ ID NO：106)、7H2 (SEQ ID NO：112)、4G6(SEQ ID NO：118)、14D11(SEQ ID NO：94)和 4D4(SEQ ID NO：14)抗体的抗NGF CDR3重链比对和一致性百分率。
图8显示14D10(SEQ ID NO：95)、6H9(SEQ ID NO：107)、7H2 (SEQ ID NO：113)、4G6a(SEQ ID NO：119)、4G6b(SEQ ID NO：122)、 4G6c(SEQ ID NO：125)、4G6d(SEQ ID NO：128)、4G6e(SEQ ID NO： 132)、14D11(SEQ ID NO：95)和4D4(SEQ ID NO：24)抗体的抗NGF CDR1轻链比对和一致性百分率(各图中的20031028340指4G6a；各图 中的20031028351指4G6b；各图中的20031071526指4G6c；各图中 的20031028344指4G6d；各图中的20031000528指4G6e)。
图9显示14D10(SEQ ID NO：96)、6H9(SEQ ID NO：108)、7H2 (SEQ ID NO：114)、4G6a(SEQ ID NO：120)、4G6b(SEQ ID NO：123)、 4G6c(SEQ ID NO：126)、4G6d(SEQ ID NO：129)、4G6e(SEQ ID NO： 133)、14D11(SEQ ID NO：96)和4D4(SEQ ID NO：20)抗体的抗NGF CDR2轻链比对和一致性百分率(各图中的20031028340指4G6a；各图 中的20031028351指4G6b；各图中的20031071526指4G6c；各图中 的20031028344指4G6d；各图中的20031000528指4G6e)。
图10显示14D10(SEQ ID NO：97)、6H9(SEQ ID NO：109)、7H2 (SEQ ID NO：115)、4G6a(SEQ ID NO：121)、4G6b(SEQ ID NO：124)、 4G6c(SEQ ID NO：127)、4G6d(SEQ ID NO：130)、4G6e(SEQ ID NO： 134)、14D11(SEQ ID NO：97)和4D4(SEQ ID NO：16)抗体的抗NGF CDR3轻链比对和一致性百分率(各图中的20031028340指4G6a；各图 中的20031028351指4G6b；各图中的20031071526指4G6c；各图中 的20031028344指4G6d；各图中的20031000528指4G6e)。
图11显示14D10(SEQ ID NO：82)、6H9(SEQ ID NO：84)、7H2 (SEQ ID NO：86)、4G6a(SEQ ID NO：88)、4G6b(SEQ ID NO：89)、4G6c (SEQ ID NO：90)、4G6d(SEQ ID NO：91)、4G6e(SEQ ID NO：131)、 14D11(SEQ ID NO：80)和4D4(SEQ ID NO：12)抗体的抗NGF轻链比 对和一致性百分率(各图中的20031028340指4G6a；各图中的 20031028351指4G6b；各图中的20031071526指4G6c；各图中的 20031028344指4G6d；各图中的20031000528指4G6e)。
图12显示4D4(SEQ ID NO：10)、4G6(SEQ ID NO：87)、14D10 (SEQ ID NO：81)、14D11(SEQ ID NO：79)、7H2(SEQ ID NO：85)和6H9 (SEQ ID NO：83)抗体的抗NGF重链比对和一致性百分率。
某些优选实施方案的详细描述
本文在此使用的章节标题只是出于组织目的，不应解释为对所描 述的主题进行限制。对于任何目的，本申请中引用的所有参考文献通 过引用结合到本文中。
定义
对于重组DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如电穿孔 法、脂质转染法)可使用常规技术。酶反应和纯化技术可按照厂商说明 书或者按照本领域常用的方式或者按照本文的描述来进行。上述技术 和方法通常可按照本领域公知的方法，或者如本说明书中引用和讨论 的各种一般及更具体的参考文献所述来进行。参见例如Sambrook等， 2001，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第3版， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，对于任 何目的其通过引用结合到本文中。除非提供了具体的定义，本文描述 的涉及分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的术语及实验室方 法和技术，是本领域所公知和常用的。同样，可将常规技术用于化学 合成、化学分析、药物制备、制剂和传递以及患者的治疗。
依照本发明公开内容应用的以下术语，除非另有指明，应被理解 为具有以下含义：有关本发明抗体的词组“生物性质”、“生物特征” 和术语“活性”在本文中可互换使用，包括但不限于表位亲和性和特 异性(例如抗人NGF人抗体与人NGF的结合)、拮抗靶多肽的活性(例 如NGF活性)的能力、抗体的体内稳定性以及抗体的免疫原性性质。 本领域公认的抗体其他可鉴定生物性质或者特征包括例如交叉反应性 (通常也就是与靶多肽的非人类同源物或者与其他蛋白质或组织的交 叉反应性)，以及在哺乳动物细胞中保持蛋白质高表达水平的能力。上 述性质或特征可用本领域公认的技术来观察或测定，包括但不限于 ELISA、竞争性ELISA、表面等离子共振分析、体外和体内中和试验(例 如实施例2)以及用不同来源(包括人类、灵长类动物或者任何其他可能 需要的来源)的组织切片进行的免疫组织化学分析。抗人NGF人抗体 的具体活性和生物性质在下文实施例中有更详细的描述。
本文所用的术语“分离多核苷酸”应当指基因组、cDNA的多核 苷酸，或者合成起源的多核苷酸，或者它们的某些组合，由于其来源， 分离多核苷酸(1)与其中天然发现该分离多核苷酸的多核苷酸的全部 或一部分无关，(2)与其天然不相连的多核苷酸相连，或者(3)没有作为 更大序列的一部分天然出现。
本文所指的术语“分离蛋白”意指主题蛋白质(1)没有至少某些其 通常发现与其伴随的其他蛋白质，(2)基本没有相同来源(例如相同物种) 的其他蛋白质，(3)由不同物种的细胞表达，(4)与至少约50％的与其天 然相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分离，(5)不与该“分 离蛋白”天然相连的蛋白质部分(通过共价或非共价相互作用)相连，(6) 与其天然不相连的多肽(通过共价或非共价相互作用)有效相连，或者(7) 在自然界中不出现。这种分离蛋白可由基因组DNA、cDNA、mRNA 或合成起源的其他RNA，或者它们的任何组合来编码。优选分离蛋白 与见于其所在天然环境、会干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或者 其他用途)的蛋白质或多肽或其他污染物基本分开。
“分离”抗体是已被鉴定且已与其所在天然环境的组分分离和/ 或从中回收的抗体。抗体天然环境中的污染成分是会干扰其诊断或治 疗用途的物质，可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优 选的实施方案中，抗体将被纯化(1)至超过Lowry法测定的抗体的 95％(重量)，最优选超过99％(重量)，(2)至足以获得至少15个N端或 者内部氨基酸残基序列(通过使用旋杯式测序仪)的程度，(3)至均一(通 过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝染色或优选银染色进行SDS- PAGE)。分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体，因为至少一种抗体 的天然环境的组分不存在。
术语“多肽”或“蛋白质”指具有天然蛋白质序列的分子，即由 天然细胞和具体非重组细胞，或者遗传工程细胞或重组细胞产生的蛋 白质，包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或者缺失、插入和/ 或置换天然序列的一个或多个氨基酸的分子。术语“多肽”和“蛋白 质”明确包涵抗NGF抗体或缺失、插入和/或置换抗NGF抗体的一个 或多个氨基酸的序列。
术语“多肽片段”指具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部 缺失的多肽。在某些实施方案中，片段至少长为5至约500个氨基酸。 可以理解，在某些实施方案中，片段至少长为5、6、8、10、14、20、 50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸。 特别有用的多肽片段包括功能域，包括结合域在内。在抗NGF抗体的 情况中，有用的片段包括但不限于CDR区、重链或轻链的可变结构 域、抗体链的一部分或者正好是其包括两个CDR的可变区等等。
术语“特异性结合物”指特异性结合靶标的天然或非天然分子。 特异性结合物的实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物和 脂质。在某些实施方案中，特异性结合物是抗体。
术语“NGF的特异性结合物”指特异性结合NGF的任何部分的 特异性结合物。在某些实施方案中，NGF的特异性结合物是特异性结 合NGF的抗体。
本文所用术语“免疫功能性免疫球蛋白片段”指含有至少免疫球 蛋白重链和轻链的CDR的多肽片段。本发明的免疫功能性免疫球蛋白 片段能够结合抗原。在优选的实施方案中，抗原是特异性结合受体的 配体。在这些实施方案中，本发明的免疫功能性免疫球蛋白片段的结 合防止配体与其受体结合，阻断由于配体与受体结合而产生的生物反 应。优选本发明免疫功能性免疫球蛋白片段特异性结合NGF。最优选 所述片段特异性结合人NGF。
本文所用的应用于某个对象的“天然”指该对象可在自然界中找 到。例如，存在于可从自然界来源分离到的生物体(包括病毒)、且未 被人们有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。
术语“有效连接”指该术语所指的组分处于允许它们在合适的条 件下执行其固有功能的关系之中。例如，与蛋白质编码序列“有效连 接”的控制序列连接到该编码序列，从而在与控制序列的转录活性相 容的条件下，蛋白质编码序列的表达得以实现。
本文所用术语“控制序列”指能够实现它们所连接的编码序列的 表达、加工或胞内定位的多核苷酸序列。这种控制序列的种类可能取 决于宿主生物体。在具体实施方案中，原核生物的控制序列可包括启 动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其他具体实施方案中，真 核生物的控制序列可包括包含一个或多个转录因子的识别位点的启动 子、转录增强序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列。在某些实施方 案中，“控制序列”可包括前导序列和/或融合伴侣序列(fusion partner sequence)。
本文所指的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个核苷酸的单链 或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，包含多核苷酸的核苷酸可为 核糖核酸或脱氧核糖核酸或任何类型的核苷酸的修饰形式。所述修饰 包括如碱基修饰如溴尿苷(bromuridine)、核糖修饰如阿拉伯糖苷和 2’，3’-二脱氧核糖及核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒 代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、 苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”明确 包括单链和双链形式的DNA。
本文所指术语“寡核苷酸”包括通过天然和/或非天然寡核苷酸键 连接在一起的天然的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集， 包含通常为单链且长度为200个核苷酸或更少的成员。在某些实施方 案中，寡核苷酸的长度为10-60个核苷酸。在某些实施方案中，寡核 苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸。 寡核苷酸可以是单链或双链，例如用于构建遗传突变体。本发明的寡 核苷酸对于蛋白质编码序列可以是有义或反义寡核苷酸。
术语“天然核苷酸”包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。术语“修饰 核苷酸”包括带有修饰或取代糖基等的核苷酸。术语“寡核苷酸键” 包括寡核苷酸键如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代 磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。参见例 如LaPlanche等，1986，Nucl.Acids Res.，14：9081；Stec等，1984，J. Am. Chem.Soc.，106：6077；Stein等，1988，Nucl.Acids Res.，16：3209；Zon等， 1991，Anti-Cancer Drug Design，6：539；Zon等，1991， OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES：A PRACTICAL APPROACH，第87-108页(F.Eckstein编辑)，Oxford University Press， Oxford England；Stec等，美国专利第5,151,510号；Uhlmann和Peyman， 1990，Chemical Reviews，90：543，对于任何目的这些文献的公开内容通 过引用结合到本文中。寡核苷酸可包括可检测标记，以便能进行寡核 苷酸或其杂交的检测。
术语“载体”包括能够转运其所连接的另一种核酸的核酸分子。 一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA节段可与其连接的环状 双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段 可连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主 复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其 他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在被引入到宿主细胞时可整合到 宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载 体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中称为“重 组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般的说，在重组DNA技术中 有用的表达载体往往以质粒的形式出现。在本说明书中，“质粒”和 “载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明 包括这种其他类型的表达载体，例如发挥等同功能的病毒载体(例如复 制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
词组“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)包括重组表达载体 已引入其中的细胞。本领域技术人员会理解，这种术语不仅指具体对 象细胞，而且指这种细胞的后代。因为由于变异或环境影响，在以后 的各代中可能出现某些修饰，这种后代实际上可不与母细胞完全相 同，但它们仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。有很多 种宿主表达系统可用于表达本发明抗体，包括细菌、酵母、杆状病毒 和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。合适的细菌表达载 体的实例是pUC19。为重组表达抗体，用一种或多种携有编码抗体免 疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以使 轻链和重链在宿主细胞中表达，并优选被分泌到培养宿主细胞的培养 基中，从所述培养基中可回收到抗体。用标准的重组DNA方法获得重 链和轻链基因，将这些基因掺入到重组表达载体中，并将载体引入到 宿主细胞中，例如Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratories，Ausubel， F.M.等(编辑)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)及Boss等的美国专利第4,816,397号中所述。
术语“宿主细胞”用以指已用或者能够用核酸序列转化，然后能 够表达选定的目的基因的细胞。该术语包括母细胞的后代，不论所述 后代是否在形态上或在遗传结构上与原始亲本完全相同，只要选定的 基因存在即可。
术语“转导”用以指基因从一个细菌转移到另一个细菌，通常通 过噬菌体转移。“转导”还指通过逆转录病毒获得和转移真核细胞序 列。
术语“转染”用以指细胞摄入外来或外源DNA，当外源DNA已 被引入到细胞膜之内时，细胞即被“转染”。有多种转染技术为本领 域所公知并公开于本文中。参见例如Graham等，1973，Virology 52：456；Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等， 1986，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Elsevier；及 Chu等，1981，Gene 13：197。这种技术可用以将一种或多种外源DNA 部分引入到合适的宿主细胞中。
术语“转化”在本文中用以指细胞的遗传特征的变化，当细胞已 被修饰从而包含新的DNA时，细胞即被转化。例如，在细胞由其天然 状态被遗传修饰的情况中，该细胞被转化。转染或转导之后，转化DNA 可通过在物理整合到细胞的染色体中与细胞的DNA重组，或者可作为 不复制的附加型元件而短暂保持，或者可作为质粒而独立复制。当转 化DNA随着细胞的分裂而复制时，认为该细胞已被稳定转化。
当术语“天然出现的”或“天然的”用于生物材料如核酸分子、 多肽、宿主细胞等等时，指可在自然界中发现且未被人操控的材料。 同样，本文所用的“非天然出现的”或“非天然的”指未在自然界中 发现的或者已被人结构修饰或合成的材料。
术语“抗原”指能由选择性结合物如抗体结合的分子或分子部 分，所述分子或分子部分另外还能够用于动物中以产生能够结合该抗 原表位的抗体。抗原具有一个或多个表位。
本领域所公知的术语“一致性”指通过比较两种或更多种多肽分 子的序列或者两种或更多种核酸分子的序列而确定的所述序列之间的 关系。在本领域中，“一致性”也指通过两个或更多个核苷酸序列链 之间或者两个或更多个氨基酸序列链之间的配对情况确定的，核酸分 子之间或多肽之间(视情况而定)的序列相关性的程度。“一致性”测 定的是两个或更多个序列中(共有的)较小一个的相同配对百分率，空 位比对(如果有)通过特殊的数学模型或计算机程序(即“算法”)来处 理。
术语“相似性”在本领域中用以指相关的概念，但与“一致性” 不同的是，“相似性”指的是相关性的度量，其包括完全相同的配对 和保守置换的配对。如果两个多肽序列具有例如10/20的相同氨基酸， 其余的均为非保守置换，则一致性百分率和相似性百分率均为50％。 在同一个实例中，如果还有5个位置为保守置换，则一致性百分率仍 为50％，但相似性百分率将为75％(15/20)。因此，在存在保守置换的 情况下，两个多肽之间的相似性百分率将高于这两个多肽之间的一致 性百分率。
相关核酸和多肽的一致性和相似性可通过公知的方法容易地计 算出来。这种方法包括但不限于COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，(Lesk，A.M.编辑)，1988，Oxford University Press，New York；BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS， (Smith，D.W.编辑)，1993，Academic Press，New York；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，Part 1，(Griffin，A.M.和Griffin，H. G.编辑)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，1987，Academic Press； SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)， 1991，M.Stockton Press，New York；Ccrillo等，1988，SIAM J.Applied Math.，48：1073；及Durbin等，1998，BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS，Cambridge University Press中描述的那些方法。
优选的一致性测定方法被设计成在受试序列之间产生最大程度 的配对。一致性测定方法在可公开获得的计算机程序中有描述。优选 的测定两个序列之间一致性的计算机程序方法包括但不限于GCG程 序包，包括GAP(Devereux等，1984，Nucl.Acid.Res.，12：387；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP、 BLASTN和FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215：403-410)。 BLASTX程序可从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和其他来源公开获得(BLAST手册， Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等，1990，出 处同上)。也可用著名的Smith Waterman算法测定一致性。
某些用以比对两个氨基酸序列的比对方案可能导致两个序列中 只有较短一段区域配对，而这个较小的比对区域可具有非常高的序列 一致性，尽管两个全长序列之间并没有显著的关系。因此，在某些实 施方案中，选定的比对方法(GAP程序)将导致跨越靶多肽的至少50个 连续氨基酸的比对。
例如，使用GAP计算机算法(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，比对两个待测定序列一致性百分率的多 肽，以对它们各自的氨基酸进行最佳配对。(“配对范围”，由算法确 定)。在某些实施方案中，空位开放罚分(将计算为3乘以平均对角线； 其中“平均对角线”是所用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线” 是由具体比较矩阵分配给各个完全氨基酸配对的分数或数值)和空位 拓展罚分(其通常为空位开放罚分的十分之一)，以及比较矩阵如 PAM250或BLOSUM 62与算法一起使用。在某些实施方案中，算法 中也使用标准的比较矩阵(PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等，1978， Atlas of Protein Sequence and Structure，5：345-352；BLOSUM 62比较矩 阵参见Henikoff等，1992，Proc.Natl.Acad Sci USA，89：10915-10919)。
在某些实施方案中，用于多肽序列比较的参数包括以下：
算法：Needleman等，1970，J. Mol.Biol.，48：443-453；
比较矩阵：Henikoff等，1992(出处同上)的BLOSUM 62；
空位罚分：12
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
GAP程序可使用以上参数。在某些实施方案中，上述参数是使用 GAP算法进行多肽比较的默认参数(末端空位无罚分)。
术语“同源性”指蛋白质或核酸序列之间的相似性程度。同源信 息用于理解某些蛋白质或核酸种类的遗传相关性。可通过比对和比较 序列来确定同源性。通常，为确定氨基酸同源性，将蛋白质序列与已 知蛋白质序列的数据库进行比较。同源序列在其序列上的某处享有共 同的功能一致性。尽管较低程度的相似性或一致性并不一定表示缺乏 同源性，但较高程度的相似性或一致性通常表示有同源性。
有几种方法可用来比较一个序列的氨基酸与另一个序列的氨基 酸，以确定同源性。通常，这些方法分为以下两类：(1)比较物理特征 如极性、电荷和范德华体积，以产生相似性矩阵；(2)基于对来自已知 同源蛋白质的许多蛋白质序列的观察，比较序列中的氨基酸被任何其 他氨基酸的可能置换，以产生可接受点突变矩阵(PAM)。
也可使用作为Vector NTI suite 9.0.0软件包模块的程序needle (EMBOSS包)或stretcher (EMBOSS程序包)或程序align X，采用默认 参数(例如，空位罚分5，空位开放罚分15，空位拓展罚分6.6)，计算 一致性百分率。
