一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101590121 B (45)授权公告日 2012.09.05 CN 101590121 B *CN101590121B* (21)申请号 200810055149.4 (22)申请日 2008.05.27 A61K 36/725(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61K 9/10(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 9/48(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61K 31/045(2006.01) A61K 35/62(2006.01) A61K 。

2、35/64(2006.01) (73)专利权人 河北以岭医药研究院有限公司 地址 050035 河北省石家庄市高新技术开发 区天山大街 238 号 (72)发明人 李向军 安军永 王超 郑立发 CN 1709291 A,2005.12.21, 权利要求 1. CN 1334121 A,2002.02.06,说明书技术领域 部分、 实施例 1、 8、 9. 段炼 等 .通心络对猪急性心肌梗死再灌注 后内皮细胞功能的影响 .络病学基础与临床研 究 .2006, 第 184-190 页 . (54) 发明名称 一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功 能完整性药物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了。

3、一种中药组合物在制备保护内 皮细胞屏障功能完整性药物中的应用， 本发明中 药组合物能够抑制细胞粘附分子的表达， 减少炎 症反应， 增加血管内皮钙粘素含量， 保护内皮细胞 屏障功能完整性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李濯冰 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性的药物中的应用， 该中药组合 物由如下重量份的原料药制成 ： 人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 制乳香 1-5。

4、 赤芍 3-9 降香 1-5 檀香 1-5 全 蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蚣 1-3 冰片 1-7 炒酸枣仁 3-10 ； 其特征在于该中药组合物的活性成分由下列成分组成 ： a 平均粒径小于 100m 的全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫、 蝉蜕及制乳香药粉 ； b 冰片药粉 ； c 由降香和檀香提取的挥发油 ； d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏 ； e 提取成分 c 后的降香和檀香药渣的水提液、 赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以 及提取成分 d 后的人参药渣的水提液过滤、 混匀后浓缩成的水提浸膏。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原。

5、料药制 成 ： 人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 制乳香 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 7 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5。 3. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制 成 ： 人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 制乳香 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 9 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5。 4. 权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述中药组合物由如下重量份的原料药制成 ： 人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 制乳香 2 赤芍 5 降香 2 檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 炒酸枣仁 5。 5. 如。

6、权利要求 1-4 中任一项所述的应用， 其特征在于所述中药组合物的制剂剂型为胶 囊剂、 片剂、 丸剂或口服液。 6. 如权利要求 1-4 中任一项所述的应用， 其特征在于所述中药组合物在制备抑制细胞 粘附分子的表达的保护内皮细胞屏障功能完整性的药物中的应用。 7.如权利要求6所述的应用， 其特征在于所述的细胞粘附分子为P-选择素和细胞间粘 附分子 1 中之一或二者。 8. 如权利要求 1-4 中任一项所述的应用， 其特征在于所述中药组合物在制备减少炎症 反应的保护内皮细胞屏障功能完整性的药物中的应用。 9. 如权利要求 1-4 中任一项所述的应用， 其特征在于所述中药组合物在制备增加血管 内皮。

7、钙粘素含量的保护内皮细胞屏障功能完整性的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101590121 B 2 1/12 页 3 一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物 中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物的新用途， 具体地， 涉及一种中药组合物在制备保护 内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用， 属中药应用领域。 背景技术 0002 内皮细胞是血液与血管壁之间的结构和功能屏障， 内皮细胞受损是动脉粥样硬化 形成的始发因素， 粘附分子在内皮细胞受损过程中起了重要作用， 因此如何控制内皮细胞 粘附分子的表达在防止脉粥样硬化发生中是至关重要的。 0003 急性心肌梗死 (A。

8、cute myocardial infarction， AMI) 再灌注后的短暂时间内， 即可在心肌损伤区内观察到多形核中性粒细胞的聚集， 活化的中性粒细胞不仅释放出大 量活性氧自由基 (Reactive oxygen species， ROS)、 蛋白水解酶和促炎症介质， 增加血管 通透性， 还能堵塞微血管引起二次缺血， 并渗出至周围组织引起炎症反应和组织损伤， 从 而引起内皮细胞屏障功能障碍。Engler RL， Schmid-Schonbein GW， Pavelec RS. 狗心 肌缺血再灌注白细胞毛细血管填塞 .Am J Pathol.1983 Apr ； 111(1) ： 98-1。

