本申请是申请日为2008年2月28日，申请号为200880004651.0，发明名称为“脊 髓损伤治疗剂”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及脊髓损伤治疗剂，更具体地说，涉及以肝细胞生长因子(以下简称为 “HGF”)蛋白质作为有效成分的脊髓损伤治疗剂。本发明还涉及以HGF蛋白质作为有 效成分的脱髓鞘疾病治疗剂。
背景技术
术语“脊髓损伤”(SCI、spinalcordinjury)指的是在由于例如交通事故或从高处跌 落引起的脊椎脱臼骨折等外伤对脊髓实质造成损伤的部位以下呈现末梢的运动、感觉 和植物性神经系统麻痹的临床状态。
目前，脊髓损伤患者的数量在日本约为100,000人，在美国约为250,000人。每年， 此类患者的数量在日本至少增加5,000人，在美国至少增加10,000人。
随着近年医疗的进步，损伤后的存活率升高，为了抑制障碍的发展而进行的脊髓 损伤的重建手术的方法也取得显著进步。因此，在抑制继发性神经学恶化方面开始取 得成功。进一步地，由于康复技术的进步和支持装置(电动轮椅等)的开发，患者的 日常生活活动(ADL)得到改善。然而，由于缺乏从根本上治疗脊髓损伤自身(即， 保护神经防止神经损伤和神经再生)的有效方法，目前存在众多不能自主排尿、排便、 进行体力劳动或步行的患者。
HGF最初被确定为对成熟肝细胞强的丝裂原，在1989年被基因克隆(非专利文 献1、2)。尽管HGF作为肝细胞生长因子被发现，但根据在包括基因敲除/基因敲入小 鼠技术的表达和机能分析上的近来的大量研究，还发现HGF为新的神经营养因子(非 专利文献3、4)。
在专利文献1中，公开了在行为学和组织学上对于HGF基因对帕金森病模型大鼠 的效果的实施例。其中呈现出的实验结果表明，HGF基因的在先给药对保护中脑黑质 中的多巴胺神经元免受神经毒素6-羟多巴胺(6-OHDA)的影响具有效果。该专利文 献1还表明，基于这些实验结果，HGF基因不仅能够用于帕金森病的治疗，还可用于 包括阿尔茨海默病、脊髓小脑退行性变、多发性硬化、纹状体黑质变性(SND)、脊髓 性肌萎缩(SMA)、亨廷顿舞蹈病、夏伊-德雷格综合征、腓骨肌萎缩症(CMT)、弗 里德赖希共济失调、重症肌无力、烟雾病、淀粉样变性、皮克病、亚急性脊髓视神经 病、皮肌炎/多肌炎、克-雅氏病、白塞综合征、系统性红斑狼疮(SLE)、结节病、 结节性动脉外膜炎(PN)、后纵韧带骨化、弥漫性脊椎管狭窄、混合性结缔组织病 (MCTD)、糖尿病末梢神经炎和缺血性脑血管病(例如脑梗死、脑出血)的其它神经 疾病的治疗，作为这种神经疾病之一，还举出脊髓损伤。
然而，6-OHDA为对合成儿茶酚胺类的神经细胞(具体地说，为去甲肾上腺素产 生神经细胞、肾上腺素产生神经细胞和多巴胺产生神经细胞)具有特异性的效果的特 殊的合成毒素，而且对在以上列出的大多数疾病中据报导被变性或杀死的神经细胞不 表现出任何毒性。因此，不可能根据6-OHDA具有神经细胞死亡抑制效果来预测对包 括脊髓损伤的上述疾病产生的效果。此外，上述专利文献1未记载给予HGF蛋白质带 来的治疗效果。
非专利文献5中记载了，将整合HGF基因(HGF表达病毒载体)的病毒载体注 入到大鼠第十胸椎的脊髓内，然后在相同部位制造脊椎挤压伤，之后，在运动机能的 评价时观察下肢运动机能的恢复。
然而，尽管脊髓损伤通常由事故等中受到的外伤引起，但在非专利文献5中，在 胸椎挤压伤之前3天注入HGF表达病毒载体。明显不可能以这种方式预测事故的发生 和损伤部位、并预先局部给予HGF表达病毒载体。
此外，脊髓损伤患者的状态在受伤后72小时有可能不稳定，可能很难插入用于鞘 内给药的导管。因此，决定适当的给药时间是重要的。
进一步地，还存在许多可想象的问题，例如控制在通常的基因治疗中蛋白质表达 量的困难性、由于重复给药而使一部分基因表达载体存在触发免疫应答的危险、以及 一部分基因表达载体存在将基因导入到基因组中的可能性。
包括脊髓神经的有髓神经的神经纤维被由称为髓磷脂的脂蛋白的层形成的鞘覆 盖。该髓鞘发挥作为神经纤维的绝缘体的作用，通过有髓神经能够进行跳跃传导。将 该髓鞘的破坏称为脱髓鞘。当发生脱髓鞘时，由于神经传递的显著缓慢而引起多种神 经症状。伴有这种脱髓鞘的疾病通常称作脱髓鞘疾病，代表性地包括例如多发性硬化。 脊髓损伤也通常伴有脱髓鞘。