本文所用的二十个常见氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见 IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS，第2版，(E.S.Golub和D.R.Gren， 编辑)，Sinauer Associates：Sunderland，MA，1991，对于任何目的其通过 引用结合到本文中。二十个常见氨基酸的立体异构体(例如D-氨基 酸)；非天然氨基酸如α-，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他 非常见氨基酸也可以作为本发明多肽的合适组分。非常见氨基酸的实 例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N- 乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲 基组氨酸、5-羟赖氨酸、α-N-甲基精氨酸及其他类似的氨基酸和亚氨 基酸(例如4-羟脯氨酸)。依据标准用法和惯例，在本文所用的多肽符 号中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
根据共同的侧链性质，可将天然残基分类如下：
1)疏水性残基：正亮氨酸(Nor)，Met，Ala，Val，Leu，Ile，Phe，Trp， Tyr，Pro；
2)极性亲水性残基：Arg，Asn，Asp，Gln，Glu，His，Lys，Ser，Thr；
3)脂族残基：Ala，Gly，Ile，Leu，Val，Pro；
4)脂族疏水性残基：Ala，Ile，Leu，Val，Pro；
5)中性亲水性残基：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
6)酸性残基：Asp，Glu；
7)碱性残基：His，Lys，Arg；
8)影响链的方向的残基：Gly，Pro；
9)芳族残基：His，Trp，Tyr，Phe；
10)芳族疏水性残基：Phe，Trp，Tyr。
保守氨基酸置换可能涉及这些类别中的某一类别的成员与同一 类别的另一成员互换。保守氨基酸置换可包括非天然氨基酸残基，其 通常通过化学肽合成而不是在生物体系中合成而掺入。这些包括肽模 拟物和氨基酸部分的其它颠倒或反向形式。
非保守置换可包括这些类别中的某一类别的成员与另一类别的 成员互换。这种置换残基可被引入到人抗体中与非人抗体同源的区 域，或者被引入到分子中的非同源区域。
根据某些实施方案，在造成这种变化时，可考虑氨基酸的亲水性 指数。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，给予其亲水性指数。它 们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)； 半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)； 苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)； 组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰 胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。
亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质活性生物功能方面的重要性为 本领域所认识(参见例如Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已 知可用某些氨基酸置换具有类似亲水性指数或分数的其他氨基酸，且 仍保持类似的生物活性。在根据亲水性指数造成这种变化时，在某些 实施方案中，包括其亲水性指数在±2之内的氨基酸置换。在某些实施 方案中，包括其亲水性指数在±1之内的氨基酸置换，还在某些实施方 案中，包括其亲水性指数在±0.5之内的氨基酸置换。
本领域还认识到，如本文所公开的，可根据亲水性有效地造成相 似氨基酸的置换，特别是在所创建的生物功能性蛋白质或肽意在用于 免疫学实施方案中的情况下。在某些实施方案中，由其邻近氨基酸的 亲水性所决定的蛋白质最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相 关，即与该蛋白质的生物性质相关。
已给这些氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸 (+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰 胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)； 丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸 (-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和 色氨酸(-3.4)。在根据类似的亲水性值造成变化时，在某些实施方案 中，包括其亲水性指数在±2之内的氨基酸置换，在某些实施方案中， 包括其亲水性指数在±1之内的氨基酸置换，还在某些实施方案中，包 括其亲水性指数在±0.5之内的氨基酸置换。还可根据亲水性从一级氨 基酸序列鉴别表位。这些区域也称为“表位核心区”。
示例性的氨基酸置换在表1中显示。
表1
氨基酸置换
原始氨基酸 示例性置换 优选置换 Ala Val，Leu，Ile Val Arg Lys，Gln，Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser，Ala Ser Gln Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro，Ala Ala His Asn，Gln，Lys，Arg Arg Ile Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸 Leu Leu 正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile Lys Arg，1，4二氨基丁酸，Gln，Asn Arg Met Leu，Phe，Ile Leu Phe Leu，Val，Ile，Ala，Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr，Ala，Cys Thr Thr Ser Ser
Trp Tyr，Phe Tyr Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe Val Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸 Leu
技术人员使用公知的技术，将能够确定本文表示的多肽的合适变 体。在某些实施方案中，本领域技术人员可通过以认为对活性不重要 的区域为目标，鉴别可改变而又不破坏活性的合适分子区域。在其他 实施方案中，技术人员能够鉴别在类似多肽中保守的残基和分子部 分。在其它实施方案中，甚至对于生物活性或对于结构具有重要性的 区域也可进行保守氨基酸置换，而又不破坏生物活性或者对多肽的结 构产生不利影响。
另外，本领域技术人员可检阅有关鉴别类似多肽中对活性或结构 重要的残基的结构-功能研究。根据这种比较研究，技术人员能够预测 出蛋白质中氨基酸残基的重要性，其对应于类似蛋白质中对活性或结 构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可为这种预测重要的氨基酸残 基选择在化学上类似的氨基酸置换。
本领域技术人员还能够参照类似多肽中的三维结构，对三维结构 和氨基酸序列进行分析。根据这种信息，本领域技术人员可以参照抗 体的三维结构预测其氨基酸残基的排列。在某些实施方案中，本领域 技术人员可选择不对预测位于蛋白质表面的氨基酸残基造成基团变 化，因为这种残基可能参与与其他分子的相互作用。此外，本领域技 术人员可以产生出在各期望氨基酸残基处包含单个氨基酸置换的试验 变体。然后可以使用本领域技术人员公知的活性测定法对变体进行筛 选。可以用这种变体来收集有关合适变体的信息。例如，如果发现特 定氨基酸残基的变化导致活性破坏、不合乎需要的降低或者不合适的 活性，则可以避免带有这种变化的变体。换句话说，根据从这种常规 实验收集到的信息，本领域技术人员能够容易地确定应避免单独或者 与其他突变一起出现进一步的置换的氨基酸。
有许多科学出版物已致力于研究二级结构的预测。参见Moult， 1996，Curr.Op.inBiotech.7：422-427；Chou等，1974，Biochemistry 13：222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113：211-222；Chou等，1978， Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.47：45-148；Chou等，1979，Ann.Rev. Biochem.47：251-276；及Chou等，1979，Biophys.J.26：367-384。此外， 目前也有计算机程序可帮助预测二级结构。一种预测二级结构的方法 基于同源性建模。例如，序列一致性大于30％或者相似性大于40％的 两种多肽或蛋白质通常具有类似的拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB) 的近期发展已使二级结构(包括多肽或蛋白质结构内部的潜在折叠数 目)的预测性提高。参见Holm等，1999，Nucl.Acid.Res.27：244-247。有 人提出(Brenner等，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)，在具体多肽 或蛋白质中，折叠的数目有限，且一旦解析了结构的临界数目，结构 预测将明显变得更加准确。
另外的二级结构预测方法包括“串线算法(threading)”(Jones，1997， Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-87；Sippl等，1996，Structure 4：15-19)、“序 型分析”(Bowie等，1991，Science 253：164-170；Gribskov等，1990，Meth. Enzym.183：146-159；Gribskov等，1987，Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355- 4358)和“进化连锁”(参见Holm，1999，出处同上；及Brenner，1997，出 处同上)。
在某些实施方案中，抗体变体包括糖基化变体，与亲本多肽的氨 基酸序列相比，其中的糖基化位点数目和/或类型已改变。在某些实施 方案中，比起天然蛋白质，蛋白质变体包含的N-连接糖基化位点的数 目更多或更少。N-连接糖基化位点特征为以下序列：Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr，其中标记为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨 基酸残基。产生这种序列的氨基酸残基置换为N-连接碳水化合物链的 添加提供潜在的新位点。或者，消除该序列的置换将会除去现有的N- 连接碳水化合物链。还提供了N-连接碳水化合物链的重排，其中除去 一个或多个N-连接糖基化位点(通常为天然N-连接糖基化位点)，且创 建一个或多个新的N-连接位点。另外的优选抗体变体包括半胱氨酸变 体，比起亲本氨基酸序列，其中有一个或多个半胱氨酸残基缺失或被 另一种氨基酸(例如丝氨酸)置换。当抗体必须重折叠成生物活性构象 时(比如在不可溶包涵体分离之后)，半胱氨酸变体可能有用。半胱氨 酸变体具有的半胱氨酸残基通常比天然蛋白质要少，且通常为偶数 个，以使由非配对半胱氨酸产生的相互作用最少。
在另外的实施方案中，抗体变体可包括包含修饰Fc片段或修饰重 链恒定区的抗体。Fc片段(其表示可结晶片段)或重链恒定区可通过突 变进行修饰，以赋予抗体改变的结合特征。参见例如Burton和Woof， 1992，Advances in Immunology 51：1-84；Ravetch和Bolland，2001，Annu. Rev.Immunol.19：275-90；Shields等，2001，Journal of Biol.Chem 276：6591-6604；Telleman和Junghans，2000，Immunology 100：245-251； Medesan等，1998，Eur.J.Immunol.28：2092-2100；所有这些文献通过引 用结合到本文中)。这种突变可包括置换、插入、缺失或它们的任何组 合，通常通过按照本文描述的方法，以及按照本领域公知的方法(参见 例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第3版，2001，Cold Spring Harbor，N.Y.及Berger和Kimmel， METHODS IN ENZYMOLOGY，第152卷，Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，Inc.，San Diego，CA.，这些文献通过 引用结合到本文中)，使用一种或多种诱变寡核苷酸进行定点诱变来产 生。
根据某些实施方案，氨基酸置换作用为如下：(1)降低对蛋白酶 解的易感性，(2)降低对氧化作用的易感性，(3)改变使蛋白质复合物 形成的结合亲和性，(4)改变结合亲和性和/或(5)赋予或修饰这种多肽 其他生理化学或功能性质。根据某些实施方案，在天然序列中(在某些 实施方案中，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分)，可以造成 单个或多个氨基酸置换(在某些实施方案中，保守氨基酸置换)。在优 选的实施方案中，保守氨基酸置换通常并不实质上改变亲本序列的结 构特征(例如置换氨基酸不应倾向于使亲本序列中出现的螺旋破裂，或 者使表征亲本序列的其他类型的二级结构破坏)。本领域公认的多肽二 级和三级结构的实例描述于PROTEINS，STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES，(Creighton编辑)，1984，W.H.Freeman和 Company，New York；INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden和J.Tooze，编辑)，1991，Garland Publishing，New York，N.Y.； 及Thornton等，1991，Nature 354：105，以上各文献通过引用结合到本 文中。
肽类似物常作为性质与模板肽类似的非肽药物用于制药工业 中。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”。参见Fauchere，1986，Adv. DrugRes.15：29；Veber&Freidinger，1985，TINS第392页；及Evans 等，1987，J.Med.Chem.30：1229，对于任何目的以上文献通过引用结合 到本文中。这种化合物通常是借助于计算机分子建模而被开发出来 的。在结构上与治疗上有用肽类似的肽模拟物可用以产生类似的治疗 或预防效果。一般的说，肽模拟物在结构上与模式多肽(即具有某种生 化性质或药物活性的多肽)如人抗体相类似，但具有一个或多个肽键通 过本领域公知的方法任选由选自以下的键替换：-CH2-NH-、-CH2-S-、 -CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和- CH2SO-。用同一类型的D-氨基酸对共有序列的一个或者多个氨基酸进 行系统性置换(例如D-赖氨酸置换L-赖氨酸)，在某些实施方案中可用 以产生更稳定的肽。另外，包含共有序列或基本相同的共有序列变体 的约束(constrained)肽可用本领域公知的方法来产生(Rizo & Gierasch， 1992，Ann.Rev.Biochem.61：387，对于任何目的其通过引用结合到本文 中)；例如，通过添加能够使肽环化形成分子内二硫桥的内部半胱氨酸 残基来产生。
“抗体”或“抗体肽”指完整抗体或者与完整抗体竞争特异性结 合的结合片段。在某些实施方案中，结合片段由重组DNA技术产生。 在另外的实施方案中，结合片段通过对完整抗体进行酶法或化学法切 割来产生。结合片段包括但不限于F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、Fv和单链 抗体。
术语“重链”包括具有足够的可变区序列以赋予NGF特异性的任 何免疫球蛋白多肽。术语“轻链”包括具有足够的可变区序列以赋予 NGF特异性的任何免疫球蛋白多肽。全长重链包括一个可变区结构域 VH及三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基 末端，CH3结构域位于羧基末端。本文所用术语“重链”涵括全长重 链及其片段。全长轻链包括一个可变区结构域VL和一个恒定区结构域 CL。如同重链一样，轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。本文 所用术语“轻链”涵括全长轻链及其片段。F(ab)片段由一条轻链及一 条重链的CH1和可变区组成。F(ab)分子的重链不能与另一个重链分子 形成二硫键。F(ab’)片段含有一条轻链和一条重链，所述重链含有CH1 和CH2结构域之间的更多恒定区，这样在两条重链之间可形成链间二 硫键，形成F(ab’)2分子。Fv区包含源自重链和轻链的可变区，但缺少 恒定区。单链抗体是其中重链和轻链可变区已由柔性连接基团连接而 形成单一多肽链的Fv分子，该单一多肽链形成抗体结合区。在国际专 利申请公开WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号 中对单链抗体有更详细的描述。
在某些实施方案中，“多特异性”或“多功能性”抗体之外的二 价抗体应理解为包含具有相同抗原特异性的结合位点。
在根据本发明评估抗体结合性和特异性时，当过量的抗体减少结 合到受体的配体量达到至少约20％、40％、60％、80％、85％或更高(尤 其使用体外竞争性结合试验测定)时，则抗体基本抑制配体吸附至受 体。
“中和抗体”是指能够封闭或实质上降低与其结合的靶抗原的效 应子功能的抗体分子。因此，“中和”抗NGF抗体能够封闭或实质上 降低NGF的效应子功能，例如受体结合和/或细胞反应的引发。“实 质上降低”意指降低至少约60％，优选至少约70％，更优选至少约 75％，甚至更优选至少约80％，还更优选至少约85％，最优选至少约 90％的靶抗原(例如人NGF)效应子功能。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任 何决定簇，优选多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分 子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，而且 在某些实施方案中，可具有特异性三维结构特征和/或特异性电荷特 征。表位是抗原的可被抗体结合的区域。在某些实施方案中，当抗体 在蛋白质和/或大分子的复合混合物中优先识别其靶抗原时，则可以说 它特异性结合抗原。在优选的实施方案中，当平衡解离常数≤10-8M， 更优选当平衡解离常数≤10-9M，最优选当平衡解离常数≤10-10M时， 则可以说抗体特异性结合抗原。
当某抗体与参比抗体这两种抗体识别相同表位或空间重叠表位 时，则该抗体结合与参比抗体“基本上相同的表位”。测定两种抗体 是否结合相同表位或空间重叠表位的最常用和快速的方法是竞争性试 验，其使用标记抗原或标记抗体，能以所有数量的不同形式装配。通 常，将抗原固定化于基质上，用放射性标记或酶标记测定未标记抗体 封闭标记抗体的结合的能力。
术语“作用物”在本文中用以表示化学化合物、化学化合物的混 合物、生物大分子或从生物材料获得的提取物。
本文所用术语“标记”或“标记的”指将可检测标记的掺入，例 如通过掺入放射性标记氨基酸或使可被标记亲和素(例如链霉亲和 素，优选包含可检测的标记如荧光标记、化学发光标记或者可通过光 学或比色方法检测的酶活性)检测到的生物素部分连接到多肽。在某些 实施方案中，标记还具有治疗性。各种标记多肽和糖蛋白的方法为本 领域所公知，且可方便地用于本文公开的方法中。多肽标记的实例包 括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、 90Y、99mTc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素或称FITC、 罗丹明或者磷化镧系(lanthanide phosphors))、酶标记(例如辣根过氧化 物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、半抗 原标记如生物素基团及由第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮 氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域或表位标 签)。在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂(如(CH2)n，其中 n＜约20)连接，以减少潜在的空间位阻。
本文所用术语“生物样品”包括但不限于来自生命体或以前的生 命体的任何数量的物质。所述生物体包括但不限于人类、小鼠、猴、 大鼠、兔和其他动物。所述物质包括但不限于血液、血清、尿、细胞、 器官、组织、骨、骨髓、淋巴结和皮肤。
本文所用术语“药物”指当将其正确给予患者时，能够诱导期望 的治疗效果的化学化合物或组合物。涉及包含一种或多种本发明抗体 的药物组合物的措辞“治疗有效量”按本发明应理解为意指所述药物 组合物的量，其在受照顾患者中能够消除对外界刺激的灵敏度阈值的 下降，使该灵敏度阈值恢复到可与健康对象中所观察到的阈值相比的 水平。
“病症”是可受益于本发明治疗的任何疾病。“病症”和“疾病” 在本文中可互换使用，包括慢性和急性NGF介导病症或NGF介导的 疾病，包括使哺乳动物倾向于发生所讨论病症的病理情况。
术语“NGF介导的疾病”和“NGF介导的病症”涵括与NGF水 平升高或对NGF敏感性提高有关的任何医学疾病或病症，包括但不限 于急性痛、牙痛、外伤导致的疼痛、外科手术疼痛、截肢或脓肿导致 的疼痛、灼痛、脱髓鞘病、三叉神经痛、癌症、慢性酒精中毒、中风、 丘脑痛综合征、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征(“AIDS”)、毒素和 化疗、一般性头痛、偏头痛、丛集性头痛、混合型血管和非血管综合 征(mixed-vascular or non-vascular syndromes)、紧张性头痛、一般炎症、 关节炎、风湿病、狼疮、骨关节炎、炎性肠病、过敏性肠综合征、炎 性眼病、炎性或不稳定性膀胱功能障碍、牛皮癣、炎性组分造成的皮 肤不适、晒伤、心炎、皮炎、肌炎、神经炎、胶原血管病、慢性炎性 疾病、炎性疼痛及相关痛觉过敏和异常性疼痛、神经性疼痛及相关痛 觉过敏和异常性疼痛、糖尿病性神经性疼痛、灼痛、交感神经维持的 疼痛、传入神经阻滞综合征、哮喘、上皮组织损伤或功能紊乱、单纯 疱疹、在呼吸、泌尿生殖、胃肠或者血管区域的内脏活动障碍、创伤、 烧伤、过敏性皮肤反应、瘙痒、白癜风、一般性胃肠机能紊乱、结肠 炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、血管舒缩性或过敏性鼻炎或者支气管病、 痛经、消化不良、胃食管反流、胰腺炎和内脏痛。
本文所用术语“有效量”和“治疗有效量”当用以指含一种或多 种抗人NGF人抗体的运载体或药物组合物时，指足以产生期望的效果 (即对于用本发明运载体或抗人NGF人抗体治疗的情况，期望的效果 是例如炎症和/或疼痛的减少)或者足以帮助NGF的一种或多种生物活 性的水平可观察下降的数量或剂量。更具体的说，治疗有效量是抗人 NGF人抗体的量，其足以抑制用作用物体内治疗的对象中与所讨论的 疾病(例如炎症或疼痛)有关的一种或多种临床定义的病理过程达一段 时间。在本发明中，“有效量”的抗人NGF抗体可以防止、停止、控 制或降低对与任何疼痛医学疾病有关的疼痛的感知。在本发明方法 中，术语“控制”及其语法变体用以指不需要的事件(例如疼痛)的防 止、部分或完全抑制、降低、延迟或减缓。有效量可根据选定的具体 运载体或抗人NGF人抗体而变化，同时取决于与待治疗患者有关的多 种因素和情况，以及病症的严重程度。例如，如果运载体或抗人NGF 人抗体体内给予，则要考虑的因素有患者的年龄、体重和健康状况， 以及在临床前动物试验中获得的剂量-反应曲线及毒性数据等等。如果 作用物待与细胞进行体外接触，同样要设计多个临床前体外研究，以 评估摄入、半寿期、剂量、毒性等参数。指定作用物的有效量或治疗 有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
本文所用术语“神经生长因子”和“NGF”定义为所有的哺乳动 物种类的天然序列NGF，包括SEQ ID NO：30所示的重组人1-120。
本文所用的“基本纯净的”或“基本纯化的”意指作为主要种类 而存在的化合物或种类(即以摩尔量计，它比组合物中的任何其他单独 的种类都丰富得多)。在某些实施方案中，基本纯化的部分是其中某些 种类占所有存在的大分子种类的至少约50％(以摩尔量计)的组合物。 在某些实施方案中，基本纯净的组合物占组合物中存在的所有大分子 种类的比例超过约80％、85％、90％、95％或99％。在某些实施方案中， 该种类被纯化至基本均一(通过常规检测方法不能在组合物中检测到 污染种类)，其中组合物基本由单一大分子种类组成。
