本发明提供了一种稳定的敏感活性物质的制剂，其具有降低的 吸湿性，以及一种用于制备这样的制剂的方法，尤其是通过冷冻干 燥。
冷冻干燥(冻干)和干燥技术作为用于稳定敏感活性物质的方 法是熟知的。敏感活性物质通常被理解为不稳定的活性物质，并且 包括敏感性有机和/或无机分子、生物高分子(例如多肽、蛋白质、 酶、荷尔蒙、维生素、抗生物、多糖、脂)、杀死(灭活)的或活 的完整活细胞(whole live cell)，包括病毒(包括噬菌体)、细菌、 真菌和/或真核生物。这样的活性物质可用作菌苗(疫苗)、起始有 机体，用于酿造、烘焙、堆制肥料、和/或青贮饲料生产、以及溶剂、 抗生素和/或生物产品(bioproduct)等的工业生产。
提供的用于冷冻干燥或干燥的药物产品、活细胞或其生物产品 应被调制，以确保干燥后的产品具有一个或多个以下特性：
有活性；
贮存稳定；
作为栓或块(饼)的粘着性；
干燥至规定的含水量；
从药物和/或商业可接受性角度可以提供用于美容；以及
可溶解(优选易溶解的)。
另外，当要将干燥过的产品散布或以粉末形式使用时，可能引 入合适的颗粒大小是重要的，其或者药学上有效或者防止粉末不会 聚结和堵塞气溶胶喷雾装置、喷射器或吸入器。如果需要，干燥的 粉末应能够经受进一步的处理，如解聚、混合、研磨、调剂和/或包 装等。
为了改进这些特性，在制剂中可以引入添加剂和/或赋形剂，与 活性成分相结合。
从物理上单个组分可以为：
完全结晶的；
完全无定形的；
起初结晶的但是被干燥或冷冻干燥工序转化成无定形形式；
已认识到，当干燥特定敏感活性物质(例如无机或有机分子或 生物产品，包括多肽、蛋白质、酶、杀死的整体或活的细胞)时， 保持无定形态可能是必要前提。这是因为这样的不稳定活性物质可 能需要赋形剂在分子水平的专门保护，以保持稳定。
然而，在干燥之后，如果将粉末暴露在空气中，则保持无定形 态通常导致湿气和空气被吸入干燥的产品中。这将使产品降解和/ 或使得给药很困难。
为了防止湿气和空气的进入，有必要在将产品从冻干机或干燥 器取出或转移到惰性、无湿气气氛中之前，在冻干机或干燥器内将 产品密封在容器中，并确保所有其他处理在这样的环境中进行。这 样的安排对产品的制备过程增加了费用。
一般说来，通常用于吸入器、喷射器、瓶、小袋、片剂或口服 剂量的容器会允许较小程度的潮湿空气进入。对于敏感活性物质来 说，这种进入可能足以危害到产品活性或贮存稳定性。产品为干粉 形式时，产品也有可能会充分聚结而阻塞喷射器或吸入器，从而负 面影响其效能。
湿气或空气吸收具体的负面影响包括：
●由湿气吸收到粉末中所导致的粒径变化，其中，该粉末是 用来从喷射器或吸入器被散布为分散颗粒，用于鼻或肺的 施用，或者，如果打算用振动机(shaker)或喷射器散布粉 末以用于口、耳、局部(即用于伤口、内脏器官或皮肤)、 眼或肛门的施用，而在粒径和物理性质上的变化，以至于 危害到喷射器或涂药器的效能。
●粉末暴露或含水量的增大高于最佳值也可能会降低贮存稳 定性(shelf stability)，其通过促进产品的化学降解导致降低 贮存稳定性。
●以及通过上述的湿气吸收而改变粉末的尺寸分布和物理性 质，空气中的反应性气体如氧气和二氧化碳进入粉末产品 可能会影响该药物或产品的活性、效能或贮存稳定性，其 中所述药物或产品是用来作为粉剂给药、配制成复合或发 酵剂培养物(starter culture)，或者将被重组用于注射或给药 的干燥产品。
已经找到了对这些问题的解决方案。
根据本发明，提供了一种粉状制剂，其为敏感活性物质和赋形 剂的冻干混合物，包含：
以重量计从0.01％，优选从0.1％，更优选从0.5％至50％的敏 感活性物质；
以重量计从50％至99.99％，优选至99.9％，更优选至99.5％的 赋形剂；
其中，至少以重量计0.1％的混合物为无定形态。
已经令人惊奇地发现，通过将制剂的敏感活性物质和赋形剂组 合成稳定的结晶/无定形基质，制剂具有显著降低的吸湿性。通过在 75％相对湿度的环境中，在8小时后制剂重量增加的百分数测得的 根据本发明的制剂的吸湿性优选以重量计低于5％，更优选以重量 计低于3％，最优选以重量计低于2％。这样，本发明省却了以下需 要，即，在将干燥的产品从冻干机或干燥器中取出用以研磨和最后 包装之后，在粉状制剂暴露于空气时，对干燥产品加以保护的需要， 或者制剂在其主容器(例如，气溶胶喷射器或喷射器)中的贮存或 散布期间防止潮湿空气进入到产品中的需要。
根据本发明，进一步提供了包括根据本发明的制剂的剂型。该 剂型可以可选地为包括该制剂的包装物(如胶囊(尤其是明胶胶 囊)、口服单剂包装物、瓶或小袋)或已由该制剂形成的制品(如 片剂)。
根据本发明，还提供了根据本发明的药物制剂，用于通过鼻内 给药用在人或动物身体的治疗处理中。