多发性硬化为以弥漫性脱髓鞘斑的形成为特征的缓慢发展的中枢神经系统疾病。 多发性硬化的发病率在欧洲和美国为每100,000人中约50～100个病例，在日本为每 100,000人中约1～5个病例。症状因人而异，可包括视觉丧失、复视、眼球震颤、发 音障碍、虚弱、感觉异常、膀胱问题和心境不稳。该疾病随着反复这种症状缓解和重 新开始而发展。虽然怀疑病因为免疫异常，但是还未确定。因此，与其它脱髓鞘疾病 相同，目前还没有根本性治疗方法。
如上所述，尽管已知包括注入整合HGF基因的病毒载体(HGF表达病毒载体) 的方法，也已知当诸如疱疹病毒(HSV)或腺病毒等病毒引入到脑内时，在脑中产生 浓度依赖性炎症反应，引起脱髓鞘(专利文献2)。
因此，同样根据此观点，包括使用整合HGF基因的病毒载体的治疗方法明显不会 成为脱髓鞘疾病的根本性治疗方法。由此要求确立不引起脱髓鞘的治疗方法。
专利文献1：WO2003/045439号小册子
专利文献2：WO2005/100577号小册子
非专利文献1：Biochem.Biophys.Res.Commun.,122,1450-1459(1984)
非专利文献2：Nature,342,440-443(1989)
非专利文献3：Nat.Neurosci.,2,213-217(1999)
非专利文献4：Clin.Chim.Acta.,327,1-23(2003)
非专利文献5：日本整形外科学会杂志、2005.08.25、Vol.79,No.8,pS764
发明内容
本发明的目的在于，提供不使用基因，通过简便的方法就可以治疗脊髓损伤和脱 髓鞘疾病的药剂。
为了解决上述课题，本发明人进行了广泛的调查研究。结果他们发现，HGF蛋白 质在包括脱髓鞘抑制效果和5HT神经再生效果的脊髓损伤治疗中具有最期待的机能 再生效果，HGF蛋白质作为脊髓损伤的治疗剂是有用的。而且，本发明人还发现，HGF 蛋白质作为脱髓鞘疾病的治疗剂是有用的。基于这些发现，最终完成了本发明。
因此，本发明涉及：
(1)脊髓损伤治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分；
(2)根据上述(1)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号1或2的氨 基酸序列的蛋白质，具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列且具 有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相同的所述蛋白 质之一的部分肽；
(3)根据上述(1)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号2的氨基酸 序列的蛋白质；
(4)根据上述(1)～(3)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂适于 局部用于脊髓损伤部位；
(5)根据上述(4)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的剂 型；
(6)根据上述(4)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘内 给药用注射剂的剂型；
(7)根据上述(1)～(6)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为脊 髓神经的脱髓鞘抑制剂；
(8)脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓 损伤后两周内给药；
(9)脊髓损伤治疗剂，所述治疗剂含有HGF蛋白质作为有效成分，且在刚脊髓 损伤后4天内给药；
(10)脊髓损伤治疗方法，所述方法包括对脊髓损伤患者给予有效量的HGF蛋白 质；
(11)HGF蛋白质在制备脊髓损伤治疗剂中的应用；
(12)脊髓损伤治疗用HGF蛋白质；
(13)脱髓鞘疾病治疗剂，含有HGF蛋白质作为有效成分；