术语“患者”包括人类和动物对象。
“治疗”指治疗性处理和预防性或防护性措施。需要接受治疗的 对象包括已患有病症的对象，以及易患上病症的对象或者须预防病症 的对象。
除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数含义，复数形 式的术语应包括单数含义。
根据本发明的某些实施方案，导向NGF的抗体可用以治疗神经性 和炎性疼痛及NGF介导的疾病，包括但不限于上述疼痛和疾病。
本发明的一个方面提供针对人NGF产生的和对结合人NGF具有 生物和免疫特异性的完全人单克隆抗体。本发明另一方面提供核酸， 其包含的核苷酸序列编码重链和轻链免疫球蛋白分子的氨基酸序列， 特别是对应于其可变区的序列。本发明这个方面的具体实施方案是对 应于互补决定区(CDR)的序列，具体的说是本发明提供的重链和轻链 的CDR1至CDR3。本发明的又一个方面提供表达免疫球蛋白分子和 抗体、优选本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞和细胞系。本发明还提供 抗体的生物学上和免疫学上纯化的制剂，所述抗体优选是针对人NGF 产生的和对结合人NGF具有生物和免疫特异性的单克隆抗体。
在酵母人工染色体(YAC)中，克隆和重建兆碱基大小的人基因座 并将所述基因座引入到小鼠种系的能力，为阐明非常大的或粗略作图 的基因座的功能成分以及产生有用的人类疾病模型提供有利的方法。 此外，用人的对应等价物置换小鼠基因座这种技术的应用，对发育过 程中人基因产物的表达和调节、其与其他系统的通讯以及其在疾病引 发和发展中的参与情况提供了独到深入了解。
这种策略的一种重要的实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源 化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入到其中的内源Ig基因已失活的 小鼠，为研究抗体的程序表达和装配的基础机制以及抗体在B细胞发 育中的作用提供了机会。此外，这种策略为完全人单克隆抗体(MAb) 的生产提供了来源。
术语“人抗体”包括具有基本对应于人种系免疫球蛋白序列的可 变区和恒定区的抗体。在某些实施方案中，人抗体在非人哺乳动物中 生产，包括但不限于啮齿类动物如小鼠和大鼠，及兔类动物如兔。在 某些实施方案中，人抗体在杂交瘤细胞中生产。在某些实施方案中， 人抗体用重组法生产。
涉及抗体的术语“重组”包括通过重组手段制备、表达、创建或 分离得到的抗体。示例性的实例包括用转染到宿主细胞中的重组表达 载体表达的抗体、从重组组合人抗体文库分离的抗体、从转有人免疫 球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor，L.D.等， Nucl.Acids Res.20：6287-6295，(1992)；或者通过任何涉及将人免疫球蛋 白基因序列剪接至其他DNA序列的手段制备、表达、创建或分离得到 的抗体。这种重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和 恒定区。
相比于非人抗体和嵌合抗体，人抗体用于人类治疗时具有至少以 下三个优点：
1)由于抗体的效应子部分是人效应子，它可以更好地与人免疫系 统的其他部分发生相互作用(例如更有效地通过依赖补体的细胞毒性 (CDC)或依赖抗体的细胞毒性(ADCC)破坏靶细胞)；
2)人免疫系统不会将人抗体识别为外源抗体，因此对这种注射抗 体的抗体反应比对完全外源的非人抗体或部分外源的嵌合抗体要轻；
3)据报道，注射的非人抗体在人体循环中的半寿期比人抗体的半 寿期要短得多。注射人抗体的半寿期与天然人抗体的半寿期基本相 同，使得可以给予更少的剂量和更少的次数。
因此，预期完全人抗体能使小鼠MAb或者小鼠衍生化MAb固有 的免疫原性反应和变应性反应减至最少，从而提高所给予抗体的效力 和安全性。因此，本发明的完全人抗体可用于治疗慢性和复发性疼痛， 所述疼痛的治疗需要反复给予抗体。因此，本发明抗NGF抗体的一个 特别优点在于抗体是完全人抗体，可以非剧烈(non-acute)方式给予患 者，同时又使通常伴随人抗小鼠抗体或其他前述来自非人物种的非完 全人抗体的不利反应减至最少。
本领域技术人员能够用大的人Ig基因座片段工程改造小鼠抗体 生产缺陷的小鼠品系，使该小鼠不产生小鼠抗体而产生人抗体。大的 人Ig片段可保持较大的可变基因多样性以及抗体生产和表达的正确调 节。通过充分利用抗体多样化和选择的小鼠细胞机制和对人蛋白质的 免疫耐受性的缺乏，这些小鼠品系中再现的人抗体免疫细胞库产生对 任何目的抗原(包括人抗原)具有高度亲和性的抗体。用杂交瘤技术可 生产和选择出具有期望特异性的抗原特异性人MAb。
可以利用在免疫时能够不产生内源免疫球蛋白而产生人抗体的 完整免疫细胞库的转基因动物(例如小鼠)。将人种系免疫球蛋白基因 阵列转移到这种种系突变体小鼠中，将导致在抗原攻击时产生人抗体 (参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555， (1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258，(1993；Bruggemann等，Year in Immun.，7：33(1993)；Nature 148：1547-1553(1994)，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Gross，J.A.等，Nature，404：995-999 (2000)；及美国专利第5,877,397号、第5,874,299号、第5,814,318号、 第5,789,650号、第5,770,429号、第5,661,016号、第5,633,425号、 第5,625,126号、第5,569,825号和第5,545,806号(对于任何目的以上 各文献通过引用整体结合到本文中))。人抗体也可在噬菌体展示文库 中生产(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1992)；Marks等， J.Mol.Biol.，222：581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用来制 备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therap， Alan R.Liss，第77页(1985)及Boerner等，J.Immunol.，147(1)：86-95 (1991))。
也可使重组人抗体进行体外诱变(或者当使用转有人Ig序列的动 物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基 酸序列是这样的序列，其虽然源自与人种系VH序列和VL序列相关 的序列，但可能没有天然存在于体内人抗体种系细胞库中。
在某些实施方案中，技术人员可以将来自人类以外的物种的恒定 区与人可变区一起用于这种小鼠中，以产生嵌合抗体。
天然抗体的结构
天然抗体的结构单元通常包含四聚体。每个这种四聚体通常由完 全相同的两对多肽链组成，每对链具有一条全长“轻”链(分子量通常 约为25kDa)和一条全长“重”链(分子量通常约为50-75kDa)。每条轻 链和重链的氨基末端部分通常包括含约100-110个或者更多个氨基 酸、通常负责抗原识别的可变区。每条链的羧基末端通常确定负责效 应子功能的恒定区。人轻链通常分为κ轻链和λ轻链。重链通常分为μ、 δ、γ、α或ε重链，并分别确定抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA 和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。 IgM的亚类包括但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地可细分成亚类， 包括但不限于IgA1和IgA2。通常在全长轻链和重链内部，可变区和 恒定区通过含约12个或者更多个氨基酸的“J”区连接，重链同时还 包括含约10个或更多个氨基酸的“D”区。参见例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY，第7章，第2版，(Paul，W.编辑)，1989，Raven Press， N.Y.(对于任何目的其通过引用整体结合到本文中)。每个轻/重链对的 可变区通常形成抗原结合位点。
可变区通常展示相同的一般结构，即相对保守的框架区(FR)与三 个高变区(也称互补决定区或CDR)连接。每一对的两条链的CDR通常 通过框架区排列，这使与特定表位的结合成为可能。轻链和重链的可 变区从N端到C端通常包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4结构域。每个结构域的氨基酸排布通常是按照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)或者Chothia & Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901- 917；Chothia等，1989，Nature 342：878-883的定义来进行的。
双特异性或双功能性抗体
双特异性或双功能性抗体通常是具有两个不同的重链/轻链对和 两个不同结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法来 生产，包括但不限于杂交瘤的融合或F(ab′)片段的连接。参见例如 Songsivilai & Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny 等，1992，J.Immunol 148：1547-1553。
抗体的制备
本发明提供结合人NGF的抗体。可通过用全长NGF或其片段进 行免疫来生产这些抗体。本发明抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗 体，和/或可以是重组抗体。在优选的实施方案中，本发明抗体是例如 通过免疫能够产生人抗体的转基因动物而制备的人抗体(参见例如国 际专利申请公开WO 93/12227)。
本发明抗NGF抗体的轻链可变区和重链可变区的互补决定区 (CDR)可移植到同一物种或另一物种的框架区(FR)。在某些实施方案 中，抗NGF抗体的轻链可变区和重链可变区的CDR可移植到共有人 FR。为创建共有人FR，比对几个人重链或轻链氨基酸序列中的FR， 以鉴别共有氨基酸序列。抗NGF抗体重链或轻链的FR可用来自不同 的重链或轻链的FR置换。抗NGF抗体的重链和轻链的FR中的稀有 氨基酸通常不被置换，而其余的FR氨基酸则可被置换。稀有氨基酸 是特殊的氨基酸，其通常在FR中不能找到它们的位置。本发明抗NGF 抗体的移植可变区可与不同于抗NGF抗体恒定区的恒定区一起使 用。或者，移植可变区是单链Fv抗体的一部分，CDR移植描述于例 如美国专利第6,180,370号、第5,693,762号、第5,693,761号、第 5,585,089号和第5,530,101，它们对于任何目的通过引用结合到本文 中。
本发明抗体优选用转基因小鼠来制备，所述转基因小鼠的抗体产 生细胞中插入了很大一部分的人抗体产生基因座，且进一步被工程改 造成在产生内源鼠抗体方面出现缺陷。这种小鼠能够产生人免疫球蛋 白分子和抗体，不产生或者产生量大为减少的鼠免疫球蛋白分子和抗 体。用以获得这种结果的技术在本说明书中公开的专利、专利申请和 参考文献中有公开。在优选的实施方案中，技术人员可采用如在国际 专利申请公开WO 98/24893中公开的方法，所述公开对于任何目的通 过引用结合到本文中。也参见Mendez等，1997，Nature Genetics 15：146-156，对于任何目的其通过引用结合到本文中。
本发明单克隆抗体(mAb)可通过多种技术生产，包括常规的单克 隆抗体方法，例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术(1975， Nature 256：495)。虽然优选体细胞杂交程序，但原则上也可采用其他生 产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或者癌基因转化。
优选的制备杂交瘤的动物系统是小鼠。已很好地确立在小鼠中生 产杂交瘤，且免疫方案和分离免疫脾细胞以供融合的技术为本领域所 公知。融合伙伴(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。
在优选的实施方案中，导向NGF的人单克隆抗体可用携有人免疫 系统而不是小鼠免疫系统部分的转基因小鼠来生产。这些转基因小鼠 在本文称为“HuMab”小鼠，含有编码非重排人(μ和γ)重链和κ轻链免 疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，以及使内源μ和κ链基因 座失活的靶向突变(Lonberg等，1994，Nature 368：856-859)。因此，小鼠 对小鼠IgM或κ的表达减少，且为响应免疫，引入的人重链转基因和 轻链转基因发生类别转换和体细胞突变，以产生高度亲和性人IgG κ 单克隆抗体(Lonberg等，出处同上；Lonberg和Huszar，1995，Intern.Rev. Immunol.13：65-93；Harding和Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci. 764：536-546)。HuMab小鼠的制备在Taylor等，1992，NucleicAcids Res. 20：6287-6295；Chen等，1993，International Immunology 5：647-656； Tuaillon等，1994，J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等，1994，Nature 368：856-859；Lonberg，1994，Handbook of Exp.Pharmacology 113：49- 101；Taylor等，1994，International Immunology 6：579-591；Lonberg & Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding & Lonberg，1995， Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild等，1996，Nature Biotechnology 14：845-851中有详细的描述，所有这些文献的内容通过引用整体结合 到本文中。另外参见Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号；第 5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第 5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号和第 5,770,429，以及Surani等的美国专利第5,545,807号；1993年6月24 日出版的国际专利申请公开WO 93/1227；1992年12月23日出版的 WO 92/22646；及1992年3月19日出版的WO 92/03918，所有这些文 献的公开内容通过引用整体结合到本文中。或者，以下实施例中描述 的Hco7、Hco12和KM转基因小鼠可用来产生人抗NGF抗体。
本发明提供对生物活性人NGF多肽具有特异性且能中和所述多 肽的人单克隆抗体。本发明还提供抗体重链和轻链氨基酸序列，所述 序列对NGF多肽具有高度特异性，且与NGF多肽结合时能将其中和。 这种高度特异性使得抗人NGF人抗体及具有类似特异性的人单克隆 抗体成为NGF相关疾病的有效免疫疗法。
在一个方面，本发明提供结合的表位与本文提供的4D4抗体相同 或基本相同的分离人抗体。
在一个方面，本发明提供包含至少SEQ ID NO：10、12、14、16、 18、20、22、24和79-130所示的氨基酸序列之一的分离人抗体，所述 抗体能以高度亲和性结合NGF多肽表位，且具有拮抗NGF多肽活性 的能力。优选这些抗体结合的表位与本文提供的4D4抗体相同或基本 相同。
在优选的实施方案中，分离人抗体以1×10-9M或更低的解离常 数(KD)结合NGF多肽，且在体外中和试验中以1×10-7M或更低的IC50抑制NGF诱导的存活。在更优选的实施方案中，分离人抗体以1×10-10M或更低的解离常数(KD)结合NGF多肽，且在体外中和试验中以1× 10-8M或更低的IC50抑制NGF诱导的存活。在甚至更优选的实施方案 中，分离抗NGF人抗体以1×10-11M或更低的解离常数(KD)结合人 NGF多肽，且在体外中和试验中以1×10-9M或更低的IC50抑制NGF 诱导的存活。本文提供了符合以上结合和中和标准的抗人NGF人抗体 的实例。
本发明的最优选抗人NGF人抗体在本文中称为4D4，其具有SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10分别所示的VL多肽序列和VH多肽序 列。编码4D4的VL和VH的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：11和 SEQ ID NO：9所示。本发明抗人NGF人抗体的性质在实施例中明确公 开。本文显示的对NGF多肽的高度亲和性及拮抗NGF多肽活性的高 能力特别值得注意。
如实施例9中的一般描述，抗人NGF人抗体的解离常数(KD)可通 过表面等离子共振进行测定。通常，表面等离子共振分析是使用 BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)，通过表面等离子共 振(SPR)测定配体(固定化于生物传感器基质上的重组NGF多肽)和分 析物(溶液中的抗体)之间的实时结合相互作用。也通过固定化分析物 (生物传感器基质上的抗体)和呈递配体(溶液中的重组V)进行表面等 离子分析。抗人NGF人抗体的解离常数(KD)也可用KinExA方法来测 定。在本发明的某些实施方案中，抗体以大约10-8M-10-12M的KD结 合NGF。本文所用术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的解离常 数。对于本发明的目的，KD如实施例9所述进行测定。
在优选的实施方案中，本发明抗体属IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 同种型。优选抗体属IgG3同种型。更优选抗体属IgG1同种型。最优 选抗体属IgG2同种型。在其他实施方案中，本发明抗体属IgM、IgA、 IgE或IgD同种型。在本发明的优选实施方案中，抗体包含人κ轻链和 人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链。包含IgG1或IgG2重链恒定区的 本发明抗体的表达描述于以下实施例中。在具体实施方案中，抗体的 可变区连接到IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的恒定区之外的恒定 区。在某些实施方案中，本发明抗体已被克隆，以在哺乳动物细胞中 表达。
在某些实施方案中，针对抗NGF抗体的重链和轻链的保守修饰 (以及针对编码核苷酸的相应修饰)将产生具有与本文公开的抗NGF抗 体类似的功能特征和化学特征的抗NGF抗体。相反，可通过选择如下 重链和轻链的氨基酸序列中的置换，实现抗NGF抗体的功能特征和/ 或化学特征的实质修饰，所述重链和轻链在保持(a)置换部位的分子骨 架结构，例如折叠或螺旋构象，(b)靶位点处的分子电荷或疏水性或者 (c)侧链的大小这三方面的作用相差很大。
例如，“保守氨基酸置换”可涉及用非天然氨基酸残基置换天然 氨基酸残基，结果对置换位置的氨基酸残基的极性或电荷有极少或没 有影响。此外，如前面对“丙氨酸扫描诱变”所述，多肽中的任何天 然残基也可用丙氨酸置换。
期望的氨基酸置换(无论是保守置换还是非保守置换)可由本领域 技术人员在需要这种置换的时候进行确定。在某些实施方案中，氨基 酸置换可用来鉴别抗NGF抗体的重要残基，或者用来提高或降低本文 描述的抗NGF抗体的亲和性。
众所周知，氨基酸序列中的微小变化，如缺失、插入或置换一个、 少数或甚至几个氨基酸可导致出现具有基本相同性质的原始蛋白质等 位形式。因此，除了本文明确描述的抗体之外，其他“基本同源的” 抗体也可用本领域技术人员公知的多种重组DNA技术容易地设计和 制备出来。一般的说，可通过多种公知技术如定点诱变，容易地实现 基因的修饰。因此，本发明设想具有与本文公开的抗NGF人抗体基本 类似特征的“变异的”或“突变的”抗NGF人抗体(参见例如WO 00/56772，其全部内容通过引用结合到本文中)。因此，涉及抗NGF 人抗体的术语“变体”或“突变体”意指如下的任何结合分子(分子X) (i)其中重链高变区CDR1、CDR2和CDR3或者轻链的高变区CDR1、 CDR2和CDR3作为整体分别与SEQIDNO：14、18和22或者SEQ ID NO：16、20和24所示的高变区具有至少80％的同源性，优选至少90％ 的同源性，更优选至少95％的同源性，(ii)其中所述变体或突变体能 够抑制人NGF的活性，其抑制程度与框架区完全相同于分子X的参 比抗NGF人抗体相同。
一般地，抗NGF人抗体变体的轻链和/或重链CDR作为整体，将 分别与SEQ ID NO：14、18和22和/或SEQ ID NOS：16、20和24所示 的氨基酸序列有至少约80％的氨基酸序列一致性，优选至少约85％的 序列一致性，还更优选至少约90％的序列一致性，还更优选至少约91％ 的序列一致性，还更优选至少约92％的序列一致性，还更优选至少约 93％的序列一致性，还更优选至少约94％的序列一致性，还更优选至 少约95％的序列一致性，还更优选至少约96％的序列一致性，还更优 选至少约97％的序列一致性，还更优选至少约98％的序列一致性，还 更优选至少约99％的氨基酸序列一致性。
更优选地，抗NGF人抗体变体的轻链可变区作为整体，将与SEQ ID NO：12、80、82、84、86、88、89、90或91所示的氨基酸序列有 至少约80％的氨基酸序列一致性，还更优选至少约81％的序列一致 性，还更优选至少约82％的序列一致性，还更优选至少约83％的序列 一致性，还更优选至少约84％的序列一致性，还更优选至少约85％的 序列一致性，还更优选至少约86％的序列一致性，还更优选至少约87％ 的序列一致性，还更优选至少约88％的序列一致性，还更优选至少约 89％的序列一致性，还更优选至少约90％的序列一致性，还更优选至 少约91％的序列一致性，还更优选至少约92％的序列一致性，还更优 选至少约93％的序列一致性，还更优选至少约94％的序列一致性，还 更优选至少约95％的序列一致性，还更优选至少约96％的序列一致 性，还更优选至少约97％的序列一致性，还更优选至少约98％的序列 一致性，还更优选至少约99％的氨基酸序列一致性，和/或重链可变区 作为整体，将与SEQ ID NO：10、81、83、85、或87所示的氨基酸序 列有至少约70％的氨基酸序列一致性，优选至少约75％的序列一致 性，还更优选至少约80％的序列一致性，还更优选至少约81％的序列 一致性，还更优选至少约82％的序列一致性，还更优选至少约83％的 序列一致性，还更优选至少约84％的序列一致性，还更优选至少约85％ 的序列一致性，还更优选至少约86％的序列一致性，还更优选至少约 87％的序列一致性，还更优选至少约88％的序列一致性，还更优选至 少约89％的序列一致性，还更优选至少约90％的序列一致性，还更优 选至少约91％的序列一致性，还更优选至少约92％的序列一致性，还 更优选至少约93％的序列一致性，还更优选至少约94％的序列一致 性，还更优选至少约95％的序列一致性，还更优选至少约96％的序列 一致性，还更优选至少约97％的序列一致性，还更优选至少约98％的 序列一致性，还更优选至少约99％的氨基酸序列一致性。
涉及多核苷酸的“变体”意指与本发明多核苷酸序列具有至少约 75％核酸序列一致性的核酸分子。一般地，多核苷酸的变体与本文公 开的新型核酸序列将有至少约75％的核酸序列一致性，更优选至少约 80％的核酸序列一致性，还更优选至少约81％的核酸序列一致性，还 更优选至少约82％的核酸序列一致性，还更优选至少约83％的核酸序 列一致性，还更优选至少约84％的核酸序列一致性，还更优选至少约 85％的核酸序列一致性，还更优选至少约86％的核酸序列一致性，还 更优选至少约87％的核酸序列一致性，还更优选至少约88％的核酸序 列一致性，还更优选至少约89％的核酸序列一致性，还更优选至少约 90％的核酸序列一致性，还更优选至少约91％的核酸序列一致性，还 更优选至少约92％的核酸序列一致性，还更优选至少约93％的核酸序 列一致性，还更优选至少约94％的核酸序列一致性，还更优选至少约 95％的核酸序列一致性，还更优选至少约96％的核酸序列一致性，还 更优选至少约97％的核酸序列一致性，还更优选至少约98％的核酸序 列一致性，还更优选至少约99％的核酸序列一致性。