根据本发明，进一步提供了根据本发明的制剂在制备用于通过 鼻内给药治疗人或动物身体的药物中的应用。
在本发明的制剂中，适宜地以重量计从0.1％，优选从0.5％， 更优选从1％至50％的混合物呈无定形态。
例如，本发明的一种制剂可包含：
以重量计从0.01％，优选从0.1％，更优选从0.5％至50％的无 定形态敏感活性物质；
以重量计从50％至99.99％，优选至99.9％，更优选至99.5％的 晶态赋形剂；
以重量计0-5％的无定形态赋形剂。
例如，本发明的另一种制剂可能包含：
以重量计从0.01％，优选从0.1％，更优选从0.5％至50％的晶 态敏感活性物质；
以重量计从50％至99.89％，优选至99.8％，更优选至99.4％的 晶态赋形剂；
以重量计0.1-5％的无定形态赋形剂。
更具体地，本发明的制剂可以包含：
以重量计从0.01％，优选从0.1％，更优选从0.5％至25％的无 定形态或晶态敏感活性物质；
以重量计从75％至99.49％，优选至99.4％，更优选至99％的晶 态赋形剂；
以重量计0.5-5％的无定形态赋形剂。
如果需要，可包含少量(从0.1％至10％w/w，优选从0.1％至 1％w/w)的敏感活性物质的添加剂/稳定剂(如抗氧化剂、自由基清 除剂和/或梅拉德反应抑制剂(Maillard reaction suppresser)。抗氧化 剂、自由基清除剂和/或梅拉德反应抑制剂对防止由于干燥过程引起 的氧化、自由基引发或梅拉德反应所导致的贮存稳定性的损失很有 用。
在本发明种所使用的赋形剂和敏感活性物质的冻干混合物通 常在组成上与赋形剂和敏感活性物质的水溶液相同。因此，根据本 发明的制剂的平均颗粒将包含与其在初始溶液中的百分数相同的 百分量的敏感活性物质和赋形剂。
根据本发明，可将打算用于冷冻干燥(冻干)的敏感活性物质 和赋形剂的结晶/无定形特性分为三组：
1.其为结晶状并在整个冻干(以提供干燥、结晶的基质)过程 中保持这种形式的活性物质和赋形剂。可将赋形剂限定为结晶状并 且可选自易溶盐(如氯化钠、氯化钾)、一些氨基酸(如甘氨酸)、 一些糖醇(如甘露醇和山梨醇)、以及其他有机分子。
2.其为结晶状但可通过冷冻诱导成非结晶或无定形态的活性 物质和赋形剂，并且一旦处于这种状态，就在整个随后的干燥、最 后的成品精加工、贮存和配送中保持非无定形态。实例包括一些氨 基酸(如谷氨酰胺或丝氨酸)、单糖(如葡萄糖)、二糖(如蔗糖、 海藻糖、乳糖)、三糖(如棉子糖)、多糖、一些聚乙二醇(如具有 分子量为约6000的聚乙二醇)、一些多肽(如聚氨基酸)和/或聚合 物(如聚d-乳酸)。
3.其为非结晶状(无定形)并且在整个随后的干燥、调剂以 及最后的成品精加工、贮存和配送中保持无定形态的活性物质和/ 或赋形剂。实例包括一些糖(如无定形乳糖)、一些聚乙二醇(如 具有分子量直至1000的聚乙二醇)、多聚糖(polyglycan)、多糖(如 葡聚糖)、环糊精、聚烯吡酮、超细纤维素、一些聚合物(如马铃 薯淀粉)以及蛋白质。
为了本发明目的，第2和3组中的化合物限定为无定形态。
敏感活性物质优选不稳定活性物质，尤其是不稳定有机和/或无 机分子、生物高分子、多肽、蛋白质、酶、荷尔蒙、维生素、抗生 素、多糖、脂、杀死或活的完整活细胞(尤其是病毒(包括噬菌体)、 细菌、真菌和/或真核生物)。不稳定的物质通常被理解为在正常条 件(即，环境温度、压力以及湿度)下会发生降解的物质，或者在 正常条件下有化学反应性或不稳定的物质。
敏感活性物质优选酶(如乳酸脱氢酶、L-天门冬酰胺酶、或苯 丙氨酸氨裂解酶)、用于种子培养的活酵母(如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevissiae))、用于种子培养的活细菌(如大肠杆 菌(Escherichia coli))、用于诊断用途的活细菌(如鼠伤寒沙门氏 菌(Salmonella typhimurium))、用于青贮用途的活细菌(如嗜酸乳 杆菌(lactobacillus acidophilus))、活的减毒疫苗(如流感病毒菌株 WSN)、或用于治疗或诊断用途的噬菌体(如噬菌体174)。
可以在单个制剂中引入几种敏感活性物质，以提供更有效的产 品。可通过加入一种或多种化合物来使敏感活性物质增效，该一种 或多种化合物本身可以不具活性，但其可以加强活性成分的效果或 用作佐药。
赋形剂应该优选满足一个或多个以下参数：
适应加工要求；
对活性物质无损害；
提供可溶解、可吸收的产品；
提供贮存稳定的产品；以及
提供可商业接受的产品。
根据本发明的制剂优选药物制剂。当制剂为药物制剂时，赋形 剂应优选满足一个或多个以下参数：
药学惰性的；以及