9、11 ； Saeed SA， Waqar MA， Zubairi AJ， et al. 心肌缺血再灌注损伤 ： 活性氧与中性粒细胞的角色 .J Coll Physicians Surg Pak.2005 Aug.15(8) ： 507-14. 0004 冠脉内皮细胞是心脏抵御炎症损伤的第一道防线， 它不仅发挥着屏障功能， 同时 也通过调节 NO 和腺苷的水平阻止中性粒细胞的聚集和粘附。研究发现， 再灌注损伤过程 中， ROS 可以上调粘附分子的表达， 如 P- 选择素和 ICAM-1， 促进细胞因子和补体的释放， 进 而活化中性粒细胞， 后者通过粘附分子依赖机制， 如 P- 选择素， 可以直接。

10、损伤内皮细胞， 抑 制 NO 的合成， 诱发血管收缩。缺血再灌注过程中， 中性粒细胞和内皮细胞间的相互作用主 要是由细胞表面粘附分子所介导。在炎症部位， 中性粒细胞的贴壁和滚动主要依赖于细胞 表面 P- 选择素糖蛋白配体 1 和内皮表面的 P- 选择素之间的识别， 这是炎症反应和白细胞 渗出过程的重要始动因素。 ICAM-1和VCAM-1同属于免疫球蛋白超家族成员， 定位于血管内 皮细胞表面， 两者分别与相应的配体 CD11/CD18 复合物和 VLA-4 相结合介导白细胞的聚集 和稳定粘附， 促进白细胞的活化和炎性渗出。缺血再灌注过程能够激活 ROS 敏感信号通路， 促使核转录因子 AP-1。

11、 和 kappaB 活化， 粘附分子 ICAM-1， VCAM-1， P- 选择素和 E- 选择素的 转录增加， 导致内皮细胞粘附性增强和白细胞渗出增加。 因此， 细胞表面粘附分子表达水平 反映了血管内皮细胞损伤及炎症浸润的程度。 0005 内皮细胞间连接蛋白在维持内皮细胞功能和结构完整性中发挥至关重要的作用。 血管内皮钙粘素表达于内皮细胞表面， 它能介导钙离子依赖的同型细胞间粘附， 不仅参与 内皮细胞的生长、 存活和迁移等过程， 并且还在调节内皮细胞完整性方面发挥非常重要的 作用。 研究显示， 用特异性抗体阻断血管内皮钙粘素介导的细胞间相互作用， 将会破坏内皮 细胞完整性， 同时增加中性粒细。

12、胞的渗出。 与其它钙粘素一样， 血管内皮钙粘素的胞浆部分 与犰狳蛋白家族成员 - 连环蛋白和 - 连环蛋白相结合， 后两者借助 - 连环蛋白连接 说 明 书 CN 101590121 B 3 2/12 页 4 到肌动蛋白细胞骨架上， 血管内皮钙粘素的功能主要受细胞骨架变化和细胞内蛋白磷酸化 的调节。研究显示， 在氧化应激过程中， ROS 能增加肌球蛋白轻链磷酸化， 促进细胞收缩， 同 时伴随有连接蛋白的解离和再分布， 导致内皮细胞屏障功能障碍， 毛细血管通透性增加和 炎症细胞渗出增多。 0006 本发明是在第01131203.3号中国专利和第200410048292.2号专利的基础上进行 的改。

13、进发明， 在此全文引用该两专利文件记载的内容。本发明提供了一种中药组合物在制 备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中的应用。 发明内容 0007 本发明目的是提供一种中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性药物中 的应用。 0008 本发明中药组合物能够抑制细胞粘附分子的表达， 减少炎症反应， 增加血管内皮 钙粘素含量， 保护内皮细胞屏障功能完整性。 0009 优选地， 所述细胞粘附分子为 P- 选择素和细胞间粘附分子 1 中之一或二者。 0010 本发明的另一个目的是提供该中药组合物在制备保护内皮细胞屏障功能完整性 药物中的应用中的活性成分。 0011 本发明应用中， 所述中药组合物由如下重量。