(14)根据上述(13)所述的治疗剂，其中，所述脱髓鞘疾病为选自多发性硬化、 视神经脊髓炎、Balo同心圆性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、希尔德(Schilder) 病、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、宾斯旺格病、 缺氧性脑病、脑桥中央髓鞘溶解、格-巴二氏综合征、费希尔综合征和慢性炎症性脱髓 鞘性多发性神经根神经病(CIDP)中的疾病；
(15)根据上述(13)或(14)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号 1或2的氨基酸序列的蛋白质，为具有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨 基酸序列且具有活性与HGF实质上相同的蛋白质，或者为具有活性与HGF实质上相 同的所述蛋白质之一的部分肽；
(16)根据上述(13)或(14)所述的治疗剂，其中，HGF蛋白质为具有序列号 2的氨基酸序列的蛋白质；
(17)根据上述(13)～(16)中的任意一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂 适于局部用于疾病部位；
(18)根据上述(17)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为鞘内给药用注射剂的 剂型；
(19)根据上述(17)所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为通过缓释泵进行的鞘 内给药用注射剂的剂型；
(20)脱髓鞘疾病治疗方法，所述方法包括对脱髓鞘疾病的患者给予有效量的HGF 蛋白质；
(21)HGF蛋白质在制备脱髓鞘疾病治疗剂中的应用；以及
(22)脱髓鞘疾病治疗用HGF蛋白质。
本发明的治疗剂对脊髓损伤和脱髓鞘疾病发挥非常优异的治疗效果。本发明的治 疗剂还具有不存在与基因治疗相关的问题的优点。进一步地，本发明的治疗剂具有以 下优点，即有效地抑制和治疗在脊髓损伤和脱髓鞘疾病(例如多发性硬化)产生的有 髓神经的脱髓鞘。而且，由于本发明的治疗剂无需使用例如HSV或腺病毒等病毒载体， 所以不会引起脱髓鞘。本发明的治疗剂的进一步优点在于，与基因治疗不同，可以容 易地调节有效成分HGF的供给量或给药量，还可以调节给药时间，并可以反复或连续 地进行给药。
附图说明
图1为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的脊髓组织的苏木精-曙红(HE)染色图像，以及对照组的脊髓损伤 后的脊髓组织的苏木精-曙红(HE)染色图像；
图2为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的脊髓组织的勒克司坚牢蓝(LFB)染色图像，以及对照组的脊髓 损伤后的脊髓组织的勒克司坚牢蓝(LFB)染色图像；
图3为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的脊髓组织的5-羟色胺(5HT)染色图像，以及对照组的脊髓组织的 5-羟色胺(5HT)染色图像；
图4为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的脊髓组织的5HT和生长相关蛋白-43(GAP43)的染色图像；
图5为表示脊髓损伤后立即以200μg/2周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分的线图，以及对照组的脊髓 损伤后的脊髓组织的BBB评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给 药时间；
图6为表示脊髓损伤后立即以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB 评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；