动物或人组织(尤其是鼻组织和鼻生理功能、或耳组织和耳生 理功能、或口组织或口生理功能、或眼组织或眼生理功能、或创伤 /靶组织或伤口/靶组织生理功能、或肛门/消化道组织或肛门/消化道 生理功能)耐受性好的。
可能使用的赋形剂包括糖、多糖和/或糖醇。
术语“环糊精”指的是环状寡糖，如α-、β-以及γ-环糊精和/ 或其衍生物，如甲基化β-环糊精。
术语“糖”包括单糖(如葡萄糖)、二糖(如乳糖、麦芽糖、 海藻糖、蔗糖、和/或甘蔗糖)以及多糖(如葡聚糖)。
术语“糖醇”指的是糖多元醇如甘露醇、山梨醇、肌醇和/或木 糖醇。
根据本发明的制剂具有这样的优点：不需要防腐剂(即，杀菌 剂或杀真菌剂)。
根据本发明的药物制剂可在无菌流体中复配(重组)后非肠道 地给予，或在无菌或未消毒复配(重组)流体中复配后作为溶液或 悬浮液使用或施用。
根据本发明的药物制剂还可利用鼻腔吹入器(nasal insufflator) 或无源装置来给予。例如，将制剂置于胶囊中，而胶囊设置在吸入 或吹入装置中。用针刺穿胶囊，以在胶囊上部和下部制成孔，并经 过装置将空气通过吸入或吹气吸入，以迫使粉状颗粒进入患者鼻 中。该制剂还可以惰性气体的喷射喷雾或悬浮在液体的有机流体中 给予。对于鼻内给药，根据本发明的制剂的需要量可为，例如在1 和50mg，通常在1至20mg之间，例如以每鼻孔给予约5至20mg。
本发明的制剂通常通过冻干进行制备。敏感活性物质和赋形剂 应适应干燥工序，并应在处理容器中具有一体积，以防止在处理(烧 蚀)期间干燥中的产品的迁移。
根据本发明的制剂的其他优点是：能够预期获得作为产物的干 燥粉末，其具有合适的粒径，以便活性物质舒适地保留以及在鼻粘 膜中的快速溶解、接着吸收到体循环中。根据本发明的制剂包括这 样的颗粒：其在整个处理、最后的成品精加工、贮存和配送中保持 稳定和均匀。该制剂是贮存稳定的并且流动性好，当分装到其最终 容器时不会出现问题并且便于患者用药。
通过热分析技术，确定根据本发明的制剂的无定形和结晶含量 的比例和持久性用于适应上述的结晶/无定形参数，该热分析技术包 括差示扫描量热法。制剂的粒径分布图形可以通过利用激光衍射技 术(例如用Malvern仪器公司的Mastersizer检测设备)的粒径表征 法描述。这种激光衍射粉末表征技术可以直接对该制剂的干粉试样 进行(干法分析)，或者对悬浮在溶液(制剂在其中不溶解)中的 该制剂的试样进行(湿法分析)。有必要确保分析的每个样品在表 征时是充分解聚的，这在利用湿法分析方法时实现得最好。利用这 种方法，颗粒聚集的解聚可通过在分析之前利用分散剂、表面活性 剂和/或样品的超声波降解来实现，并在分析过程中通过搅拌或样品 的再循环而保持。另外，样品的解聚可在显微镜下直观地得以证实。
通过遵循上述的结晶/无定形参数并假定组分的含水配方适于 冻干，则根据本发明的制剂优选具有一个或多个以下性质：
●适于鼻内递送的粒径，该粒径可通过冻干产生和保持；
●其中小颗粒一般具有小于5μm尺寸的小粒径分布(细粉) 被最小化；
●当从冻干机中取出并暴露于空气时，制剂的颗粒不会改变 大小也不会吸湿至颗粒聚集或变得有粘性而妨碍最后的成 品精加工或调剂以及影响药物活性；
●得到的鼻用粉末表现出高溶解性、提高的鼻内吸收性、以 及因此的极高的药物或生物活性。
根据本发明，还提供了一种医疗方法，该方法包括给人或动物 (优选哺乳动物)患者提供治疗有效量的根据本发明的制剂或治疗 有效量的根据本发明的剂型。
根据本发明，还提供了一种制备粉状制剂的方法，其包括形成 活性物质和赋形剂的混合溶液，以及冻干该溶液，以使至少以重量 计0.1％的冻干混合物呈无定形态。该溶液包含：
以重量计从0.01％，优选从0.1％，更有选从0.5％至50％的敏 感活性物质；
以重量计从50％至99.99％，优选至99.9％，更优选至99.5％的 赋形剂。
在本发明的方法中，冷冻条件应优选地加以选择，以提供：
●最优冰晶结构，以增进最大升华速率；
●结晶态在基质中的保持；和/或
●无定形态在基质中的产生和/或保持。
通过以下因素影响适宜冷冻条件的选择：
●溶液或悬浮液中敏感活性物质以及结晶或无定形赋形剂的 化学性质和浓度；
●冻干机的设计和规格；
●用来处理产品的主要容器；和/或
●样品装填深度。
可利用差示扫描量热法、差示热分析以及电阻分析(resistance analysis)来确定最佳冷冻条件。从这些分析，我们发现，理想地， 产品应以缓慢的速度或施加以产生或保持恰当基质组成的热退火 (heat annealing)周期进行冷冻。例如，使用了这样的冷冻速率和热 退火周期，冷冻速率每分钟约0.1至0.5℃，而热退火周期包括，例 如：在干燥之前，以每分钟0.1-1.0℃冷却产品至-45℃；保持2小时， 加温至-15℃，保持2小时，再冷却至-45℃，保持2小时。这些数 值可用作指导，但将依据活性物质的配方以及由设备和在冻干中使 用的其他成分引起的限制而变化。