在具体实施方案中，本发明提供与本发明抗体有一部分一致性的 抗体，或者包含的重链可变区、轻链可变区、CDR1、CDR2或CDR3 区与本文实施例10和图5-10所示的本发明重链可变区、轻链可变区、 CDR1、CDR2或CDR3区有一部分一致性的抗体。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包含 重链和轻链的分离人抗体，其中所述重链包含的重链可变区包含如下 氨基酸序列：其与SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列或其抗原结合片 段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或75％的一致性；与SEQ ID NO：81表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球 蛋白片段有至少70％、80％、85％或95％的同源性；与SEQ ID NO：83 表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有 至少70％、80％、85％或95％的一致性；与SEQ ID NO：85表示的氨 基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少 70％、80％或85％的一致性；与SEQ ID NO：87表示的氨基酸序列或其 抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％或80％ 的一致性；与SEQ ID NO：79表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或 免疫功能性免疫球蛋白片段有至少56％的一致性。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包含 重链和轻链的分离人抗体，其中所述轻链包含的轻链可变区包含如下 氨基酸序列：其与SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列或其抗原结合片 段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、75％、80％或90％的一 致性；与SEQ ID NO：80表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％或90％的一致性；与SEQ ID NO：88表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白 片段有至少70％、74％、90％或94％的一致性；与SEQ ID NO：89表 示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至 少70％、80％、85％或87％的一致性；与SEQ ID NO：90表示的氨基 酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、 85％、90％或94％的一致性；与SEQ ID NO：91表示的氨基酸序列或其 抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、 95％或99％的一致性；与SEQ ID NO：82表示的氨基酸序列或其抗原 结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、80％、90％、95％ 或96％的一致性；与SEQ ID NO：84表示的氨基酸序列或其抗原结合 片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、95％、98％ 或99％的一致性；或者与SEQ ID NO：86表示的氨基酸序列或其抗原 结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％、85％、90％、95％、 98％或99％的一致性。
在某些其他实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、 包含人重链CDR1的分离人抗体，其中所述重链CDR1是以下的氨基 酸序列，其与SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：110或 SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免 疫球蛋白片段有至少40％或60％的一致性。
在其他实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包含 人重链CDR2的分离人抗体，其中所述重链CDR2是以下的氨基酸序 列：其与SEQ ID NO：99表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段有至少70％、82％或94％的一致性；与SEQ ID NO：106表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋 白片段有至少70％或76％的一致性；与SEQ ID NO：18表示的氨基酸 序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少59％的一 致性；与SEQ ID NO：117表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；与SEQ ID NO：111表示 的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少 70％、75％或80％的一致性。
在还其他实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包 含人轻链CDR1的分离人抗体，其中所述CDR1是以下的氨基酸序列： 其与SEQ ID NO：101表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能 性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一致性；与SEQ ID NO：95表 示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至 少70％、75％、80％或90％的一致性；与SEQ ID NO：119表示的氨基 酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少75％、 80％或90％的一致性；与SEQ ID NO：122表示的氨基酸序列或其抗原 结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少75％、80％或90％的一 致性；与SEQ ID NO：125表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段有至少80％的一致性；与SEQ ID NO：24表示 的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少 75％、80％或90％的一致性；与SEQ ID NO：107表示的氨基酸序列或 其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一 致性；或者与SEQ ID NO：113表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或 免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或80％的一致性。
在另外的实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包 含人轻链CDR2的分离人抗体，其中所述CDR2是以下的氨基酸序列： 其与SEQ ID NO：102表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能 性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；与SEQ ID NO：96表 示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至 少70％的一致性；与SEQ ID NO：120表示的氨基酸序列或其抗原结合 片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％的一致性；与SEQ ID NO：123表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋 白片段有至少70％的一致性；与SEQ ID NO：126表示的氨基酸序列或 其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一 致性；与SEQ ID NO：129表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫 功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；与SEQ ID NO：20 表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有 至少70％的一致性；与SEQ ID NO：108表示的氨基酸序列或其抗原结 合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；与 SEQ ID NO：133表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免 疫球蛋白片段有至少70％的一致性；或者与SEQ ID NO：114表示的氨 基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％ 或85％的一致性。
在其他实施方案中，本发明提供特异性结合神经生长因子、包含 人轻链CDR3的分离人抗体，其中所述CDR3是以下的氨基酸序列： 其与SEQ ID NO：103表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能 性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；与SEQ ID NO：97表 示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至 少70％或85％的一致性；与SEQ ID NO：121表示的氨基酸序列或其抗 原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致 性；与SEQ ID NO：127表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功 能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致性；与SEQ ID NO：130 表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有 至少70％或78％的一致性；与SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列或其 抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少70％或78％的一致 性；与SEQ ID NO：109表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功 能性免疫球蛋白片段有至少70％或85％的一致性；与SEQ ID NO：134 表示的氨基酸序列或其抗原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有 至少78％的一致性；或者与SEQ ID NO：115表示的氨基酸序列或其抗 原结合片段或免疫功能性免疫球蛋白片段有至少85％的一致性。
4D4抗体重链可变区和轻链可变区的序列分别在SEQ ID NO：10 和12中显示。但是，许多潜在的CDR-接触残基易被其他氨基酸置换， 且仍让抗体保持对抗原相当的亲和性。同样，许多不与重链和轻链中 的CDR接触的框架残基能容纳相应位置的氨基酸被来自其他人抗体 的人共有氨基酸或来自其他小鼠抗体的氨基酸置换，又不对人抗体的 亲和性或非免疫原性造成显著的损失。可以选择各种另外的氨基酸， 以产生各种形式的本文所公开抗NGF抗体及其片段，其具有亲和性、 特异性、非免疫原性、制备容易性和其他需要性质的可变组合。
在另外的实施方案中，本发明抗体可在杂交瘤细胞系之外的细胞 系中表达。在这些实施方案中，编码特定抗体的序列可用来转化合适 的哺乳动物宿主细胞。根据这些实施方案，转化可用任何已知的用以 将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法来实现，包括例如将多核苷酸包 装在病毒中(或包装到病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或 者通过本领域公知的转染方法来实现，如美国专利第4,399,216号、第 4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号(所有这些专利对于任何 目的通过引用结合到本文中)所例示的转染方法。通常，所用的转化方 法可取决于待转化的宿主。用以将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞 中的方法是本领域公知的，包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙 沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔法、多核苷酸包 入脂质体中及DNA直接显微注射到细胞核中。
用标准的连接技术，将本发明NGF抗体的重链恒定区、重链可变 区、轻链恒定区或轻链可变区的氨基酸序列的编码核酸分子插入到适 当的表达载体中。在优选的实施方案中，将抗NGF抗体重链恒定区或 轻链恒定区附加到适当的可变区的C端，并连接到表达载体中。通常 对载体进行选择，使其在所采用的特定宿主细胞中具有功能(即载体与 宿主机制相容，使得基因的扩增和/或基因的表达能够发生)。有关表达 载体的综述参见METH.ENZ.185(Goeddel编辑)，1990，Academic Press。
通常，用于任何宿主细胞的表达载体会含有用于维持质粒和克隆 和表达外源核苷酸序列的序列。这种序列在某些实施方案中合称为“侧 翼序列”，通常包括一种或多种以下核苷酸序列：启动子、一种或多 种增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和接纳体剪接位 点的完全内含子序列、编码多肽分泌前导序列的序列、核糖体结合位 点、聚腺苷酸化序列、用以插入编码待表达多肽的核酸的多接头区、 及选择标记元件。这些序列的每一个在下文中讨论。
任选载体可含有“标记”编码序列，即位于抗NGF抗体多肽编码 序列的5′或3′末端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码聚组氨酸(如 六组氨酸)或者另一种“标记”，如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或 myc(存在针对其的市售抗体)。这种标记通常在多肽表达时融合至多 肽，可作为对宿主细胞中的NGF抗体进行亲和纯化和检测的手段。可 例如使用针对标记的抗体作为亲和基质，通过柱色谱法实现亲和纯 化。任选随后可通过各种手段，如使用某些用于进行切割的肽酶，使 标记从纯化的抗NGF抗体多肽除去。
侧翼序列可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或株 系)、异源的(即来自宿主细胞物种或株系之外的物种)、杂交的(即来自 不止一种来源的侧翼序列的组合)、合成的或者天然的。这样，侧翼序 列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物 生物体、或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中具有功能， 且能够被宿主细胞机制激活。
用于本发明载体的侧翼序列可通过任何本领域公知的几种方法 来获得。通常，用于本文的侧翼序列先前已经通过作图和/或限制性内 切核酸酶酶切消化鉴定，并因此可用适当的限制性内切核酸酶从合适 的组织来源分离出来。在某些情况下，侧翼序列的完全核苷酸序列可 能是已知的。在这一点上，可用本文描述的核酸合成或克隆方法合成 侧翼序列。
不管侧翼序列的全部或者仅有一部分是已知的，其都可以通过用 聚合酶链反应(PCR)来获得，和/或通过用合适的探针，如来自同一种 或另一种物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段，筛选基因组文库来获 得。在侧翼序列未知的情况下，含有侧翼序列的DNA片段可从可能含 有例如编码序列或者甚至另一种或几种基因的更大一段DNA分离出 来。可如下实现分离：通过限制性内切核酸酶酶切消化产生合适的 DNA片段，然后用琼脂糖凝胶纯化法、Qiagen柱色谱(Chatsworth，CA) 或技术人员公知的其他方法进行分离。为实现这个目的而选择合适的 酶对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
复制起点通常是可从市场购得的原核表达载体的一部分，该起点 协助载体在宿主细胞中的扩增。如果所选择的载体不含有复制起点位 点，则可以根据已知的序列通过化学法合成一个位点，并将其连接到 载体中。例如，质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复 制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，各种病毒起点(例如SV40、多 瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒HPV或BPV的 起点)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，复制起点组分对于哺 乳动物表达载体来说不是必要的(例如，SV40起点经常只是因为它还 含有病毒早期启动子才被使用)。
转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3′，用以终止转录。通 常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，紧接着poly-T序 列。虽然该序列可容易地从文库中克隆出来，或者甚至作为载体的一 部分而从市场购得，还也可用本文描述的核酸合成方法容易地合成出 来。
选择标记基因编码对于生长于选择性培养基的宿主细胞的存活 和生产所必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码具有如下作用的蛋 白质：(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、 四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供应不能 从合成培养基或确定成分培养基获得的关键性营养物。优选的选择标 记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因及四环素抗性基因。新 霉素抗性基因也可有利地用于原核和真核宿主细胞的选择。
可用其他选择基因来扩增待表达的基因。扩增是这样的过程，其 中生产对细胞生长或存活具有关键作用的蛋白质所需要的基因在重组 细胞的连续世代的染色体中串连重复。合适的哺乳动物选择标记的实 例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因和无启动子胸苷激酶基因。使哺乳 动物细胞转化子处于选择压力中，其中只有转化子才能依靠载体中存 在的选择性基因唯一生存。通过在将培养基中选择因子的浓度逐次提 高的条件下培养转化细胞，来施加选择压力，从而导致选择性基因和 编码另一种基因产物(如结合NGF多肽的抗体)的DNA同时扩增。结 果，从扩增DNA合成出的多肽如抗NGF抗体的量增加。
核糖体结合位点通常是mRNA的翻译起始所必需的，其特征为 Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该位点元件 通常位于启动子的3′，位于待表达多肽的编码序列的5′。
在某些情况下，如需要在真核宿主细胞表达系统中糖基化的情况 下，可以对各种前序列进行操作，以增进糖基化作用或提高产量。例 如，可以改变具体信号肽的肽酶切割位点，或添加前序列，这也可以 影响糖基化作用。最终蛋白质产物在-1位置(相对于成熟蛋白质的第一 个氨基酸)可能具有一个或多个随表达产生的、尚未完全被除去的另外 氨基酸。例如，最终蛋白质产物可具有一个或多个在肽酶切割位点发 现的连接到氨基末端的氨基酸残基。或者，使用某些酶切割位点时， 如果酶在成熟多肽内的这种区域进行切割，会导致出现所需多肽的略 微截短形式。
本发明的表达和克隆载体通常会含有被宿主生物体识别，且有效 连接到编码抗NGF抗体的分子的启动子。启动子是位于结构基因的起 始密码子的上游(即5′)的非转录序列(通常在约100至1000 bp之内)， 其控制结构基因的转录。启动子通常可归入以下两类之一：诱导型启 动子和组成型启动子。诱导型启动子响应培养条件中的某种变化(如营 养物的存在或缺乏或者温度的变化)，引发其控制下的DNA转录水平 提高。另一方面，组成型启动子均匀地转录它们所有效连接的基因， 也就是说，对基因表达的控制极少或者没有。已知有许多可被各种潜 在宿主细胞识别的启动子。合适的启动子如下有效连接到编码本发明 抗NGF抗体(包含重链或轻链)的DNA：用限制性酶酶切消化将启动子 从源DNA中除去，并将期望的启动子序列插入到载体中。
供与酵母宿主一起使用的合适启动子也是本领域公知的。酵母增 强子可有利地与酵母启动子一起使用。供与哺乳动物宿主细胞一起使 用的合适启动子是公知的，包括但不限于从病毒如多瘤病毒、禽痘病 毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、 逆转录病毒、乙肝病毒和最优选猴病毒40(SV40)的基因组获得的启动 子。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休 克启动子和肌动蛋白启动子。
可能具有重要性的另外启动子包括但不限于：SV40早期启动子 (Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-10)；CMV启动子(Thomsen 等，1984，Proc.Natl.Acad.USA 81：659-663)；Rous肉瘤病毒的3′长末端 重复序列中包含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-97)；疱疹胸 苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444- 45)；金属硫蛋白基因中的启动子和调节序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)；及原核启动子如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-31)；或者tac启动子(DeBoer等， 1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)。同样具有重要性的是显示 组织特异性且已应用于转基因动物的以下动物转录控制区：在胰腺腺 泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell 38：639-46；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 50：399-409(1986)；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β 细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115- 22)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等， 1984，Cell 38：647-58；Adames等，1985，Nature 318：533-38；Alexander 等，1987，Mol.Cell.Biol.，7：1436-44)；在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样 细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺癌病毒控制区(Leder等，1986， Cell 45：485-95)；在肝脏中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等，1987， Genes和Devel.1：268-76)；在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区 (Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.，5：1639-48；Hammer等，1987，Science 235：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等， 1987，Genes和Devel.1：161-71)；在髓样细胞中有活性的β珠蛋白基因 控制区(Mogram等，1985，Nature 315：338-40；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；在大脑中少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制 区(Readhead等，1987，cell 48：703-12)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白 轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314：283-86)；及在下丘脑中有活 性的促性腺素释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 234：1372- 78)。