图7为表示脊髓损伤后4天以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB 评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；
图8为表示脊髓损伤后2周以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及于对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB 评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间；和
图9为表示脊髓损伤后8周以400μg/4周给予HGF蛋白质的HGF蛋白质组中 的脊髓损伤后的BBB评分的线图，以及对照组的脊髓损伤后的脊髓组织的BBB 评分的线图，线图中，箭头表示HGF蛋白质或PBS给药时间。
具体实施方式
本发明中使用的HGF蛋白质为已知物质。若被纯化成可以作为药物使用的程 度，则可使用通过各种方法的任何一种制备的HGF蛋白质。HGF蛋白质例如可以 通过对产生HGF蛋白质的原代培养细胞或来自株化细胞的细胞进行培养，随后从 培养上清分离纯化HGF蛋白质来制备。或者，可使用通过基因工程方法制备的 HGF蛋白质，基因工程方法中，将编码HGF蛋白质的基因整合到适当的载体中， 将该载体插入到适当的宿主细胞中进行转化，从该转化体的培养上清得到目标重 组HGF蛋白质(例如参照日本特开平5-111382号公报、Biochem.Biophys.Res. Commun.1989年、第163卷,p.967等)。对上述宿主细胞不特别限制。例如， 可使用一直以来在基因工程方法中使用的各种宿主细胞的任意一种，例如大肠杆 菌、酵母或动物细胞。只要如此得到的HGF蛋白质具有与天然型HGF蛋白质实 质上相同的活性，则可以在其氨基酸序列中具有一个或多个(例如1～8个，以下 相同)被置换、缺失或附加的氨基酸，或者同样具有被置换、缺失或附加的糖链。 这种HGF蛋白质的实例包括下述的5个氨基酸缺失型HGF蛋白质。在此，对于 氨基酸序列，“一个或多个被置换、缺失或附加的氨基酸”指的是，通过例如基因工 程方法或位点专一诱变等已知技术方法，或者天然地产生的被置换、缺失或附加 的氨基酸的数(一个～多个)。具有被置换、缺失或附加的糖链的HGF蛋白质例 如可以为用酶等对附加到天然HGF蛋白质上的糖链进行处理得到的HGF蛋白质， 改变糖链附加部位的氨基酸序列以不附加糖链的HGF蛋白质，或者改变氨基酸序 列以使糖链附加到与天然的糖链附加部位不同的部位的HGF蛋白质。
进一步地，可包括与HGF蛋白质的氨基酸序列具有至少约80％、优选至少约 90％、更优选至少约95％的同源性且实质上作为HGF发挥作用的蛋白质。对于上 述氨基酸序列，“同源”指的是与蛋白质的一级结构相比，构成各自的氨基酸序列的 氨基酸残基的一致程度。
上述HGF蛋白质的实例包括序列号1和2的氨基酸序列。序列号2的HGF 蛋白质为序列号1所示的氨基酸序列中的第161位～165位氨基酸的5个氨基酸残 基缺失的5个氨基酸缺失型HGF蛋白质。具有序列号1或2的氨基酸序列的蛋白 质为来源于人的天然HGF蛋白质，具有HGF的丝裂原活性和运动因子活性。
含有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的蛋白质为含有 与序列号1或2的氨基酸序列具有至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约 95％同源性的氨基酸序列的蛋白质。优选的实例包括作为HGF发挥作用且相对于 序列号1或2的氨基酸序列，具有一个～多个氨基酸残基已被插入或缺失的氨基 酸序列、一个～多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基置换的氨基酸序列、或者一 个～多个氨基酸残基已被修饰的氨基酸序列的蛋白质。被插入或置换的氨基酸可 为通过基因编码的20种氨基酸以外的非天然氨基酸。非天然氨基酸可为具有氨基 和羧基的任意化合物，例如γ-氨基丁酸。这些蛋白质可单独使用，或者以它们的 混合物形式使用。含有与序列号1或2的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的 蛋白质包括但不限于，记录在NCBI数据库(NCBI-GenBankFlatFileRelease164.0) 中的AccessionNo.BAA14348和AAC71655的人HGF。