例如，合适的干燥周期包括直接加热至5℃用于主干燥，将室 压(chamber pressure)增至150毫托(mTorr)以有利于热输入， 并将最终干燥温度增至20℃。设计用于特定产品/过程最优化的这 种周期的变化包括这样的周期：其中为了主要(基本)干燥的初始 相将板层温度(shelf temperature)升至15℃，然后逐渐降至5℃用 于主要(首要)干燥的剩余部分，同时将室压增大至300毫托，以 有利于热量输入到产品中，接着为了最后(二次)干燥将板层温度 增至25℃。
决定样品的冻干特性的因素包括：
●玻璃转变温度(Tg’)，其决定冷却物质的粘度显著下降以使 样品在冻干过程中塌陷的温度。玻璃/转化温度已通过差示 扫描量热法、差示热分析以及电阻分析确定；
●操作上将样品在冻干过程中塌陷的温度定义为塌陷温度 (Tc)。塌陷温度通过冷冻干燥显微镜确定。在没有复杂因 素(如在干燥样品上形成表皮)存在的情况下，塌陷和玻 璃转化温度通常近似；
●表皮形成和相关缺陷，也通过冷冻干燥显微镜确定。
参照所附附图，借助实施例对本发明进行描述说明，其中附图 给出一曲线图，其示出了甘露醇和海藻糖的冻干样品暴露在75％相 对湿度的环境中的重量增加百分比。
描述说明本发明的以下实施例不用于限制权利要求的范围。
方法实施例1
以下冻干周期已被有效用于具有Tg’或Tc为-16至18℃的制 剂。这意味着产品温度应保持在-23℃(即，-18℃加-5℃(用于操 作安全)＝-23℃)。
冷冻至-45℃
冷却速率为每分钟0.25℃
保持120分钟
主干燥：
板层温度(步骤1)-20℃
升温速率每分钟1.0℃
保持1200分钟
室压50毫托
板层温度(步骤2)0℃
升温速率每分钟1.0℃
保持720分钟
室压50毫托
板层温度(步骤3)5℃
升温速率每分钟1.0℃
保持1000分钟
室压50毫托
最后干燥
板层温度15℃
升温速率每分钟1.0℃
保持700分钟
室压50毫托
实施例2和3
在冻干后，对根据本发明的制剂和比较制剂的乳酸脱氢酶的酶 活性进行了检测。活性的检测以化学方式通过酶与其反应物乳糖的 反应来进行。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备。
比较实施例1：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
补加水至100g，作为冻干之前的起始制剂
实施例2：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例3：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g葡萄糖(在冻干后为无定形)
2.0葡聚糖(分子量70,000，在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例1中的酶在冻干处理后具有8％的活 性。相比之下，根据本发明的实施例2和3中的酶在冷冻干燥后具 有60％的活性
实施例4至7
冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的L-天门冬酰胺酶 (其为已知的抗癌药)的酶活性进行了检测。活性的检测以化学方 式通过酶与其反应物L-天门冬酰胺的反应来进行。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备。
比较实施例2：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
补加水至100g，作为冻干之前的起始制剂
实施例4：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g葡萄糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例5：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例6：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g蔗糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例7：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g海藻糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例2中的酶在冻干处理后具有低于1％ 的活性。相比之下，根据本发明的实施例4至7中的酶在冻干后具 有100％的活性。