增强子序列可插入到载体中，以增强高等真核生物对编码本发明 抗NGF抗体(包含轻链或重链)的DNA的转录。增强子是DNA的顺式 作用元件，长度通常为10-300bp，作用于启动子以增强转录作用。增 强子相对不依赖于方向和位置，其已被发现于转录单位的5′和3′位置。 已知有几种增强子序列可得自哺乳动物基因(例如珠蛋白、弹性蛋白 酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。但是，通常使用来自病毒的增强子。 本领域公知的SV40增强子、巨细胞早期启动子增强子、多瘤病毒增 强子和腺病毒增强子是用以激活真核启动子的示例性增强子元件。虽 然增强子在载体中可能位于编码序列的5′和3′，但它通常位于启动子5′ 的位点。
可从起始载体如市售载体构建本发明表达载体。这种载体可含有 或不含有所有期望的侧翼序列。在载体中不再存在本文描述的一种或 多种侧翼序列的情况下，可以个别地获得侧翼序列并将它们连接到载 体中。用以获得每一种侧翼序列的方法对本领域技术人员是公知的。
在载体已被构建出来，且编码组成抗NGF抗体的轻链、重链或者 轻链和重链的核酸分子已插入到载体的正确位点之后，可将所完成的 载体插入到合适的宿主细胞中，以进行扩增和/或多肽表达。可通过公 知的方法将抗NGF抗体的表达载体转化到选定的宿主细胞中，方法包 括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE- 葡聚糖介导的转染或者其他已知的技术。所选择的方法经常在部分上 由待使用的宿主细胞的类型决定。这些方法和其他合适的方法对技术 人员是公知的，在例如Sambrook等(出处同上)中有阐述。
宿主细胞当在适当的条件下培养时，会合成抗NGF抗体，所述抗 体随后可从培养基中收集(如果宿主细胞将抗体分泌到培养基中)或者 直接从产生抗体的宿主细胞收集(如果不分泌抗体)。适当的宿主细胞 的选择往往取决于各种因素，如期望的表达水平、活性所要求或所必 需的多肽修饰(如糖基化和磷酸化)及折叠成生物活性分子的容易程 度。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域公知的，包括但不限 于可获自美国典型培养物中心(ATCC)的无限增殖化细胞系，包括但不 限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴 肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其他细胞系。在某 些实施方案中，可通过确定哪种细胞系具有高表达水平且能组成型地 产生具有NGF结合性质的抗体，来选择细胞系。在另一个实施方案 中，可以选择不会产生自身抗体，但有能力产生和分泌异源抗体的B 细胞谱系的细胞系。
本发明抗体可用于检测生物样品中的NGF和鉴定能产生NGF蛋 白的细胞或组织。特异性结合NGF的本发明抗体可用于NGF介导疾 病的治疗。所述抗体能用于结合试验中，以检测NGF和抑制NGF与 NGF受体形成复合物。所述结合NGF和阻断与其他结合化合物相互 作用的抗体在调节NGF介导的疾病方面可能具有治疗性用途。在优选 的实施方案中，抗NGF抗体可阻断NGF与其受体的结合，这可能会 导致NGF诱导的信号转导级联被破坏。
本发明还涉及一种或多种本发明抗体在制备药物中的用途，所述 药物用于治疗患者中由NGF表达增加或对NGF敏感性提高而造成的 疼痛病症或疾病(例如本文公开的任一种病症或疾病)。
在优选的实施方案中，本发明提供包含治疗有效量的一种或多种 本发明抗体以及药物可接受稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂 和/或佐剂的药物组合物。优选可接受的制剂材料在所采用的剂量和浓 度下对接受者无毒。在优选的实施方案中，提供了包含治疗有效量的 抗NGF抗体的药物组合物。
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓 度下对接受者无毒。
在某些实施方案中，药物组合物可含有用以调节、维持或保持例 如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气 味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸收或穿透速率的制剂材料。 在这种实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(甘氨酸、谷 氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂、抗氧化剂(如抗 坏血酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、 Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露糖醇或甘 氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡 咯烷酮、β-环状糊精或羟丙基-β-环状糊精)；填充剂；单糖；二糖；及 其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、 明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合 物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反荷离子(如钠)；防腐剂 (如苯扎氯胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊 金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙 二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如泊 洛沙姆、PEG、脱水山梨糖酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯80、 triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗 糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾， 甘露糖醇、山梨糖醇)；传递介质；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参 见REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R. Gennaro编辑)，1990，Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，最佳的药物组合物往往由本领域技术人员根 据例如预定的给药途径、传递形式和期望的剂量来决定。参见例如 REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，出处同上。在某些 实施方案中，这种组合物可能影响本发明抗体的物理状态、稳定性、 体内释放速率和体内清除速率。
在某些实施方案中，药物组合物中的主要运载体或载体在性质上 可以是含水载体或非水载体。例如，合适的运载体或载体可以是注射 用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有常用于胃肠外给药组 合物的其他材料。中性缓冲盐水或者混合有血清白蛋白的盐水是另外 的示例性运载体。在优选的实施方案中，本发明药物组合物包含pH 约7.0-8.5的Tris缓冲液，或者pH约4.0-5.5的乙酸缓冲液，且可进一 步包含山梨醇、蔗糖、吐温-20和/或其合适的替代物。在本发明某些 实施方案中，抗NGF抗体组合物可如下制备，以供保存：将选定的具 有期望纯度的组合物与任选的配制物(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，出处同上)混合成冻干饼或水溶液 的形式。此外，在某些实施方案中，可用适当的赋形剂如蔗糖，将抗 NGF抗体产品配制成冻干物。
可以选择本发明药物组合物，以供胃肠外传递。另外，也可选择 组合物，以供吸入，或者供通过消化道传递，如口服传递。这种药物 可接受的组合物的制备在本领域的技术范围之内。
制剂成分优选以给药位点可接受的浓度存在。在某些实施方案 中，用缓冲剂将组合物维持在生理pH或者稍低的pH，通常在约5至 约8的pH范围。
当设想胃肠外给药时，用于本发明的治疗性组合物可以无热源 的、胃肠外可接受水溶液的形式提供，其包含期望的抗NGF抗体与药 物可接受的运载体。特别适合的胃肠外注射用运载体是无菌蒸馏水， 抗NGF抗体在其中配制成无菌的等渗溶液并被适当地保存。在某些实 施方案中，制剂可能涉及将期望的分子与为产品(其能够通过长效制剂 注射来递送)提供控释或缓释的介质一起配制，所述介质如可注射微球 体、生物可腐蚀颗粒、聚合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、玻珠或脂质体。 在某些实施方案中，也可使用具有提高在体循环中持续时间的作用的 透明质酸。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置，以引入 期望的抗体分子。
可配制本发明药物组合物，以供吸入。在这些实施方案中，抗NGF 抗体可方便地配制成可吸入干粉。在优选的实施方案中，也可用推进 剂配制抗NGF抗体吸入溶液，供作气雾剂传递。在某些实施方案中， 可将溶液雾化。肺部给药及其配制方法在国际专利申请 PCT/US94/001875(其通过引用结合到本文中)中有进一步的描述，所述 专利申请描述了化学修饰蛋白质的肺部传递法。
还设想制剂可口服给予。以这种方式给予的抗NGF抗体可与常用 于调配固体剂型(如片剂和胶囊剂)的载体一起或不与其一起进行配 制。在某些实施方案中，可设计胶囊剂，以在生物利用度最大和体循 环前降解最小的点在胃肠道中释放出制剂的活性部分。可包括另外的 介质，以促进抗NGF抗体的吸收。也可采用稀释剂、矫味剂、低熔点 蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
优选所提供的本发明药物组合物包含有效量的一种或多种抗 NGF抗体，其与适合于制造片剂的无毒赋形剂混合。通过将片剂溶解 于无菌水或另一种适当的运载体中，可将溶液配制成单位剂量形式。 合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢 钠、乳糖、或磷酸钙；或者粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或者 润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
另外的药物组合物对本领域技术人员来说是显然的，包括涉及缓 释或控释传递制剂中抗NGF抗体的制剂。用以配制多种其他缓释或控 释传递方式，如脂质体载体、生物可腐蚀微粒或多孔玻珠和长效注射 剂的技术，对本领域技术人员也是公知的。参见例如，国际专利申请 PCT/US93/00829(其通过引用结合到本文中)，该专利申请描述了用以 递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。缓释制剂可包括定型 制件形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。缓释基质包括聚 酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利第3,773,919号和欧洲专利申请公开 EP 058481所公开，各专利通过引用结合到本文中)、L-谷氨酸和γ-L- 谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等，1983，Biopolymers 22：547-556)、聚(甲 基丙烯酸-2-羟乙酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277 和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等， 出处同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开EP 133,988)。缓释 组合物还可包括能通过任何本领域公知的几种方法制备的脂质体。参 见例如Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.UNA 82：3688-3692；欧 洲专利申请公开EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949，这些文献通 过引用结合到本文中。
用于体内给药的药物组合物通常作为无菌制剂来提供。可通过滤 过无菌过滤膜来实现灭菌。当组合物冻干时，可在冻干和再生之前或 之后用这种方法进行灭菌。供胃肠外给药的组合物可以冻干形式保 藏，或者保藏于溶液中。胃肠外组合物通常装入具有无菌入口的容器， 例如具有可用皮下注射针刺穿的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
一旦配制好药物组合物，其可以溶液、悬浮液、凝胶、乳浊液、 固体的形式，或者作为脱水或冻干粉末保藏于无菌小瓶中。这种制剂 可以以现成可用的形式或者以给药前可再生的形式(例如冻干形式)进 行保藏。
本发明还提供用以产生单剂量给药单位的药盒。每个本发明药盒 可装有含有干燥蛋白质的第一容器和含有含水制剂的第二容器。在本 发明的某些实施方案中，提供装有单室和多室预灌装注射器(例如液体 注射器和lyosyringe)的药盒。
待进行治疗性应用的含抗NGF抗体的药物组合物的有效量取决 于例如治疗内容和目标。本领域技术人员会认识到，用于治疗的适当 剂量水平部分根据所递送的分子、抗NGF抗体所应用的适应症、给药 途径以及患者的大小(体重、体表面积或器官大小)和/或状态(年龄和总 体健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量和修改 给药途径，以获得最佳治疗效果。取决于上述因素，典型的剂量可在 约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高的范围内。在优选的实施方案 中，剂量可在0.1μg/kg至约30mg/kg的范围内；更优选在1μg/kg至 约30mg/kg的范围内；或者甚至更优选在5μg/kg至约30mg/kg的范 围内。
给药频率往往取决于所用制剂中具体抗NGF抗体的药物动力学 参数。通常，临床医生给予组合物，直到达到能实现期望效果的剂量。 因此，组合物可以单剂量给予，或者以两个或多个剂量(可能含有或不 含有相同量的期望分子)随时间推移来给予，或者通过植入装置或插管 进行连续输液来给予。适当剂量的进一步改进可由本领域普通技术人 员常规进行，这在他们日常执行的任务范围内。可通过使用适当的剂 量-反应数据，对适当剂量加以确定。在某些实施方案中，本发明抗体 可长时间给予患者。长期给予本发明抗体能使通常伴随针对非人动物 中人抗原(例如在非人物种中产生的非完全人抗体)产生的抗体的不利 免疫或变应性反应减至最少。
药物组合物的给药途径与已知的方法相一致，例如口服给药；通 过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、 门静脉内(intraportal)或病灶内(intralesional)途径注射给药；通过缓释系 统或通过植入装置给药。在某些实施方案中，可通过大剂量注射或连 续输液给予组合物，或者通过植入装置给予组合物。
也可通过植入已吸收有或包入了期望分子的薄膜、海绵或其它适 当材料，局部给予组合物。在使用植入装置的某些实施方案中，植入 装置可植入到任何合适的组织和器官中，期望分子的递送可通过扩 散、定时释放大剂量或连续给予来进行。
还期望在活体外使用本发明的抗NGF抗体药物组合物。在这种情 况下，使从患者体内取出的细胞、组织或器官暴露于抗NGF抗体药物 组合物，随后将细胞、组织和/或器官植回患者体内。
具体地说，可通过植入用本文所述方法基因工程改造的细胞以表 达和分泌多肽，来递送抗NGF抗体。在某些实施方案中，这种细胞可 以是动物细胞或人类细胞，且可以是自体同源细胞、异源细胞或异种 细胞。在某些实施方案中，细胞可以是无限增殖化细胞。在其他实施 方案中，为降低出现免疫反应的可能性，可使细胞包囊化，以避免周 围组织的浸润。在其它实施方案中，包囊材料通常是生物相容性、半 透性高分子包裹物或薄膜，其允许蛋白质产物释放，但防止细胞被患 者的免疫系统或者被来自周围组织的其他有害因素破坏。
实施例
以下实施例，包括所进行的实验和所得到的结果，只供说明目 的，不能被理解为限制本发明。
实施例1
从大肠杆菌细胞产生人NGF蛋白
rHu-NGF(1-120)的克隆
用具有SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示序列的寡核苷酸引物 及标准的PCR技术，从cDNA扩增编码人NGF的核苷酸序列。5′引物 产生NdeI限制性酶切位点和紧接在成熟序列的密码子1(丝氨酸)之前 的甲硫氨酸起始密码子。3′引物产生紧接在终止密码子之后的BamHI 限制性酶切位点。所得PCR产物经凝胶纯化，用限制性内切核酸酶 NdeI和BamHI消化，然后连接到同样用NdeI和BamHI消化的载体 pCFM1656。将连接的DNA转化到大肠杆菌657株感受态宿主细胞 中。筛选具有产生重组蛋白质产物和拥有携带正确核苷酸序列(即SEQ ID NO：29)的质粒的能力的克隆。重组人NGF 1-120的氨基酸序列如 SEQ ID NO：30所示。
表达载体pCFM1656(ATCC#69576)来源于美国专利第4,710,473 号描述的表达载体系统。pCFM1656质粒可如下来源于所述的 pCFM836质粒(专利第4,710,473号)：(a)通过用T4聚合酶进行末端 补平，然后进行平端连接，破坏两个内源NdeI限制性酶切位点；(b)用 得自pCFM636(专利第4,710,473号)的含有PL启动子的类似片段，替 换独特AatII和ClaI限制性酶切位点之间的含有合成PL启动子的DNA 序列；然后(c)用由具有SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示核苷酸 序列的两个探针退火获得的寡核苷酸，置换独特ClaI和KpnI限制性 酶切位点之间的小DNA序列。
大肠杆菌K12宿主株(Amgen 657株)是获自大肠杆菌遗传储备中 心(E.coli Genetic Stock Center，Yale University，New Haven，CT(CGSC 6159株)的大肠杆菌W1485(为K12株)的衍生物。
rHu-NGF (1-120)的表达
在丰富培养基中以补料分批方式发酵含有NGF表达构建物(如上 所述)的大肠杆菌细胞。细胞在30℃下生长至OD(600nm处)为49， 然后通过变温至42℃进行诱导。诱导后4小时离心收获细胞。最终 OD为75。表达产率经测定为大约0.15g/L。
rHu-NGF (1-120)的重折叠与纯化
细胞糊在微观流体装置(Microfluidizer)中裂解，在10,000Xg离心 30分钟，沉淀用1％脱氧胆酸洗涤，如上离心，然后所得沉淀用冷水 洗涤，再次离心。将所得沉淀(WIB-洗涤包涵体)重新悬浮于变性剂 8M盐酸胍，50mM Tris pH 8.5(含10mM DTT)，在室温下溶解1小时， 在10,000Xg离心30分钟，小心倾析上清液，然后在4℃含氧化还原 对的含水缓冲液中稀释25倍，持续5天。然后滴定所得重折叠物至 pH 3.0，滤过0.45uM过滤器。用Sp-Sepharose快速流动柱以标准NaCl 梯度纯化重折叠物。随后浓缩得自阳离子交换柱的合并液，并将等分 部分冻藏于-80℃。蛋白质的纯度通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)进行测定，通过考马斯蓝染色进行分析。通过这种方法获 得的纯化蛋白质超过主带的90％。
实施例2
抗神经生长因子(NGF)人单克隆抗体的生产
转基因HuMab小鼠和KM小鼠
用转基因小鼠HCo7、HCo12、HCo7+HCo12和KM品系(它们每 一个都表达人抗体基因)制备抗NGF完全人单克隆抗体。在这些小鼠 品系的每一个中，内源小鼠κ轻链基因已如Chen等(1993，EMBO J. 12：811-820)所述被纯合地破坏，内源小鼠重链基因已如国际专利申请 公开WO 01/09187(通过引用结合到本文中)的实施例1所描述被纯合 地破坏。这些小鼠品系的每一个均携有如Fishwild等(1996，Nature Biotechnology 14：845-851)所述的人κ轻链转基因KCo5。HCo7品系携 有如美国专利第5,545,806号、第5,625,825号和第5,545,807号(通过 引用结合到本文中)描述的HCo7人重链转基因。HCo12品系携有如国 际专利申请公开WO 01/09187(通过引用结合到本文中)的实施例2所 描述HCo12人重链转基因。HCo7+HCo12品系携有HCo7和HCo12 重链转基因，对每个转基因来说都是半纯合的。KM小鼠包含如 Tomizuka等(1997，Nature Genet.16，133-143和2000，Proc.Natl.Acad. Sci，97，722-727)所描述的SC20重链转基因。该转基因没有整合到小鼠 染色体中，相反作为独立的染色体片段而增殖。该片段包括大约15MB 的人染色体14。它包含整个人重链基因座，包括所有VH、D和JH基 因节段及所有重链恒定区同种型。所有这些品系在本文中称为HuMab 小鼠。
HuMab免疫：
为产生抗NGF完全人单克隆抗体，用来源于大肠杆菌细胞的纯化 重组NGF作为抗原(实施例1)免疫HuMab小鼠。HuMab小鼠的一般 免疫方案描述于Lonberg等(1994，Nature 368：856-859；Fishwild等，出 处同上，及国际专利申请公开WO 98/24884，上述各文献的教导通过 引用结合到本文中)。小鼠第一次灌注抗原时为6-16周龄。用纯化重组 NGF抗原制剂(25-100μg)，通过腹膜内(IP)或皮下(SC)免疫HuMab小 鼠。
如下实现HuMab转基因小鼠的免疫：用完全弗氏佐剂中的抗原 进行两次注射，随后2-4周内用完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(共 达9次免疫)。每种抗原免疫几打小鼠。共有118只HCo7、HCo12、 HCo7+HCo12和KM品系的小鼠用NGF抗原免疫。通过眶后取血监测 免疫应答。
为选出产生结合人HGF的抗体的HuMab小鼠，如Fishwild等(出 处同上)所述通过ELISA检测免疫小鼠的血清。简单的说，用1-2μg/mL PBS中的得自大肠杆菌的纯化重组NGF(实施例1)涂布微量滴定板(50 μL/孔)，在4℃下孵育过夜，然后用200μL/孔的溶于PBS/Tween(0.05％) 的5％鸡血清封闭。将NGF免疫小鼠的血浆稀释液加入到每个孔中， 在环境温度下孵育1-2小时。用PBS/Tween洗涤微量滴定板，然后在 室温下与缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG Fc-特异性多克隆 试剂孵育1小时。微量滴定板洗涤后，用ABTS底物(Sigma Chemical Co.， St.Louis，MO，目录号A-1888，0.22mg/mL)显影，通过在415-495nm 波长下测定光密度(OD)进行分光光度分析。具有足够滴度的抗NGF 人免疫球蛋白的小鼠用来如下文所述产生单克隆抗体。
生产抗NGF人单克隆抗体的杂交瘤的产生
通过在小鼠处死前2天用抗原静脉内强化，制备用以生产单克隆 抗体的小鼠，之后将其脾脏取出。采用标准的方案，从HuMab小鼠分 离小鼠脾细胞，用PEG将其融合到小鼠骨髓瘤细胞系。通常，对每种 抗原，执行10-20个融合。
简单的说，用50％PEG(Sigma)，将得自免疫小鼠的脾脏淋巴细 胞的单细胞悬浮液融合到四分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌性小 鼠骨髓瘤细胞(ATCC，检索号CRL 1580)。以大约1×105/孔将细胞涂布 于平底微量滴定板，之后在选择性培养基中孵育约2周，所述选择性 培养基含有10％胎牛血清、10％P388D1-(ATCC，检索号CRL TIB-63) 条件培养基、DMEM(Mediatech，目录号CRL 10013，含高含量葡萄 糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠)中的3-5％origen(IGEN)加上5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/mL庆大霉素和1xHAT(Sigma， 目录号CRL P-7185)。1-2周后，将细胞培养于用HT置换HAT的培养 基中。
筛选所得杂交瘤，找出能生产抗原特异性抗体的杂交瘤。通过 ELISA筛选单独的孔(如上所述)，找出人抗NGF单克隆IgG抗体。一 旦出现大量杂交瘤生长，通常在10-14天后对培养基进行监测。重新 涂布分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，如果仍为人IgG阳性，则通过有 限稀释亚克隆抗NGF单克隆抗体至少两次。然后体外培养稳定的亚克 隆，以在组织培养基中产生少量的抗体，供鉴定用。