可在本发明中使用的HGF蛋白质适用于人时优选为上述来源于人的蛋白质， 但是也可使用来源于人以外的哺乳动物(例如猴、母牛、马、猪、绵羊、狗、猫、 大鼠、小鼠、兔、仓鼠、豚鼠和黑猩猩)的HGF蛋白质。这种HGF蛋白质的示 例性实例包括但不限于，例如记录在NCBI数据库中的：小鼠HGF(例如Accession No.AAB31855、NP_034557、BAA01065、BAA01064)、大鼠HGF(例如Accession No.NP_58713(具有序列号3所示的氨基酸序列的蛋白质))、母牛HGF(例如 AccessionNo.NP_001026921、BAD02475)、猫HGF(例如AccessionNo. NP_001009830、BAC10545、BAB21499)、狗HGF(例如AccessionNo. NP_001002964、BAC57560)和黑猩猩HGF(例如AccessionNo.XP_519174)。
在本发明中使用的HGF蛋白质可在C末端具有羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO －)、酰胺基(-CONH2)或酯基(-COOR)。其中，酯中的R例如为甲基、乙基、 正丙基、异丙基和正丁基等C1-6烷基，例如环戊基和环己基等C3-8环烷基，例如 苯基和α-萘基等C6-12芳基，包括诸如苯甲基和苯乙基等苯基-C1-2烷基以及诸如α- 萘甲基等α-萘基-C1-2烷基等的C7-14芳烷基，以及新戊酰氧甲基。本发明的HGF 蛋白质在羧基被酰胺化或酯化时，还可包括在C末端以外的位置上具有羧基(或 羧酸盐)的HGF蛋白质。这种情况下的酯例如可为上述C末端酯。可在本发明中 使用的HGF蛋白质还包括上述N末端的蛋氨酸残基的氨基被保护基团(例如包括 甲酰基和诸如乙酰基等C2-6烷酰基的C1-6酰基)保护的蛋白质、N末端的通过体内 断裂形成的谷氨酰基转化为焦谷氨酸的蛋白质、或者分子内的氨基酸的侧链上的 官能团(例如-OH、-SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基)被适当的保护基团(例 如包括甲酰基和诸如乙酰基等C2-6烷酰基的C1-6酰基)保护的蛋白质中的任何一 种以及诸如通过糖链键合得到的糖蛋白类等的复合蛋白质类。
在本发明中使用的HGF蛋白质可为其部分肽(以下有时简称为“部分肽”)的 形式。这种部分肽的实例包括为上述HGF蛋白质的部分肽且具有与HGF实质上 相同的活性的任何一种蛋白质。在本发明中，优选的部分肽包括，在构成上述HGF 蛋白质的氨基酸序列中，含有至少约20个、优选至少约50个、更优选至少约100 个氨基酸的氨基酸序列的肽类。特别优选的实例包括在序列号1的人HGF氨基酸 序列的N末端侧开始具有第32位氨基酸到第210位氨基酸的氨基酸序列(从HGF 上的N末端发夹环到第一kringle结构域的序列)的肽、以及在序列号1的人HGF 氨基酸序列的N末端侧开始具有第32位氨基酸到第288位氨基酸的氨基酸序列 (从HGF上的N末端发夹环到第二kringle结构域的序列)的肽。在本发明的部 分肽中，C末端可为羧基(-COOH)、羧酸盐(-COO－)、酰胺基(-CONH2)或 酯基(-COOR)。而且，与上述HGF蛋白质相同地，部分肽包括N末端的蛋氨酸 残基上的氨基被保护基团保护的部分肽、N末端的通过体内断裂形成的Gln(谷氨 酰基)转化为焦谷氨酸的部分肽、分子内的氨基酸的侧链上的官能团被适当的保 护基团保护的部分肽、以及诸如通过糖链键合得到的糖肽类等的复合肽类。