实施例8
冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的苯丙氨酸氨裂解 酶(一种已知的药剂)的酶活性进行了检测。活性的检测以化学方 式通过酶与其反应物苯丙氨酸的反应来进行。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备。
比较实施例3：
0.1至1.0g酶
1.0g甘露醇
补加水至100g，作为冻干之前的起始制剂
实施例8：
0.1至1.5g酶
2.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例3中的酶在冻干处理后具有低于5％ 的活性。相比之下，根据本发明的实施例8中的酶在冷冻干燥后具 有70％的活性。
实施例9和10
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的酿酒酵母(用 于种子培养的活酵母)的存活率进行了检测。存活率的检测是通过 滴定法，其以利用固体琼脂平板平铺的每毫升真菌悬浮液的菌落形 成单位(cfu)的数目表示。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例4：
108～1012菌落形成单位的酿酒酵母
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例9：
108～1012菌落形成单位的酿酒酵母
10g甘露醇
1.0g海藻糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例10：
108～1012菌落形成单位的酿酒酵母
10g甘露醇
1.0g葡萄糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例4中的酿酒酵母在冻干处理后具有低 于1％的存活率。相比之下，根据本发明的实施例9和10的酿酒酵 母在冻干处理后具有25％的存活率。
实施例11至15
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的大肠杆菌 (Escherichia coli)(用于种子培养的活细菌)的存活率进行了检 测。存活率的检测是通过滴定法，其以利用固体琼脂平板平铺的每 毫升真菌悬浮液的菌落形成单位(cfu)的数目表示。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例5：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
1.0-5.0g甘露醇
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例11：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
1.0-5.0g甘露醇
1.0g海藻糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例12：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
1.0-5.0g甘露醇
1.0g蔗糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例13：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
1.0-5.0g甘露醇
1.0g葡萄糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例14：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
2.0g甘露醇
1.0g麦芽糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例15：
106～1012菌落形成单位的大肠杆菌
2.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例5中的大肠杆菌在冻干处理后具有低 于1％的存活率。相比之下，根据本发明的实施例11至15的大肠 杆菌在冻干处理后具有60％的存活率。