结合NGF的人单克隆抗体的选择
用如上所述的ELISA试验筛选显示与NGF免疫原呈阳性反应性 的杂交瘤。亚克隆分泌高亲合力结合NGF的单克隆抗体的杂交瘤，并 进一步进行表征。从每个杂交瘤选出一个保留亲本细胞反应性(通过 ELISA测定)的克隆，用来制备5-10个小瓶装细胞库，并保藏于液氮 中。
进行同种型特异性ELISA，以确定按本文公开而生产出来的单克 隆抗体的同种型。在这些实验中，用1μg/mL的小鼠抗人κ轻链的PBS 溶液，以50μL/孔涂布微量滴定板，并在4℃下孵育过夜。微量滴定 板用5％鸡血清封闭后，与得自每个受试单克隆抗体的上清液及纯化的 同种型对照反应。在环境温度下孵育微量滴定板1-2小时。然后各孔 与各种人IgG特异性辣根过氧化物酶缀合山羊抗人多克隆抗血清反 应，微量滴定板如上所述进行显影和分析。
对于从杂交瘤上清液纯化得到的、经ELISA检测显示与NGF显 著结合的单克隆抗体，用下文描述的多种生物测定法，进一步检测其 生物活性。
实施例3
选择和克隆具有有效NGF中和活性的抗NGF抗体
通过测定每个修饰肽封闭NGF诱导香草素受体-1(VR1)表达的能 力，来评价原先在实施例2中鉴定为NGF活性抑制剂(即NGF“中和”) 的抗体的有效性。
背根神经节神经元培养物
在无菌条件下，一个接一个地从19天龄(E19)胚胎大鼠的所有脊 髓节段剖分背根神经节(DRG)，所述胚胎大鼠通过外科手术从定时怀 孕、定期麻醉的Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Wilmington，MA) 的子宫中取出。将DRG收集于用冰预冷的、含5％热灭活马血清 (GibcoBRL)的L-15培养基(GibcoBRL，Grand Island，NY)，除去任何疏 松结缔组织和血管。将DRG在无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲 盐水(DPBS)，pH 7.4(GibcoBRL)中漂洗两次。然后用木瓜蛋白酶解离系 统(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)将DRG解离为单细胞 悬浮液。简单的说，将DRG在消化溶液(含有20U/ml木瓜蛋白酶的 Earle平衡盐溶液(EBSS))中，37℃下孵育50分钟。通过用火琢巴氏吸 管在解离培养基中研磨，使细胞解离，所述解离培养基由MEM/Ham′s F12(1∶1)、1mg/ml卵类黏蛋白抑制剂和1mg/ml卵清蛋白以及0.005％ 脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)组成。
以200×g将解离的细胞沉淀5分钟，然后重新悬浮于含1mg/ml 卵类黏蛋白抑制剂、1mg/ml卵清蛋白和0.005％DNA酶的EBSS中。 以200×g使细胞悬浮液离心通过含10mg/ml卵类黏蛋白抑制剂、10 mg/ml卵清蛋白的梯度溶液，持续6分钟，以除去细胞碎片，然后滤 过88-μm尼龙筛(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，以除去所有的凝块。 用血细胞计测定细胞数目，在完全培养基中以10×103个细胞/孔将细 胞接种于用聚鸟氨酸100μg/mL(Sigma，St.Louis，MO)和小鼠层粘连蛋 白1μg/mL(GibcoBRL)涂布的96孔板。所述完全培养基由极限必需培 养基(MEM)和Ham′s F12(1∶1)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml) 及10％热灭活马血清(GibcoBRL)组成。将培养物保持在37℃、5％CO2和100％湿度。为控制非神经元细胞的生长，培养基中包含5-氟-2′-脱 氧尿苷(75，uM)和尿苷(180，cEM)。
用NGF和抗NGF进行处理
平板接种两小时后，用重组人β-NGF(Amgen)或重组大鼠β-NGF (R&D Systems，Minneapolis，MN)以10ng/ml(0.38nM)的浓度处理细 胞。将包含连续稀释抗NGF抗体(R&D Systems)的阳性对照涂敷于每 个培养板。用3.16倍连续稀释，加入十个浓度的受试抗体。所有样品 在加入到培养物之前均稀释于完全培养基中。孵育时间为40小时，之 后进行VR1表达的测定。
DRG神经元中VR1表达的测定
培养物用含4％多聚甲醛的Hanks平衡盐溶液固定15分钟，用 Superblock(Pierce，Rockford，IL)封闭，并在室温下用0.25％Nonidet P- 40(Sigma)的Tris-HCl(Sigma)-缓冲盐水(TBS)透化处理1小时。培养 物用含0.1％吐温20(Sigma)的TBS漂洗一次，接着在室温下与兔抗 VR1 IgG孵育一个半小时，然后再在室温下与Eu标记抗兔第二抗体 (Wallac Oy，Turku，芬兰)孵育1小时。每次抗体孵育之后，用TBS(3× 5分钟，慢慢振摇)进行洗涤。将加强溶液(150μl/孔，Wallac Oy)加入到 培养物中。然后用时间分辨荧光计(Wallac Oy)测量荧光信号。通过与 NGF滴定的标准曲线(0-1000ng/ml)比较，测定用修饰肽处理的样品中 的VR1表达。通过与不经NGF处理的对照比较，确定NGF对DRG 神经元中VR1表达的抑制百分率(与最大可能抑制相比较)。结果在表 2和5中给出。
细胞系标记为#110-#129。细胞系#119、#124和#125的抗体显示 极强的NGF中和活性(图1)。#124细胞系是亲本细胞系，也称为4D4。 #119和#125细胞系是4D4亲本的亚克隆。使包含杂交瘤#124(4D4) 的原始小瓶中的另外样品生长，并标记为#167(4D4)。
使由杂交瘤#167(4D4)产生的抗体进行与前面样品一样的基于 DRG神经元的NGF中和试验。抗体#167(4D4)显示强烈的抗NGF活 性，IC50为0.50nM(图2)，这与样品#119、#124和#125的活性一致。 这四个样品的活性在表2中显示。
表2
N端测序和质谱
制备纯化的抗NGF杂交瘤抗体样品，供蛋白质测序和LC/MS分 析。通过用Amicon centriprep-30将培养基浓缩至体积小于15ml，从 条件培养基中纯化抗体。用PBS洗涤一批rProA(Pharmacia)树脂4x， 在最后一次洗涤之后用PBS调成50％浆液。将适当量的rProA树脂(大 约5ug抗体/ul树脂，但所用树脂不少于50ul)加入到抗体样品中，于 4℃下孵育过夜。离心Ab-树脂混合物，收集未结合的级分。加入0.5ml PBS，并将样品转移到0.45um Spin-X(CoStar)管，然后以10000rpm离 心样品3分钟。接着用0.5ml PBS洗涤树脂至少3次，然后加入1.5x 树脂体积的0.1M甘氨酸(pH 2.7)，在室温下孵育10分钟，然后以10000 rpm再次离心3分钟，收集上清液。再重复这个洗脱步骤两次，然后 用二十五分之一体积的1.0M tris(pH9.2)中和合并的上清液。
用新的Spin-x管(0.2um)进行最后一次过滤步骤之后，以人IgG 为标准，用标准的Bradford测定法，或者使用在280处的吸光度(对于 较大的样本)，对抗体进行定量。还用2ug的各样品与2ug的人IgG1，k (Sigma)跑胶。为进行质谱分析，使4微克的样品去糖基化、还原，并 加样到与Finingan LCQ质谱仪在线连接的HPLC(HP1090)。通过反相 HPLC使轻链与重链分离。还收集轻链和重链，供N端蛋白质测序分 析。
抗NGF#167(4D4)抗体样品的轻链和重链的N端序列与抗NGF #119(4D4)抗体样品的两个N端序列吻合。此外，抗体的测量质量表 明，得自#167和#119杂交瘤的分离抗体相同。抗NGF#167的轻链的 去叠合测量质量(23096)与抗NGF Ab#119的轻链的测量质量(23096) 吻合。
克隆抗NGF抗体重链和轻链
用表达最强NGF结合单克隆抗体的杂交瘤4D4.D7作为原始材 料，用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA。用具有突出端衔接头 (5′-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3′)(SEQ ID NO：33)的 随机引物，合成cDNA第一链，用GeneRacerTM试剂盒(Invitrogen)按照 厂商说明书进行5′RACE(cDNA末端快速扩增)制备试验。为制备完全 轻链的编码cDNA，正向引物用GeneRacerTM嵌套引物，反向引物用 5′-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3′(SEQ ID NO：34)。为制备编 码重链可变区的cDNA，正向引物用GeneRacerTM嵌套引物，反向引 物用5′-TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3′(SEQ ID NO 35)。将RACE 产物克隆到pCR4-TOPO(Invitrogen)中，并测定序列。用共有序列设计 用于全长抗体链PCR扩增的引物。
为制备编码抗NGF 4D4.D7κ轻链的cDNA，5′PCR引物编码信号 序列的氨基末端、XbaI限制性酶切位点和最优化的Kozak序列(5′-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3′；SEQ ID NO：36)。3′引物编码羧基末端和终止 密码子以及SalI限制性酶切位点(5′-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3′；SEQ ID NO：37)。将所得PCR产物片 段纯化，用XbaI和SalI消化，然后凝胶分离，并连接到哺乳动物表达 载体pDSRα20(参见国际申请公开WO 90/14363，其对于任何目的通 过引用结合到本文中)。pDSRα20通过用定点诱变使pDSRα19中的核 苷酸2563从“鸟苷”变成“腺苷”而产生。)。
为制备编码抗NGF4D4.D7重链的cDNA，5′PCR引物编码信号序 列的氨基末端、XbaI限制性酶切位点和最优化的Kozak序列(5′-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3′；SEQ ID NO：38)。3′引物编码羧基末端和终 止密码子以及SalI限制性酶切位点(5′-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3′；SEQ ID NO：39)。将所得产物纯化， 用XbaI和SalI消化，凝胶分离，并连接到pDSRα20载体。
通过将核苷酸序列翻译成预测的氨基酸并把氨基酸的分子量加 在一起而测算，抗NGF Ab 4D4克隆的轻链的DNA序列的计算质量 (23099)与通过质谱分析测量出来的测量质量吻合。在仪器偏差范围 内，抗-NGF Ab #167的重链的去叠合测量质量(49479)与抗-NGF Ab #119的重链的测量质量(49484)吻合，也与抗NGF Ab 4D4克隆的重链 的DNA序列的理论质量(49484)吻合(表3)。
N末端蛋白序列和LC/MS的数据证实，杂交瘤#119表达与杂交 瘤#167相同的抗体。此外，基于序列的抗体计算质量进一步确证该观 察结果。
表3——质谱分析结果汇总
抗NGF Ab Ab#167的 测量质量 Ab#119的 测量质量 从Ab 4D4的DNA序 列推知的理论质量 轻链 23096 23096 23099 重链 49479 49484 49484
实施例4
抗NGF抗体在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达
通过用磷酸钙方法，将4D4重链/pDSRα19IgG2或4D4-重链 /pDSRα19IgG1和NGF-κ/pDSRα19质粒共转染到二氢叶酸还原酶缺 陷型(DHER-)无血清适应中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，实现4D4抗NGF mAb的稳定表达。在含有透析血清但不含次黄嘌呤-胸苷的培养基中选 择转染细胞，以确保表达HDFR酶的细胞的生长。用例如ELISA的试 验法筛选转染的克隆，以检测条件培养基中4D4抗NGF mAb的表达。 使表达量最高的克隆处于浓度不断增加的甲氨喋呤(MTX)之下，以进 行HDFR扩增。用例如ELISA的试验法筛选MTX扩增克隆，以检测 条件培养基中表达更高的4D4抗NGF mAb。使表达量最高的克隆进行 亚克隆，以获得均一的群体，创建细胞库。
可用与以上描述的产生抗NGF单克隆抗体相同的方案，在HDFR 缺陷型中国仓鼠卵巢细胞中产生本发明重组抗NGF抗体。将编码本发 明每种抗NGF抗体完全重链或轻链的DNA序列克隆到表达载体中。 用能够表达适当抗NGF抗体的完全重链的表达载体和表达适当抗 NGF抗体的完全轻链的表达载体共转染CHO缺陷型细胞。例如，为 产生抗NGF抗体，用能够表达包含SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的 完全重链的载体和能够表达包含SEQ ID NO：44所示氨基酸序列的完 全轻链的载体共转染细胞。表4总结了具有各种IgG重链恒定区的4D4 抗体的完全重链和完全轻链。
表4
抗体 重链可变区+重链恒定区 完全重链 4D4(IgG2) SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：40 4D4(IgG1) SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：41 4D4(IgG4) SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：42 4D4(IgG3) SEQ ID NO：10+SEQ ID NO：26 SEQ ID NO：43
实施例5
鉴定抗NGF 4D4抗体的活性
检测在生长于旋动培养(S)或滚瓶培养(R)条件下的细胞中产生的 瞬时表达的抗NGF 4D4抗体，以确认它们在如上所述(实施例3)进行 的基于DRG神经元的NGF中和生物测定中中和NGF的能力。
使NGF抗体在无血清悬浮液适应293T细胞中瞬时表达。用500 mL或1L培养物进行转染。简单的说，在4℃下，以2,500RPM离心 细胞接种物(5.0X105个细胞/mL X培养物体积)10分钟，除去条件培 养基。将细胞重新悬浮于无血清DMEM，在4℃下，以2,500RPM再 次离心10分钟。吸出洗涤溶液后，在1L或3L旋动培养瓶中，将细胞 重新悬浮于生长培养基[DMEM/F12(3∶1)+1X胰岛素-转铁蛋白-硒补 充物+1X Pen Strep Glut+2mML-谷氨酰胺+20mM HEPES+0.01％ Pluronic F68]。在磁力搅拌板上以125RPM维持旋动瓶培养物，所述 磁力搅拌板置于维持在37℃和5％CO2的加湿培养箱中。在50mL锥 形瓶中将质粒DNA与转染试剂复合。在无血清DMEM中制备DNA- 转染试剂复合物，体积为最终培养物体积的5％。首先将1μg质粒 DNA/mL培养物加入无血清DMEM，然后加入1μl X-TremeGene RO-1539/mL培养物。将复合物在室温下孵育大约30分钟，然后加入 到旋动瓶中的细胞中。转染/表达进行7天之后，在4℃下，以4,000 RPM离心60分钟收获条件培养基。
对于滚瓶瞬时转染，我们使用了生长和维持于DMEM的293T贴 壁细胞，所述DMEM补充有5％FBS+1X非必需氨基酸+1X Pen Strep Glut+1X丙酮酸钠。将大约4-5X 107个293T细胞接种于850cm2滚瓶过夜。然后在第二天，用FuGene6转染试剂转染先前接种细胞。 用大约6.75mL无血清DMEM制备DNA-转染试剂混合物。首先加入 675μl FuGene6转染试剂，然后加入112.5μg质粒DNA。在室温下孵 育所得复合物30分钟。然后将全部的混合物加入到滚瓶中。滚瓶用 5％CO2气体混合物充气，盖紧，置于37℃培养箱中，所述培养箱放 在以0.35RPM旋转的滚架(roller rack)上。转染进行24小时后，用100 mL DMEM+1X胰岛素-转铁蛋白-硒补充物+1X Pen Strep Glut+1X 非必需氨基酸+1X丙酮酸钠置换培养基。通常，每个滚瓶获得两份 100ml 48小时收获物。将收获的无血清条件培养基集中在一起，在4℃ 下以4,000RPM离心30分钟。
4D4.IgG1和4D4.IgG2对人NGF均显示强活性，IC50值约为0.14 nM至约0.2nM(图2)。活性试验的结果在表5中汇总。这些抗体对大 鼠NGF显示极少活性(图3)。这些结果与从上述杂交瘤直接检测得出 的抗体活性类似。
表5
Ab IC50hNGF(nM) IC50rNGF(nM) 4D4.IgG1.R 0.1488 ＞34nM 4D4.IgG1.S 0.1587 ＞45nM 4D4.IgG2.R 0.2047 ＞59nM 4D4.IgG2.S 0.2063 ＞37nM
hNGF＝人NGF，rNGF＝大鼠NGF，R＝滚瓶培养，S＝旋动培养
实施例6
抗NGF抗体的生产
抗NGF抗体在CHO细胞的克隆系中表达产生。对于每次生产运 行，将单个小瓶中的细胞解冻到无血清细胞培养基中。先让细胞在T 形瓶中生长，接着在旋动瓶中生长，然后在不锈钢反应器中生长，逐 步放大到2000L生物反应器。生产是在2000L生物反应器中用补料分 批培养方式进行的，将含浓缩培养基成分的营养物原料添加到反应器 中，以维持细胞的生长和培养物的生存力。生产持续大约两周，期间 抗NGF抗体由细胞组成型产生，并被分泌到细胞培养基中。
将生产反应器控制在预定的pH、温度和溶氧水平：pH通过加入 二氧化碳气和碳酸钠进行控制；溶氧通过通入空气、氮气和氧气进行 控制。
在生产结束时，将细胞培养液加进圆盘式离心机，使培养物上清 液与细胞分离。通过深度滤膜，然后是0.2μm过滤器，进一步澄清浓 缩液。然后通过切向流超滤法浓缩澄清的条件培养基。浓缩条件培养 基15至30倍。然后所得的浓缩条件培养基进行纯化加工，或者冻藏 以待日后纯化。
实施例7
与其他神经营养蛋白的交叉反应性
在不同的生物试验中，检测4D4抗体对人NT3或者人BDNF的 交叉反应性，包括针对人NT3的DRG神经元存活试验，及针对人 BDNF的培养DA神经元中DA摄入的试验。
用NT3、抗NT3和抗NGF处理DRG培养物
平板接种两小时后，用重组hNT-3100ng/ml(3.8nM)处理DRG 细胞(分离程序在以上实施例3中描述)。连续稀释的抗hNT3抗体(R&D) 用作阳性对照样本。以10个点的3.16倍连续稀释的各种浓度加入未 知样本(抗NGF Ab样本)。所有样本在加入到培养物之前先在完全培养 基中稀释。
DRG神经元中MAP2表达的测定
培养物用含4％多聚甲醛的Hanks平衡盐溶液固定15分钟，用 Superblock(Pierce)封闭1小时，并在室温(RT)下用0.25％Nonidet P-40 (Sigma)的Tris-HCl(Sigma)-缓冲盐水(TBS)透化处理1小时。培养物用 含0.1％吐温20(Sigma)的TBS漂洗一次，接着在室温下与小鼠抗MAP2 IgG(Chemicon，Temecula，CA)孵育1.5小时，然后再在室温下与Eu标 记抗小鼠第二抗体(Wallac Oy，Turku，芬兰)孵育1小时。每次抗体孵育 之后，用TBS(3×5分钟，轻轻振摇)进行洗涤。将增强溶液(150μl/ 孔，Wallac Oy)加入到培养物中，然后用时间分辨荧光计(Wallac Oy)测 量荧光信号。
胚胎中脑培养
使用19天龄(E19)胚胎Sprague-Dawley大鼠(Jackson Labs)。将富 集多巴胺能神经元的腹侧中脑组织切除下来，并转移到冷的Dulbecco 磷酸缓冲盐水(DPBS)，pH 7.4，不含Ca++和Mg++(Gibco)。用木瓜蛋白 酶解离系统(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)将组织片段解 离为单细胞悬浮液。简单的说，将组织片段在消化溶液(含有20单位 /ml木瓜蛋白酶在Earle平衡盐溶液(EBSS))中，37℃下孵育50分钟。 通过用火琢巴氏吸管在解离培养基中研磨，使细胞解离，所述解离培 养基由MEM/Ham′s F12(1∶1)、1mg/ml卵类黏蛋白抑制剂和1mg/ml 卵清蛋白以及0.005％脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)组成。以200×g将 解离的细胞沉淀5分钟，然后重新悬浮于含1mg/ml卵类黏蛋白抑制 剂、1mg/ml卵清蛋白和0.005％DNA酶的EBSS中。以200×g使细 胞悬浮液离心通过含10mg/ml卵类黏蛋白抑制剂、10mg/ml卵清蛋白 的梯度溶液，持续6分钟，以除去细胞碎片；然后滤过25μg Nitex尼 龙筛(Tetko，Inc.)，以除去凝块。以100,000/cm2的密度将解离细胞平板 接种于组织培养板中。如前所述(Louis JC等，J.Pharmacol.Exp.Ther. 1992；262：1274-1283.)，用聚鸟氨酸100μg/ml(Sigma)和小鼠层粘连蛋 白1μg/ml(GibcoBRL)预先涂布组织培养板。培养基由极限必需培养基 (MEM)/Ham′s F12(1∶1)、12％马血清(GibcoBRL)、100μg/ml转铁蛋白 和2.5μg/ml胰岛素(Sigma)组成。培养物在37℃、5％CO2和100％湿 度下保持6天。
用BDNF和抗BDNF或抗NGF处理中脑培养物
平板接种两小时后，以10ng/ml的浓度将BDNF加入到细胞中， 然后加入系列浓度的抗NGF Ab样品。抗BDNF抗体(在Amgen公司 产生)用作阳性对照样本。
中脑神经元中的DA摄入
如前所述(Friedman，L.和Mytilineou，C.，Neuroscience Letters 1987；79：65-72)进行多巴胺摄入试验。在第6天，用预加温的含5.6mM 葡萄糖、1.3mM EDTA和0.5mM帕吉林(单胺氧化酶抑制剂)的 Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤培养物一次。在37℃下，将培 养物在含50nM[3H]DA(NEN)的摄入缓冲液中孵育60分钟。通过除 去摄入缓冲液停止摄入，用Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液洗涤培养物三 次。通过将液体闪烁混合物OpticPhase SuperMix(Wallac)直接加入到 培养物中，使细胞裂解，以释放出[3H]DA。然后用Microbeta-Plus液 体闪烁计数器(Wallac，Inc.)计算细胞裂解物的放射性。通过将0.5mM GBR12909(高亲和性DA摄入位点的特异性抑制剂，Heikkila RE和 Mazino L，European Journal ofPharmacology 1984；103：241-8)加入到摄 入缓冲液中，来估算低亲和性DA摄入，然后总摄入量与其相减，得 到高亲和性DA摄入值。
表6
抗体 IC50hNT-3(nM) IC50hBDNF(nM) 4D4(IgG2) ＞13.75 ＞13.75
实施例8
供抗NGF抗体结合的表位的鉴定
通过有限蛋白酶解进行表位作图
在4℃下，将5微克(μg)NGF在0.1M Tris缓冲液(pH 7.5)中与4D4 (11μg)孵育30分钟。然后在37℃下，用1μg蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶) 消化所得的复合物。将HPLC肽图互相比较，以找出受4D4抗体保护 的肽。NGF的有限蛋白酶解表明，有几种主要的肽最初从NGF中释 放出来。特别令人感兴趣的是，肽S18.3、S18.5和S34.4得以产生， 并受到抗体保护免遭蛋白酶解。其他峰没有明显形成出来或者得到保 护。两个实验(1小时和2小时消化)中的受保护肽在表7中显示。
表7
从肽的峰高计算出保护百分率。S18.5含有两条肽，但在280nm 处的吸光度检测发现，只有一条肽(SSSHPIFHR；SEQ ID NO：46)受到 4D4抗体的保护，因为添加4D4抗体后另一条肽(HWNSY；SEQ ID NO： 47)的峰保持不变。肽S18.3是S34.4的C端部分，两者均来自相同的 环区。N端和中央环区也是可能的表位。
Microcon分离经消化的肽
在4℃下，将枯草杆菌蛋白酶消化过的材料(各3μg)在0.1M Tris 缓冲液(pH 7.5)中与活性4D4抗体和失活的单克隆抗体(#162)(8μg)一 起孵育30分钟。用Microcon 10(Millipore Corp.，Bedford，Mass)分离结 合/未结合肽，通过HPLC分析这两个级分(结合和未结合)，找出结合 抗体的肽。用4D4抗体和#162处理并用Microcon分离之后，通过HPLC 比较未结合级分，鉴定出两个耗减的峰，回收所述两个峰，其表示抗 体结合的肽。4D4结合肽是：
S1(4.4)----SRKAVRR(113-119)(SEQ ID NO：49)，C-端；
S2(28.3)----EVMVL(35-39)(SEQ ID NO：50)，环区。
另外用Lys-C(K)消化NGF样本24小时。不加变性剂将半胱氨酸 残基还原和羧甲基化。将样本与单克隆抗体4D4和AMG162一起孵 育，接着用Microcon 100进行分离。用反相HPLC分析结合和未结合 的部分。只有两条如下所示的肽被鉴定为抗体结合K肽。由序列分析 测定的这两条肽的计算质量与它们的质谱观测结果一致。如下所示， 这两条肽位于N端和C端区域。
K1(37.6)----SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDK(SEQ ID NO：51)
计算质量＝2821；观测质量＝2828.2；N-端