14、份的原料药制成 ： 0012 人参 3-10 水蛭 3-11 土鳖虫 5-10 乳香 ( 制 )1-5 赤芍 3-9 降香 1-5 0013 檀香 1-5 全蝎 3-9 蝉蜕 3-12 蜈蚣 1-3 冰片 1-7 酸枣仁 ( 炒 )3-10 ； 0014 优选地， 该中药组合物由如下重量份的原料药制成 ： 0015 人参 6 水蛭 10 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0016 檀香 2 全蝎 7 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 或 ： 0017 人参 10 水蛭 8 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0018 檀香 2 全蝎 9 。

15、蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 或 ： 0019 人参 6 水蛭 11 土鳖虫 7 乳香 ( 制 )2 赤芍 5 降香 2 0020 檀香 2 全蝎 3 蝉蜕 7 蜈蚣 1 冰片 5 酸枣仁 ( 炒 )5 ； 0021 本发明中药组合物中， 原料药材的拉丁名及其加工方法来自 中药大辞典 (1977 年 7 月， 第一版， 上海科学技术出版社 ) 和 中国药典 (2005 年版， 化学工业出版社 )。 0022 本发明的应用中， 所述中药组合物各原料中的一种或几种， 可单独或同时被相同 药性、 功效的中药原料药替换， 替换后， 组合物制剂和作用不发生变化。 0023 本发。

16、明的应用中， 该中药组合物的活性成分由下列成分组成 ： 0024 a 平均粒径小于 100m 的全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫、 蝉蜕及制乳香药粉 ； 0025 b 冰片药粉 ； 0026 c 由降香和檀香提取的挥发油 ； 0027 d 人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏 ； 说 明 书 CN 101590121 B 4 3/12 页 5 0028 e 提取成分 c 后的降香和檀香药渣的水提液、 赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提 液以及提取成分 d 后的人参药渣的水提液过滤、 混匀后浓缩成的水提浸膏。 0029 本发明的应用中， 所述中药组合物剂型为胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软。

17、胶囊或滴 丸剂。 0030 本发明中药组合物制剂还可以按常规的制剂工艺， 例如， 范碧亭 中药药剂学 ( 上 海科学出版社 1997 年 12 月第 1 版 ) 记载的制备工艺， 制成药剂学可接受的任意常规剂型， 例如胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软胶囊、 滴丸等。 0031 本发明的应用中， 所述中药组合物为胶囊剂、 片剂、 丸剂、 口服液、 软胶囊、 滴丸制 剂中的一种， 为使上述剂型能够实现， 需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料， 例如 ： 填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 助悬剂、 粘合剂、 甜味剂、 矫味剂、 防腐剂、 基质等。填充剂包括 ： 淀 粉、 预胶化淀粉、 乳糖、 甘。

18、露醇、 甲壳素、 微晶纤维素、 蔗糖等 ； 崩解剂包括 ： 淀粉、 预胶化淀 粉、 微晶纤维素、 羧甲基淀粉钠、 交联聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羟丙纤维素、 交联羧甲基纤维 素钠等 ； 润滑剂包括 ： 硬脂酸镁、 十二烷基硫酸钠、 滑石粉、 二氧化硅等 ； 助悬剂包括 ： 聚乙 烯吡咯烷酮、 微晶纤维素、 蔗糖、 琼脂、 羟丙基甲基纤维素等 ； 粘合剂包括， 淀粉浆、 聚乙烯吡 咯烷酮、 羟丙基甲基纤维素等 ； 甜味剂包括 ： 糖精钠、 阿斯帕坦、 蔗糖、 甜蜜素、 甘草次酸等 ； 矫味剂包括 ： 甜味剂及各种香精 ； 防腐剂包括 ： 尼泊金类、 苯甲酸、 苯甲酸钠、 山梨酸及其盐 类、 苯扎溴。

19、铵、 醋酸氯乙定、 桉叶油等 ； 基质包括 ： PEG6000， PEG4000， 虫蜡等。为使上述剂型 能够实现中药药剂学， 需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料 ( 范碧亭 中药药 剂学 ， 上海科学出版社 1997 年 12 月第 1 版中各剂型记载的辅料 )。 0032 本发明胶囊剂优选通过以下制备方法制成 ： 将上述配比的水蛭、 全蝎、 蝉蜕、 土鳖 虫、 蜈蚣等五味药洗净， 低温烘干， 备用 ； 檀香、 降香提取挥发油， 药渣及水溶液备用 ； 人参 用70乙醇加热回流提取二次， 第一次3小时， 第二次2小时， 合并提取液， 回收乙醇至无醇 味 ； 人参药渣与檀香、 降香的药渣。