在实施例11a、12a、13a、14a以及15a中，除了包括有30mM 的硫脲作为自由基清除剂外，每种制剂以与实施例11至15相同的 方式进行制备。在冻干后，通过滴定法(其以利用固体琼脂平板平 铺的每毫升细菌悬浮液的菌落形成单位(cfu)的数目表示)测得， 这些制剂的贮存稳定性从30天(对于比较实施例5)提高到200天 (以损失1log存活率的时间来测量)。
实施例16至18
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的鼠伤寒沙门氏 菌(用于诊断用途的活细菌)的存活率进行了检测。存活率的检测 是通过滴定法，其以利用固体琼脂平板平铺的每毫升细菌悬浮液的 菌落形成单位(cfu)的数目表示。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例6：
106～1011菌落形成单位的鼠伤寒沙门氏菌
5.0g甘露醇
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例16：
106～1011菌落形成单位的鼠伤寒沙门氏菌
5.0g甘露醇
1.0g蔗糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例17：
106～1011菌落形成单位的鼠伤寒沙门氏菌
5.0g甘露醇
1.0g海藻糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例18：
106～1011菌落形成单位的鼠伤寒沙门氏菌
5.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例6中的鼠伤寒沙门氏菌在冻干处理后 具有低于1％的存活率。相比之下，根据本发明的实施例16至18 的大肠杆菌在冷冻干燥处理后具有40％的存活率。
实施例19至22
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)(用于青贮用途的活细菌)的存活率进 行了检测。存活率的检测是通过滴定法，其以利用固体琼脂平板平 铺的每毫升真菌悬浮液的菌落形成单位(cfu)的数目表示。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例7：
106～1012菌落形成单位的嗜酸乳杆菌
5.0g甘露醇
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例19：
106～1012菌落形成单位的嗜酸乳杆菌
10.0g甘露醇
10.0g胚牛血清(Foetal Calf Serum)(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例20：
106～1012菌落形成单位的嗜酸乳杆菌
5.0g甘露醇
1.0g海藻糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例21：
106～1012菌落形成单位的嗜酸乳杆菌
5.0g甘露醇
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例22：
106～1012菌落形成单位的嗜酸乳杆菌
5.0g甘露醇
1.0g蔗糖(在冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例7中的嗜酸乳杆菌在冻干处理后具有 低于1％的存活率。相比之下，根据本发明的实施例19的嗜酸乳杆 菌在冷冻干燥处理后具有60％的存活率，并且根据本发明的实施例 20至22的大肠杆菌在冷冻干燥处理后具有40％的存活率。
实施例23至26
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的流感病毒菌株 WSN(活的减毒疫苗)的传染性进行检测。将冻干之前和之后的传 染性检测结果表示为在鸡胚细胞单层(定义为“薄层”)中的空斑 形成单位(plaque forming unit)(每毫升的pfu，其中1pfu＝一个称 为“空斑”的损伤)。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例8：
108～1011空斑形成单位的流感病毒菌株WSN
1.0g氯化钠
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例23：
108～1011空斑形成单位的流感病毒菌株WSN
2.0g氯化钠
1.0g人体血清白蛋白(在冻干后为无定形)
1.0g乳糖醛酸钙
20ml小鸡尿囊液
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例24：
108～1011空斑形成单位的流感病毒菌株WSN
1.0g氯化钠