可在本发明中使用的HGF蛋白质(包括部分肽形式的蛋白质)的盐为与酸或 碱的生理学上可容许的盐。特别优选为生理学上可容许的酸加成盐。这种盐的示 例包括与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)的盐、与有机酸(例如乙酸、 甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲 酸、甲磺酸、苯磺酸)的盐。
在本发明中使用的HGF蛋白质为部分肽的形式时，此部分肽可根据已知的肽 合成方法制备，或者用适当的肽酶裂解HGF蛋白质来制备。适当的肽合成方法的 实例包括固相合成和液相合成。在可以构成HGF蛋白质的部分肽或氨基酸与残余 部分缩合，得到的产物具有保护基团时，可以通过脱去保护基团制备目标肽。已 知的缩合方法和脱去保护基团的方法包括例如M.Bodanszky和M.A.Ondetti、ペ プチド·シンセシス(PeptideSynthesis、肽合成),(IntersciencePublishers,NewYork (1966年)中记载的方法、以及Schroeder和Luebke、ザ·ペプチド(ThePeptide、 肽),AcademicPress,NewYork(1965年)中记载的方法。反应后，HGF蛋白质 中的部分肽可以通过常规的纯化方法，例如溶剂抽提、蒸馏、柱色谱法、液相色 谱法和重结晶的组合进行纯化分离。通过上述方法得到的部分肽为游离酸或碱时， 可以用已知方法转化为适当的盐。相反地，以盐的形式得到时，可以用已知方法 转化为适当的游离酸或碱。
在本发明中使用的HGF蛋白质适用于人时优选使用来源于人的HGF蛋白质， 也可使用来源于人以外的哺乳动物的HGF蛋白质。来源于大鼠的适当的HGF蛋 白质的实例为序列号3所示的蛋白质。
本发明的治疗剂，即脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂可用于伴随有脊髓 损伤或脱髓鞘的所有神经疾病。具体实例包括多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎、 Balo同心圆性硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、希尔德(Schilder)病、亚 急性硬化性全脑炎(SSPE)、进行性多灶性白质脑病(PML)、宾斯旺格病、 缺氧性脑病、脑桥中央髓鞘溶解、格-巴二氏综合征、费希尔综合征和慢性炎症性 脱髓鞘性多发性神经根神经病(CIDP)。还包括伴随有脱髓鞘的脊髓损伤。
本发明的治疗剂(脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂)不仅可用于人，还 可用于人以外的哺乳动物(例如猴、母牛、马、猪、绵羊、狗和猫)。
将本发明的治疗剂(脊髓损伤治疗剂和脱髓鞘疾病治疗剂)给予患者或患畜 时，它们可以以任何一种剂型制备，例如液体制剂和固体制剂。通常，HGF蛋白 质自身或与常规载体一起例如以注射剂、喷雾剂或缓释制剂(例如，长效制剂(depot preparation))的形式制备。注射剂可为水性注射剂或油溶注射剂。如果注射剂为 水性注射剂，则可根据已知方法进行制备，例如通过将HGF蛋白质溶解在通过适 当添加可药用的添加剂到水性溶剂(例如，注射用水、纯化水)中得到的溶液中， 然后用过滤器等进行过滤将其灭菌，然后填充到无菌容器内来制备，可药用的添 加剂例如为等渗剂(例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、硼砂、 葡萄糖、丙二醇)、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、 碳酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液、谷氨酸盐缓 冲液、ε-氨基己酸盐缓冲液)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙 酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯代丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱 氢乙酸钠、乙二胺四乙酸钠、硼酸、硼砂)、增稠剂(例如羟乙基纤维素、羟丙 基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇)、稳定剂(例如亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙 二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯)、pH调节剂(例如盐酸、 氢氧化钠、磷酸、乙酸)。