20、以水溶液合并， 加入赤芍、 酸枣仁 ( 炒 )， 加水煎煮二次， 第 一次3小时， 第二次2小时， 合并煎液， 滤过， 滤液浓缩至相对密度为1.20-1.25(60)的清 膏， 加入上述人参醇提液， 混匀， 低温干燥， 粉碎成细粉 ； 乳香 ( 制 ) 与水蛭等五味共粉碎成 细粉 ； 冰片研细， 分别与上述细粉配研， 混匀， 喷入挥发油， 混匀， 装入胶囊， 即得。 0033 或者， 本发明制剂优选通过以下制备方法制成 ： 0034 a)原料药的重量比为 ： 人参3-10份、 水蛭3-11份、 土鳖虫5-10份、 制乳香1-5份、 赤芍 3-9 份、 降香 1-5 份、 檀香 1-5 份、 全。

21、蝎 3-9 份、 蝉蜕 3-12 份、 蜈蚣 1-3 份、 冰片 1-7 份、 炒酸枣仁 3-10 份 ； 0035 b) 药材粉碎工艺 ： 0036 将全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、 水洗处理后和净选炮制后的 制乳香按处方配料， 由粉碎机进行粉碎， 药粉细度达到 80 目以上 ； 粗粉后的药粉经各种超 微粉碎技术进行超微粉碎， 使药粉平均粒径小于 100m ； 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌 后， 配料 ； 0037 c) 提取浓缩和干燥工艺 ： 0038 降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取， 赤芍和酸枣仁加水煎煮， 水提液过 滤后， 待浓缩成浸膏 ； 人参用乙醇提取后。

22、， 再用水提取， 醇提液回收乙醇后， 浓缩成醇提浸 膏， 水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏 ； 说 明 书 CN 101590121 B 5 4/12 页 6 0039 d) 制剂工艺 ： 0040 在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉， 再将步骤 c) 所得提取浸膏喷入制粒 ； 将制 成的颗粒经整粒， 加入冰片细粉， 喷入由降香和檀香提取的挥发油， 混匀后由胶囊充填机充 填， 制成胶囊。 0041 或者， 本发明胶囊剂优选通过以下制备方法制成 ： 0042 a) 原料药的重量比为 ： 人参 3-10 份、 水蛭 3-11 份、 土鳖虫 5-10 份、 乳香 ( 制 )1-5 份、 赤。

23、芍 3-9 份、 降香 1-5 份、 檀香 1-5 份、 全蝎 3-9 份、 蝉蜕 3-12 份、 蜈蚣 1-3 份、 冰片 1-7 份、 炒酸枣仁 3-10 份 ； 0043 b) 药材粉碎工艺 ： 0044 将全蝎、 水蛭、 蜈蚣、 土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、 水洗处理后和净选炮制后的 制乳香按处方配料， 由粉碎机进行粉碎， 药粉细度达到 80 目以上 ； 粗粉后的药粉经各种超 微粉碎技术进行超微粉碎， 使药粉平均粒径小于 100m ； 待粉碎的药材经清洗烘干灭菌 后， 配料 ； 0045 c) 提取浓缩和干燥工艺 ： 0046 降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取， 赤芍和酸枣仁加水。

24、煎煮， 水提液过 滤后， 待浓缩成浸膏 ； 人参用乙醇提取后， 再用水提取， 醇提液回收乙醇后， 浓缩成醇提浸 膏， 水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏， 将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉 ； 0047 d) 制剂工艺 ： 0048 将超微粉碎粉与步骤 c) 所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中， 再喷溶媒 制成颗粒 ； 将制成的颗粒经整粒， 加入冰片细粉， 喷入由降香和檀香提取的挥发油， 混匀后 由胶囊充填机充填， 制成胶囊。 0049 本发明应用中， 本发明组合物的用量， 按原料药总重量计， 为每次 0.8-3 克， 每日 服用 2-4 次， 优选为每次 1.11-2.22 克， 每。