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
2.0g葡聚糖(分子量为110,000，冻干后为无定形)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例25：
108～1011空斑形成单位的流感病毒菌株WSN
1.0g氯化钠
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
1.0g单谷氨酸钠(梅拉德反应抑制剂)
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例26：
108～1011空斑形成单位的流感病毒菌株WSN
1.0g氯化钠
1.0g乳糖(在冻干后为无定形)
1.0g抗坏血酸(抗氧化剂)
补加至100g水作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例8中的流感病毒菌株WSN在冻干处 理后具有低于1％的传染性。相比之下，根据本发明的实施例23的 流感病毒菌株WSN在冷冻干燥处理后具有70％的传染性，并且根 据本发明的实施例24的流感病毒菌株WSN在冷冻干燥处理后具有 40％的传染性，与比较实施例8相比，实施例24和25的贮存稳定 性从在约40天的一个传染性log损失提高到在超过1000天的一个 传染性log损失(1log损失＝90％的算术损失)。这是以冻干之前和 之后在鸡胚细胞单层(定义为“薄层”)中的空斑形成单位(每毫 升的pfu，其中1pfu＝一个称为“空斑”的损伤)所测得的。
实施例27
在冻干后，对根据本发明的制剂和对比较制剂的噬菌体174 用于治疗和诊断用途的噬菌体)的活性进行检测。将冻干之前和之 后的活性检测表示成在大肠杆菌细菌细胞培养物(定义为“薄层”) 中的空斑形成单位(每毫升的pfu，其中1pfu＝一个称为“空斑” 的损伤)。
以下列出的制剂利用在方法实施例1中列出的冻干周期进行制 备：
比较实施例9：
1010空斑形成单位的噬菌体174
0.9g氯化钠
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
实施例27：
1010空斑形成单位的噬菌体174
0.9g氯化钠
0.1g血白清蛋白
0.1g葡聚糖聚合物
0.1g蔗糖
补加水至100g作为冻干前的起始制剂
结果发现，在比较实施例9中的噬菌体174在冻干处理后具 有低于1％的活性。相比之下，根据本发明的实施例27的噬菌体 174在冻干处理后具有60％的活性。
实施例28
以上实施例1至27表明，为保持含有敏感活性物质的制剂在 冷冻干燥过程中的生物活性/存活率，有必要引入这样的成分，其在 冻干过程中或者诱导形成或者保持无定形态。然而，已经知道冻干 的无定形物质将从其环境吸收湿气，导致物理性质的变差并且经常 导致无定形基质变得“有粘性”，而不适于进一步的加工(如解聚、 混合、研磨、调剂和/或包装等)。湿气的吸入还负面影响产品的贮 存稳定性。正因为这个原因，敏感活性物质的冻干制剂通常在小瓶 或其他可在暴露于周围环境之前在冻干机中加以密封的容器中进 行冻干。相反，在冻干处理过程中保持结晶性的制剂，尽管不能有 效保持诸如生物活性的性质，却具有稳定的物理性质、不吸收明显 量的湿气，因此是高度贮存稳定的。
这在以下的实施例中得到证实。下面的含有海藻糖(已知冻干 后在性状上为无定形)和甘露醇(已知在冻干过程中保持其结晶态) 的四种溶液是制备并冻干在小瓶中。
比较实施例10
甘露醇 200mg
加水至 2mL
提供10％w/v的甘露醇溶液
比较实施例11
甘露醇 20mg
加水至 2mL
提供1％w/v的甘露醇溶液
比较实施例12
海藻糖 200mg
加水至 2mL
提供10％w/v的海藻糖溶液
比较实施例13
海藻糖 20mg
加水至 2mL
提供1％w/v的甘露醇溶液
在冻干后，将得到的冻干基质暴露于75％RH(相对湿度)的 空气中，保持8小时的期间。在该期间，每隔一段时间，对每个样 品的湿气摄入量采用重量分析进行测量，并计算为样品重量增加的 百分数比。从图1可以清楚看出，虽然在无定形(海藻糖)样品中 明显摄入湿气，但在结晶(甘露醇)样品中没有明显摄入湿气。无 定形样品中的湿气摄入伴随着这些样品的物理质量的变差。
然而，通过利用根据本发明的含有敏感活性物质且包含结晶/ 无定形特性的赋形剂的制剂，既能保持敏感活性物质的生物活性/ 存活力(如在前面的实施例所观察到的)又获得稳定的物理性质(不 会明显吸入湿气)。令人惊奇地发现，本发明的实施例1至27具有 充分降低的湿气吸入，使得每个样品在高(75％)相对湿度的环境 暴露8小时的重量增加低于以重量计的3％。