K2(39.5)----QAAWRFIRIDTACVCVLSRK(SEQ ID NO：52)
计算质量＝2452；观测质量＝2459.5；C-端
前述的表位作图实验表明，至少有三个区域是4D4抗体的可能表 位，包括N-端区域(1-9)、内部区域(46-57)和C-端区域(96-98)。此外， AspN消化揭示，由---SSHPIFHRGEFSVC---(SEQ ID NO：53)组成的肽 片段受4D4抗体的保护，而胰蛋白酶消化揭示，由---SSHPIFHR---- (SEQ ID NO：54)组成的肽片段不受4D4抗体的保护。因此，在N端， 序列GEFSVC(SEQ ID NO：55)对于与4D4抗体的结合是最重要的。
为更清楚地明确抗NGF抗体4D4.IgG1的表位，根据完整的人成 熟NGF(hNGF)序列(表8)，用标准的技术由合成法产生总共23种肽。 这些肽长为15个氨基酸，重叠达10个氨基酸，C端以半胱氨酸结尾， 以便缀合到基质。上述人抗hNGF Ab 4D4.IgG1用于作图实验。
表8
肽# 序列 SEQ ID NO 33582-27-01 SSSHPIFHRGEFSVC(1-15) 56 33582-27-02 IFHRGEFSVADSVSVC(6-20) 57 33582-27-03 EFSVADSVSVWVGDKC(11-25) 58 33582-27-04 DSVSVWVGDKTTATDC(16-30) 59 33582-27-05 WVGDKTTATDIKGKEC(21-35) 60 33582-27-06 TTATDIKGKEVMVLGC(26-40) 61 33582-27-07 IKGKEVMVLGEVNIN(31-45) 62 33582-27-08 VMVLGEVNINNSVFKC(36-50) 63 33582-27-09 EVNINNSVFKQYFFEC(41-55) 64 33582-27-10 NSVFKQYFFETKARDC(46-60) 65 33582-27-11 QYFFETKARDPNPVDC(51-65) 66 33582-27-12 TkARDPNPVDSGARDC(56-70) 67 33582-27-13 PNPVDSGARDIDSKHC(61-75) 68 33582-27-14 SGARDIDSKHWNSYC(66-80) 69 33582-27-15 IDSKHWNSYATTTHTC(71-85) 70 33582-27-16 WNSYATTTHTFVKALC(76-90) 71 33582-27-17 TTTHTFVKALTMDGKC(81-95) 72 33582-27-18 FVKALTMDGKQAAWRC(86-100) 73 33582-27-19 TMDGKQAAWRFIRIDC(91-105) 74 33582-27-20 QAAWRFIRIDTAAVC(96-110) 75 33582-27-21 FIRIDTAAVAVLSRKC(101-115) 76 33582-27-22 TAAVAVLSRKAVRRAC(106-120) 77 33582-27-23 CAAVAVLSRKAVRRA(107-120) 78
用5％DMSO，1mMEDTA，pH 6.23将人NGF肽片段稀释到PBS 中。最终肽浓度归一化为同一摩尔浓度55μM(约100μg/ml)。在室温 下，将肽以100μl/孔在Reacti-Bind马来酰亚胺活化的96孔微量滴定 板(Pierce目录号15150)中孵育2小时，然后在4℃下搅拌孵育过夜。 人NGF(100μg/ml)用作阳性对照样本。用洗涤缓冲液(KPL)洗涤微量滴 定板，用0.2％脱脂奶粉(溶于PBS-EDTA缓冲液，pH 6.23)在室温下封 闭2小时，然后用5％BSA再封闭1小时。然后微量滴定板用各种浓 度(0，3，10，30μg/ml)的人抗NGF抗体孵育，接着用山羊抗hFc Ab-HRP (KPL)孵育，达2小时。用TMB底物使信号显影，加入终止液(KPL) 后，在450nm处读数。
在23种人NGF肽当中，至少观察到4个主要的峰，显示有4D4 结合。这些峰对应于下列的肽：肽#1(SEQ ID NO：56)， SSSHPIFHRGEFSVC (1-15)；肽#10(SEQ ID NO：65)， NSVFKQYFFETKARD(46-60)；肽#16-17(SEQ ID NO：71-SEQ ID NO： 72)，WNSYATTTHTFVKAL---(76-95)；及肽#18-21(SEQ ID NO：73- SEQ ID NO：76)，TTTHT---LSRKC(100-115)。
如在Weismann等(1999，Nature 401：184-8)中所描述，4D4的四个 结合峰位于NGF中的N-端、C-端、内部结构域以及环L2和环L4。 这些结果汇总于表9中。
表9
HNGF表位 N-端 L2 内部 L4 内部 C-端 肽# 肽#1 (SEQ ID NO：56)， SSSHPI---， 1-15 肽#10 (SEQ ID NO：65)， NSVFKQ---， 46-60 肽#16 (SEQID NO：71)， WNSYA---， 76-90 肽#17 (SEQID NO：72)， TMDGKQ--- 81-95 肽#19 (SEQ ID NO：74)， TMDGK---， 91-105 肽#20-21 (SEQ ID NO：75- SEQ ID NO：76)， QAAWR---， 96-115 Ab结合信号 +++ + ++ ++ +++ ++
Wiesmann等揭示了结合trkA受体的hNGF的晶体结构，显示N 端(残基2-9)对于受体结合是重要的(Wiesmann等，1999，Nature 401： 184-8)。NGF中这个节段的残基对于其对trkA的特异性强于对trkB或 trkC受体这一点也是重要的。抗体4D4对人NGF的选择性比对小鼠/ 大鼠NGF以及BDNF和NT-3要强，这很可能是由于人NGF和其他 神经营养蛋白之间的N端差异造成的。
抗体4D4结合肽#10(SEQ ID NO：65)(NSVFK---，46-60)和肽#17 (SEQ ID NO：72)(TTTHTFVKALTMDGKC，81-95)，这两条肽分别对应 于环L2和环L4，这两个环代表了神经营养蛋白当中序列多样性高于 平均水平的七个独特区域中的两个。NGF和BDNF之间这七个区域的 交换实验显示，L2和L4对NGF的生物活性是重要的。此外，将环L2 和环L4中的五个NT3残基用NGF中的残基置换，引入了类似NGF 的活性，同时保持了NT3活性。因此，L2和L4可能是抗体4D4选择 性结合NGF而不是结合BDNF或NT-3的区域。
抗体4D4同样结合肽#16(SEQ ID NO：71) (WNSYATTTHTFVKAL，76-90)，与NGF晶体结构的内部结构域吻 合。这个区域在人NGF和小鼠NGF之间100％同源，但与其他神经营 养蛋白的截然不同。与其对人NGF的活性相比，4D4对大鼠/小鼠NGF 的活性弱得多。因此，与NGF的这个部分结合对物种特异性来说很可 能不是关键的，但对于神经营养蛋白当中的选择性来说是重要的。
抗体4D4同样结合NGF的C端区域(肽#19-21(SEQ ID NO：74- SEQ ID NO：76)TMDGK---LSRKC，91-115)，这个区域是人NGF中使 NGF与其他神经营养蛋白(BDNF和NT3)区别开来的区域之一。与这 个区域结合有助于解释为什么4D4对其他神经营养蛋白不具有活性。 此外，人NGF和小鼠NGF之间在C端有单个氨基酸差异，提示这单 个氨基酸可能是造成4D4对人NGF的选择性强于对大鼠/小鼠NGF的 选择性的原因之一，这与观察到在N端有物种差异相似。
最后，4D4也与肽#10(SEQ ID NO：65)(---KARDC，50-60)所示的 人NGF内部结构域相互作用，这个结构域是NGF优先结合trkA而不 是trkB或trkC的重要区域，这进一步解释了4D4对人NGF的选择性 中和活性。
实施例9
通过KinExA测定单克隆抗体的亲和性
通过KinExA测定Ab 4D4(38859-80)对huNGF(29714-91)的结 合。简单的说，用huNGF预涂布Reacti-Gel 6x(Pierce)，并用BSA封 闭。在室温下，将10pM和30pM的Ab 4D4样品与各种浓度的huNGF (Amgen)孵育8小时，然后流过涂有huNGF的玻珠。用荧光(Cy5)标记 的山羊抗人IgG抗体(Jackson Immune Research)对玻珠结合抗体的量 进行定量。结合信号与处于平衡状态的游离抗体的浓度成正比。用双 曲线单点同质结合模型(dual-curve one-site homogeneous binding model) (KinExTM软件)对竞争曲线进行非线性回归，得到解离平衡常数(KD)。 对于Ab 4D4结合huNGF，KD为约4pM。
实施例10
另外的抗NGF抗体的鉴定
选择按以上实施例2和3的描述产生和鉴定的另外抗NGF抗体 (称为14D10、6G9、7H2、14F11和4G6)，进行进一步的研究。简单 的说，检测条件培养基，寻找结合活性。纯化培养基中的抗体并测序。 将条件培养基中的抗体的预测质量与其质谱分析数据相比较。克隆抗 体。如上所述，使其中的两个克隆在CHO细胞中表达，并检测活性。 结果在表10中显示。
表10
然后将这些抗体的轻链可变区和重链可变区的序列与4D4抗体序 列相比较，同时相互比较(图5和6)。由这些比较所鉴定得出的重链可 变区的同源性百分率在表11中显示。轻链可变区的同源性百分率在表 12中显示。另外，各种抗体的CDR区的同源性百分率在图5-10中显 示。
表11
4D4VH 14D10VH 6H9VH 7H2VH 14D11VH 4G6VH 4D4VH 100％ 70.9％ 70.1％ 75.6％ 47.2％ 73.4％ 14D10VH 100％ 95.3％ 85％ 54.3％ 81.1％ 6H9VH 100％ 86.6％ 54.3％ 81.1％ 7H2VH 100％ 51.2％ 79.8％ 14D11VH 100％ 56.8％ 4G6VH 100％
表12
V4D4 VK 14D11 LC 4G6a LC 4G6b LC 4G6c LC 14D10 LC 6H9 LC 4G6d LC 7H2 LC 4G6e V4D4VK 100％ 89％ 91％ 72％ 74％ 69％ 71％ 71％ 70％ 73％ 14D11LC 100％ 94％ 68％ 71％ 67％ 68％ 68％ 68％ 70％ 4G6aLC 100％ 69％ 74％ 68％ 70％ 70％ 69％ 71％ 4G6bLC 100％ 87％ 83％ 86％ 86％ 86％ 96％ 4G6cLC 100％ 91％ 94％ 94％ 94％ 91％ 14D10LC 100％ 91％ 94％ 94％ 86％ 6H9LC 100％ 99％ 98％ 89％ 4G6dLC 100％ 99％ 89％ 7H2LC 100％ 4G6e 100％
应当理解，前述公开内容强调本发明的具体特定实施方案，与其 等同的所有修改方案或者替代方案落入后附权利要求书所阐明的本发 明的精神和范围之内。
序列表
<110>Kenneth，Wild
Treanor，James
Huang，Haichun
Inoue，Heather
Zhang，Tie J.
Martin，Frank
<120>作为选择性NGF途径抑制剂的人抗NGF中和抗体
<130>02-1240
<150>US 60/487,431
<151>2003-07-15
<160>138
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>990
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>3
<211>978
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300
aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540
gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600
aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960
tccctgtctc cgggtaaa 978
<210>4
<211>326
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210>5
<211>981
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
gccagcacca aggggccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtgraca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gakgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa a 981
<210>6
<211>327
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>7
<211>321
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210>8
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>9
<211>369
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggctt caccttaaga agttatagca tgaactgggt tcgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtcgta gtagtcatac catattctac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ttcactgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgag agacgaggac acggctatgt attactgtgc gagagtatat 300
agcagtggct ggcacgtctc tgattatttt gactactggg gccagggaat cctggtcacc 360
gtttcctca 369
<210>10
<211>123
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr lle Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>11
<211>321
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210>12
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
gtatatagca gtggctggca cgtctctgat tattttgact ac 42
<210>14
<211>14
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
caacagttta atagttaccc gctcact 27
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210>17
<211>51
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
tacattagtc gtagtagtca taccatattc tacgcagact ctgtgaaggg c 51
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
gatgcctcca gtttggaaag t 21
<210>20
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>21
<211>15
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
agttatagca tgaac 15
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 33
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210>25
<211>1131
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 300
aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 360
gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctcccccg 420
tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccatgccc acggtgccca 480
gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc 540
cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600
cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780
cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840
ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960
tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080
gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1131
<210>26
<211>376
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370 375
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人NGF的PCR引物
<400>27
acaccacata tgtcatcatc ccatcccat 29
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>人NGF的PCR引物
<400>28
accacaggat cctccttatg cacgacgcac agctttacgg 40
<210>29
<211>375
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>编码重组人met-NGF的核苷酸序列
<400>29
catatgtcat catcccatcc catcttccac aggggcgaat tctcggtgtg tgacagtgtc 60
agcgtgtggg ttggggataa gaccaccgcc acagacatca agggcaagga ggtgatggtg 120
ttgggagagg tgaacattaa caacagtgta ttcaaacagt acttttttga gaccaagtgc 180
cgggacccaa atcccgttga cagcgggtgc cggggcattg actcaaagca ctggaactca 240
tattgtacca cgactcacac ctttgtcaag gcgctgacca tggatggcaa gcaggctgcc 300
tggcggttta tccggataga tacggcctgt gtgtgtgtgc tcagccgtaa agctgtgcgt 360
cgtgcataag gatcc 375
<210>30
<211>121
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>重组人met-NGF的氨基酸序列(1-120)
<400>30
Met Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile
20 25 30
Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser
35 40 45
Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro
50 55 60
Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly lle Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr
65 70 75 80
Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys
85 90 95
Gln Ala Ala Trp Arg Phe lle Arg lle Asp Thr Ala Cys Val Cys Val
100 105 110
Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
115 120
<210>31
<211>55
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>产生表达载体pCFM1656(ATCC #69576)的5′引物序列
<400>31
cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaattc ggtac 55
<210>32
<211>49
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>产生表达载体pCFM1656(ATCC #69576)的3′引物序列
<400>32
taaactaaga tcttcctcct tattgtatac caattgcgca accttaagc 49
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>不确定
<222>(18)..(23)
<223>n为a、c、t或g
<400>33
ggccggatag gcctccannn nnnt 24
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>34
ggggtcaggc tggaactgag g 21
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>35
tgaggacgct gaccacacg 19
<210>36
<211>54
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>36
cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtgccc gctcagctcc tggg 54
<210>37
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>37
cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34
<210>38
<211>55
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>38
cagcagaagc ttctagacca ccatggagtt ggggctgtgc tgggttttcc ttgtt 55
<210>39
<211>34
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>39
gcatgtcgac tcatttaccc ggagacaggg agag 34
<210>40
<211>449
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
210 215 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210>41
<211>453
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr TyrIle Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>42
<211>450
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210>43
<211>499
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys
210 215 220
Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys
245 250 255
Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser
260 265 270
Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
275 280 285
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
340 345 350
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Pro Gly
<210>44
<211>214