25、日服用三次。 0050 为阐明本发明中药组合物保护内皮细胞屏障功能完整性的活性， 用按实施例 1 方 法制得的胶囊内容物干粉 ( 以下称本发明药物 ) 进行了下列动物试验。 0051 一、 材料和方法 0052 1、 动物与分组 0053 选用中华小型猪30只(购于北京农业大学)， 雌雄匹配， 体重30公斤左右， 应用随 机排列表， 随机分成模型对照组， 小 0.05g/(kgd)、 中 0.2g/(kgd)、 大剂量 0.5g/ (kgd) 本发明药物治疗组和假手术组， 每组 6 只。 0054 2、 药物与用法 0055 本发明药物胶囊干粉(1.43g生药干粉， 由石家庄以岭药业股份有限公。

26、司提供)混 于饲料中， 于 AMI 造模前 3 天开始， 每天喂食给药 1 次。小剂量 0.05gkg-1d-1、 中剂量 0.2gkg-1d-、 大剂量 0.5gkg-1d-。 0056 3、 急性心肌梗死再灌注模型 0057 于胸骨正中打开胸腔， 纵行切开心包膜， 暴露心脏， 并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮 状， 于冠状动脉左前降支 (LAD) 远端 1/3 1/2 处， 将结扎线穿入一长约 3 4cm 的硅胶管 腔内结扎 3 小时， 再松解 1 小时建立 AMI 再灌注模型。假手术组冠脉下只穿线， 不结扎。实 验结束时， 从左心室注入 4的硫磺素 (thioflavin-S)1ml/kg， 。

27、使再灌注区着色， 无再流区 说 明 书 CN 101590121 B 6 5/12 页 7 不着色 ； 再于原位重新结扎前降支， 从左心室再注入埃文氏 (Evan S) 蓝， 使结扎区外着蓝 色， 结扎区不着蓝色。立即取出心脏， 剪除左右心耳及残余大血管， 于冰生理盐水中荡洗去 除残余血液 ； 取部分正常区、 再灌注区和无再流区心肌以锡纸包被， 标记后保存于液氮中， 以备提取总 RNA、 蛋白和组织匀浆之用， 另取部分组织置于 4多聚甲醛中固定， 以备 HE 染 色之用。 0058 4、 心肌组织中细胞粘附分子蛋白含量测定 0059 取心肌组织约 100mg， 加入 10 倍体积冰预冷 PBS。

28、 缓冲液 (PH 7.4)， 在冰上迅速匀 浆 18,000rpm， 1 2min， 4离心， 2000rpm， 15min， 仔细收集上清， 置于 -70保存。采用 ELISA 方法测定心肌组织匀浆中 P- 选择素、 ICAM-1 和 VCAM-1 的含量。具体操作按试剂盒 说明书进行， 试剂盒购自美国 Rapidbio(RB) 公司。 0060 5、 心肌组织中细胞粘附分子 mRNA 含量测定 0061 取心肌组织约 100mg 提取总 RNA， 将提取的总 RNA 逆转录成 cDNA， 以 cDNA 为 模板进行实时反转录聚合酶链反应 (Real-time PCR) 反应， 引物分别为 。

29、P- 选择素上 游 5 -TCACCTGTGATGA AGGCTCG-3 ，下 游 5 -TTCAAGCCGAAGGTTCCCAG-3 ； ICAM1 上 游 5 -CCTGGAT CAATGGAACCGAG-3 ， 下游 5 -TCGTTCAGTGT CACCACAGC-3 ； VCAM1 上游 5 -AGT GATGGCTTTCCAGCTCC-3 ， 下游 5 -TCCTTGACGCTCTCAGAAGG-3 ； - 肌动蛋白 (-actin) 上 游 5 -AGGTCATCACCATCGGCAAC-3 ， 下游 5 -TCTCCTTCTGC ATCCTGTCG-3 ， PCR 反应的具体步。

30、 骤是 ： 95变性 5min 后， 再以 95 30s、 59 30s 两步法进行 40 个循环。每对引物， 每种 模板， 各 3 个平行管反应。获得同一个样品目的基因的 CT 值与 - 肌动蛋白的 CT 值， 计算 出 ： CT CT 目的基因 -CT- 肌动蛋白， 目的基因的平均相对含量 2- 平均 CT， (CT CT 未知 -CT 参照 )。 0062 6、 心肌组织 HE 染色观察 0063 标本固定 24 小时以上， 常规石蜡包埋， 切片至 3 4m， 贴片后脱蜡至水， 常规 HE 染色， 显微镜下观察心肌组织形态。 0064 7、 心肌组织中内皮细胞间连接蛋白含量测定 0065。

31、 10 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白样品， 转移至硝酸纤维素膜， 5脱脂奶粉室 温封闭 1 1.5 小时， 加入适量比例的一抗 ( 山羊抗人血管内皮钙粘素 (VE-cadherin)， - 连环蛋白 (-catenin)， - 连环蛋白 (-catenin) 多抗购自美国 Santa Cruz 公 司 )， 4过夜。TBST 洗膜 3 次， 加入适量的碱性磷酸酶标记的兔抗山羊 IgG， 室温 2 小时， TBST 洗膜 3 次， 加入显色底物 (NBT/BCIP) 避光显色， 待出现清晰条带后终止反应。图像以 AlphaImager3400 分析软件对其进行灰度对比分析。将目的蛋白条带的。

32、灰度与内参蛋白条 带的灰度相比， 再乘以 100， 以消除上样量差异的影响， 对比各组样本蛋白表达水平的变 化情况。 0066 8、 统计学方法 0067 实验数据以均数 标准差表示， 采用 SPSS11.5 进行统计学处理， 同组间 的比较用配对t检验， 多个样本均数的比较用方差分析和q检验， 多个样本均数与同一对照 组比较用 Dunnet t 检验， 以 P 0.05( 双尾 ) 表示差异有统计学意义。 0068 二、 结果 0069 1、 心肌组织 P- 选择素蛋白和 mRNA 含量 说 明 书 CN 101590121 B 7 6/12 页 8 0070 正常区心肌组织中 P- 选择素。

33、蛋白和 mRNA 含量在各组之间均无显著性差异 (P 均 0.05)。与正常区心肌组织比较， 模型组和药物治疗组一样， 再灌注区和无再流区心肌组 织中 P- 选择素蛋白含量均显著升高 (P 均 0.05)， 且无再流区升高更明显 (P 均 0.01) ； 再灌注区和无再流区心肌组织中 P- 选择素 mRNA 水平也有显著升高 (P 均 0.05)， 提示再 灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调， 促进炎症细胞粘附和浸润。 0071 与模型组相比较， 小剂量组再灌注区和无再流区 P- 选择素蛋白和 mRNA 含量无显 著变化 (P 0.05) ； 中剂量和大剂量组的再灌注区和无再流区心肌组织中 。

34、P- 选择素蛋白 含量有显著降低 (P 0.05) ； 而且大剂量组再灌注区和无再流区 P- 选择素 mRNA 含量也有 显著降低 (P 0.05)， 提示中剂量本发明药物可以抑制受损心肌局部 P- 选择素的蛋白表 达， 而大剂量本发明药物可以同时抑制 P- 选择素的转录和翻译， 减少局部炎症细胞粘附和 浸润， 减轻炎症损伤 ( 表 1、 2)。 0072 表 1 各组在各区心肌组织 P- 选择素蛋白水平的变化 (ng/mgprot， XS) 0073 0074 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.。

35、05， P 0.01 0075 表 2 各组在各区心肌组织 P- 选择素 mRNA 水平的变化 0076 ( 相对假手术组正常区含量， XS) 0077 0078 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0079 2、 心肌组织中细胞间粘附分子 1(ICAM-1) 蛋白和 mRNA 含量 0080 正常区心肌组织中 ICAM-1 蛋白和 mRNA 含量在各组之间均无显著性差异 (P 均 0.05)。与正常区心肌组织比较， 模型组和药物治疗组一样， 再灌注区和无再流区心肌 组织中 I。

36、CAM-1 蛋白和 mRNA 含量均显著升高 (P 均 0.01)， 且无再流区升高更显著 (P 均 0.05)， 提示再灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调， 促进炎症细胞浸润。 0081 与模型组相比较， 小剂量组再灌注区和无再流区心肌组织中 ICAM-1 蛋白和 mRNA 说 明 书 CN 101590121 B 8 7/12 页 9 含量无显著降低 (P 均 0.05) ； 中剂量和大剂量组的再灌注区和无再流区心肌组织中 ICAM-1蛋白含量有显著降低(P均0.05) ； 而且大剂量组再灌注区ICAM-1 mRNA含量也有 显著降低 (P 0.05)， 提示中剂量本发明药物可以抑制受损。