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>45
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
Phe Phe Glu Thr Lys
1 5
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
1 5
<210>47
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
His Trp Asn Ser Tyr
1 5
<210>48
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Asn Ser Val Glu Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys
1 5 10
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg
1 5
<210>50
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Glu Val Met Val Leu
1 5
<210>51
<211>25
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys
20 25
<210>52
<211>20
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val
1 5 10 15
Leu Ser Arg Lys
20
<210>53
<211>14
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys
1 5 10
<210>54
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>54
Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg
1 5
<210>55
<211>6
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
Gly Glu Phe Ser Val Cys
1 5
<210>56
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys
1 5 10 15
<210>57
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Ala Asp Ser Val Ser Val Cys
1 5 10 15
<210>58
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Glu Phe Ser Val Ala Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Cys
1 5 10 15
<210>59
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Cys
1 5 10 15
<210>60
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Cys
1 5 10 15
<210>61
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Cys
1 5 10 15
<210>62
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn
1 5 10 15
<210>63
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>63
Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Cys
1 5 10 15
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Cys
1 5 10 15
<210>65
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp Cys
1 5 10 15
<210>66
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Cys
1 5 10 15
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>67
Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Ala Arg Asp Cys
1 5 10 15
<210>68
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>68
Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Ala Arg Asp Ile Asp Ser Lys His Cys
1 5 10 15
<210>69
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>69
Ser Gly Ala Arg Asp Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
1 5 10 15
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr Cys
1 5 10 15
<210>71
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Cys
1 5 10 15
<210>72
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>72
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Cys
1 5 10 15
<210>73
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>73
Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Cys
1 5 10 15
<210>74
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>74
Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Cys
1 5 10 15
<210>75
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>75
Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Ala Val Cys
1 5 10 15
<210>76
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>76
Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Cys
1 5 10 15
<210>77
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>77
Thr Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala Cys
1 5 10 15
<210>78
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>78
Cys Ala Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
1 5 10 15
<210>79
<211>125
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>79
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>80
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>81
<211>127
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>82
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>82
Glu Ila Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Phe Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>83
<211>127
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>84
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Val Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>85
<211>121
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Trp Asn Ser Gly Ile Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Glu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>86
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>87
<211>124
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gln Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>88
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>89
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>90
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>91
<211>107
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>92
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>92
Thr Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210>93
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>93
Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210>94
<211>16
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>94
Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asn Val
1 5 10 15
<210>95
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>95
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp Leu Ala
1 5 10
<210>96
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>96
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>97
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr
1 5
<210>98
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>98
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210>99
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>99
Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>100
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>100
Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp
1 5 10 15
Val
<210>101
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>101
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly Phe Leu Ala
1 5 10
<210>102
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>102
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>103
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210>104
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>104
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210>105
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>105
Gly Ile Ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Gly Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>106
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>106
Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr Val Met Asp
1 5 10 15
Val
<210>107
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>107
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>108
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>108
Val Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>109
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>109
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210>110
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>110
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210>111
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>111
Gly Ile Thr Trp Asn Ser Gly Ile Leu Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>112
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>112
Glu Gly Ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>113
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>113
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>114
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>114
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>115
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>115
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210>116
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>116
Asp Tyr Gly Met Asn
1 5
<210>117
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>117
Asp Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>118
<211>15
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>118
Glu Gln Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210>119
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>119
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210>120
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>120
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>121
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210>122
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>122
Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>123
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>123
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>124
Gln Gln Arg Ser Asn Trp His Arg Thr
1 5
<210>125
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>125
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>126
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>126
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>127
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210>128
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>128
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>129
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>129
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>130
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp Thr
1 5
<210>131
<211>108
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>131
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>132
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>132
Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>133
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>133
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>134
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210>135
<211>120
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>135
Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala
115 120
<210>136
<211>120
<212>PRT
<213>小家鼠(mus musculus)
<400>136
Ser Ser Thr His Pro Val Phe His Met Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp
1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Thr Val Leu Ala Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Ala Ser Asn Pro Val
50 55 60
Glu Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gln
85 90 95
Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Ala
115 120
<210>137
<211>126
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>137
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu
1 5 10 15
Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys
20 25 30
Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys
35 40 45
Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys
50 55 60
Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys
65 70 75 80
Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala
85 90 95
Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115 120 125
<210>138
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapien)
<400>138
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser
1 5 10 15
Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly
20 25 30
His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val
35 40 45
Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys
50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys
65 70 75 80
Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu
85 90 95
Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu
100 105 110
Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr
115