37、心肌局部 ICAM-1 的表达， 大剂 量本发明药物可以有效抑制 ICAM-1 的转录和翻译， 减轻局部炎症细胞浸润 ( 表 3、 4)。 0082 表 3 各组在各区心肌组织 ICAM-1 蛋白水平的变化 (ng/mgprot， XS) 0083 0084 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0085 表 4 各组在各区心肌组织 ICAM-1 mRNA 水平的变化 0086 ( 相对假手术组正常区含量， XS) 0087 0088 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.0。

38、1 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0089 3、 心肌组织中血管细胞粘附分子 1(VCAM-1) 蛋白和 mRNA 含量 0090 正常区心肌组织中 VCAM-1 蛋白和 mRNA 含量在各组之间均无显著性差异 (P 均 0.05)。与正常区心肌组织比较， 模型组和药物治疗组一样， 再灌注区和无再流区心肌 组织中 VCAM-1 蛋白和 mRNA 含量均显著升高 (P 均 0.01)， 且无再流区升高更显著 (P 均 0.05)， 提示再灌注区和无再流区局部粘附分子表达上调， 促进炎细胞浸润和内皮损伤。 0091 与模型。

39、组相比较， 不同剂量药物治疗组的再灌注区和无再流区心肌组织中 VCAM-1 蛋白和 mRNA 含量有所降低， 但是没有显著性差异 (P 均 0.05)， 提示本发明药物不能抑制 受损心肌局部 VCAM-1 的转录和翻译 ( 表 5、 6)。 0092 表 5 各组在各区心肌组织 VCAM-1 蛋白水平的变化 (ng/mgprot， XS) 0093 说 明 书 CN 101590121 B 9 8/12 页 10 0094 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0095 表 6 。

40、各组在各区心肌组织 VCAM-1 mRNA 水平的变化 0096 ( 相对假手术组正常区含量， XS) 0097 0098 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0099 4、 心肌组织炎症浸润情况的观察 0100 如图 1-4 所示， 光镜下， 假手术组、 模型对照组及药物治疗组正常区心肌组织形态 结构完整。 模型对照组中， 再灌注区和无再流区局部有大量的炎细胞浸润， 无再流区可见凝 固性坏死， 心肌纤维呈波浪状， 心肌细胞肿胀， 胞浆嗜伊红增高， 胞浆内出现颗粒状物。 与模 。

41、型对照组相比， 小剂量组再灌注区和无再流区心肌组织仍可见明显的炎细胞浸润 ； 中剂量 和大剂量组炎症细胞浸润和心肌组织的损伤有明显改善， 表明中剂量和大剂量本发明药物 可以明显抑制心肌局部炎症浸润， 减轻内皮细胞和心肌组织的损伤。 0101 5、 心肌组织血管内皮钙粘素 (VE-cadherin) 含量 0102 各组正常区心肌组织血管内皮钙粘素蛋白含量无显著性差异(P均0.05)。 与正 常区相比较， 模型组和药物治疗组再灌注区和无再流区心肌组织中血管内皮钙粘素均显著 减低 (P 均 0.05)， 且无再流区降低更显著 (P 均 0.05)， 提示再灌注区和无再流区血管 内皮细胞完整性受损，。

42、 无再流区更加明显。 0103 与模型组相比较， 小剂量和中剂量组再灌注区和无再流区血管内皮钙粘素含量无 显著增加(P均0.05) ； 大剂量组再灌注区和无再流区血管内皮钙粘素含量有显著增加(P 均 0.05)， 提示大剂量本发明药物能够抑制内皮细胞连接蛋白的降解， 保护内皮细胞结构 完整性 ( 表 7)。 0104 表 7 各组在各区心肌组织血管内皮钙粘素含量的变化 ( 相对灰度值， XS) 0105 说 明 书 CN 101590121 B 10 9/12 页 11 0106 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组。

43、相比 ： P 0.05， P 0.01 0107 6、 心肌组织 - 连环蛋白 (-catenin) 含量 0108 各组正常区心肌组织 - 连环蛋白含量无显著性差异 (P 均 0.05)。与正常区 相比较， 模型组和药物治疗组再灌注区 - 连环蛋白含量降低， 但无显著性差异 (P 均 0.05)， 无再流区 - 连环蛋白含量降低显著 (P 均 0.01)， 提示无再流区血管内皮细胞完 整性受损显著。 0109 与模型组相比较， 药物治疗组再灌注区和无再流区 - 连环蛋白含量增加， 但无 统计学差异 (P 均 0.05)， 提示本发明药物不能够增加 - 连环蛋白的表达水平。( 表 8) 011。

44、0 表 8 各组在各区心肌组织 - 连环蛋白含量的变化 ( 相对灰度值， XS) 0111 0112 0113 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0114 7、 心肌组织 连环蛋白 (-catenin) 含量 0115 各组正常区心肌组织 连环蛋白含量无显著性差异 (P 均 0.05)。与正常区 相比较， 模型组和药物治疗组再灌注区和无再流区 连环蛋白含量无显著性差异 (P 均 0.05)， 提示心肌缺血再灌注过程中， 连环蛋白含量无明显变化。( 表 9) 0116 表 9 。

45、各组在各区心肌组织 连环蛋白含量的变化 ( 相对灰度值， XS) 0117 说 明 书 CN 101590121 B 11 10/12 页 12 0118 与正常区相比 ： #P0.05， #P0.01 ； 与再灌注区相比 ： +P0.05， +P0.01 ； 与对照组相比 ： P 0.05， P 0.01 0119 三、 结论 0120 以上研究结果发现与正常心肌组织相比， 模型组再灌注区和无再流区 P- 选择素 和ICAM-1蛋白及mRNA水平都有明显升高， 无再流区比再灌注区炎症损伤程度更加显著。 此 外， 心肌组织 HE 染色结果也显示， 模型对照组的再灌注区和无再流区局部有大量炎细胞。

46、浸 润， 无再流区心肌细胞肿胀， 胞浆嗜伊红增高， 胞浆内可见颗粒状物。这些结果表明粘附分 子表达上调所介导的内皮损伤和炎细胞浸润， 在保护内皮细胞屏障功能完整性中起着重要 的作用。 0121 与模型对照组相比， 中剂量和大剂量本发明药物可以明显降低再灌注区和无再流 区P-选择素和ICAM-1蛋白表达， 而大剂量本发明药物可以从mRNA的转录水平上抑制P-选 择素和 ICAM-1 的表达。病理形态学检测结果表明， 与模型对照组相比， 中剂量和大剂量本 发明药物组炎症细胞浸润程度也明显降低， 大剂量组的抑制效果更加明显。以上结果表明 本发明药物可以降低心肌损伤局部细胞粘附分子的表达， 抑制中性粒。

47、细胞活化， 减轻内皮 细胞损伤和心肌局部炎症浸润。 0122 与正常心肌组织相比， 再灌注区血管内皮钙粘素的表达明显减少， 无再流区内血 管内皮钙粘素和 - 连环蛋白的含量显著降低， 而 - 连环蛋白含量在各区之间无明显差 异， 表明再灌注区内皮细胞完整性已经受损， 无再流区损伤程度更重， 而且血管内皮钙粘素 和 - 连环蛋白在维持内皮细胞屏障功能中有重要的作用， 其表达水平下调促进了无再流 的发生。与模型对照组相比， 大剂量本发明药物可以提高再灌注区和无再流区血管内皮钙 粘素表达水平， 表明大剂量本发明药物能够抑制血管内皮钙粘素的降解， 改善和保护内皮 细胞结构完整性， 继而维持血管内皮屏障功能。 0123 综上所述， 本发明药物能够抑制细胞粘附分子的表达， 抑制炎症反应， 增加血管内 皮钙粘素含量， 保护内皮细胞屏障功能完整性。 附图说明 0124 图 1 光镜观察心肌组织 HE 染色结果 ( 高倍 )A ： 假手术组 ； B ： 模型对照组再灌注 区 ； C ： 模型对照组无再流区 ； 0125 图2光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)D ： 小剂量组再灌注区 ； E ： 小剂量组无 再流区 ； 0126 图3光镜观察心肌组织HE染色结果(高倍)。