还可使用适当的溶解助剂，例如醇(例如乙醇)、多 元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)或非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯80、聚 氧乙烯氢化蓖麻油50)。如果注射剂为油溶注射剂，则可使用芝麻油或豆油作为 油质溶剂，且可使用苯甲酸苄酯或苯甲醇作为溶解助剂。已制备的注射剂通常填 充到安瓿或西林瓶中。注射剂中的HGF蛋白质含量通常调节为约0.0002～约 2.0w/v％，优选为约0.001～约1.0w/v％，更优选为约0.01～约0.5w/v％。而且，对 于诸如注射剂等液体制剂，优选通过冷冻进行保存或在通过冷冻干燥等除去水分 后进行保存。冷冻干燥制剂在使用时，添加注射用蒸馏水等，并再溶解来使用。
喷雾剂也可通过制剂上的常规方法制备。作为喷雾剂进行制备的情况下，可 使用通常在吸入用制剂中使用的添加剂。例如，除了抛射剂以外，可使用上述溶 剂、防腐剂、稳定剂、等渗剂和pH调节剂。可使用的抛射剂包括液化气体抛射剂 和压缩气体。液化气体抛射剂的实例包括氟化烃(例如HCFC22、HCFC-123、 HCFC-134a和HCFC-142等氟碳化合物(CFC)的替代物)、液化石油和二甲醚。 压缩气体的示例包括可溶性气体(例如二氧化碳、一氧化二氮)和不溶性气体(例 如氮气)。
在本发明中使用的HGF蛋白质可与生物可降解聚合物一起制备为缓释制剂 (例如长效制剂)。特别是制备作为长效制剂的HGF蛋白质时，可以期待许多期 望效果，例如给药次数的减少、治疗效果良好的持续时间和副作用降低。这种缓 释制剂可用已知方法制备。在此缓释制剂中使用的生物可降解聚合物可从以下已 知的生物可降解聚合物中适当选择：例如包括淀粉、葡聚糖、透明质烷(透明质 酸)及其盐等多糖类；例如端胶原、胶原和明胶等蛋白质；例如聚谷氨酸、聚赖 氨酸、聚亮氨酸、聚丙氨酸和聚蛋氨酸等聚氨基酸；聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙 醇酸共聚物、聚己酸内酯、聚-β-羟基丁酸和聚苹果酸；例如富马酸-聚乙二醇-乙烯 基吡咯烷酮共聚物等聚酯和聚原酸酯；例如聚甲基-α-氰基丙烯酸等聚烷基氰基丙 烯酸；例如聚碳酸乙二醇酯和聚碳酸丙二醇酯等聚碳酸酯。优选为聚酯，特别优 选为乳酸-乙醇酸共聚物。使用乳酸-乙醇酸共聚物时，其组成比(乳酸/乙醇酸) (摩尔％)根据预期的缓释时间变化而变化。例如，对于约2周～约3个月、优选 约2周～约1个月的缓释时间，组成比为约100/0～约50/50。该乳酸-乙醇酸共聚 物的重均分子量通常为约5,000～约20,000。乳酸-乙醇酸共聚物可用已知的制备方 法，例如日本特开昭61-28521号公报中记载的制备方法进行制备。生物可降解聚 合物与HGF蛋白质的配比没有任何特别限制。例如，HGF蛋白质与生物可降解聚 合物的配比通常为约0.01～约30w/w％。
在注射剂或喷雾剂的情况下，给药优选通过直接注射(例如鞘内给药、通过 缓释泵进行的鞘内连续给药)或喷雾到受脊髓损伤或脱髓鞘疾病影响的组织，或 者在缓释制剂(长效制剂)的情况下，给药优选植入到受脊髓损伤或脱髓鞘疾病 影响的组织附近的部位。给药量可根据剂型、疾病的程度、患者年龄等因素适当 地选择，通常每1次给予1μg～500mg，优选为10μg～50mg。给药方法也可根据 剂型、疾病的程度、患者年龄和其它因素适当地选择。例如，治疗剂可单次一次 性给药，单次在约30分钟～约几周的时间内(优选在约24小时～2周的时间内) 持续给药。或者，上述一次性给药或持续给药可在间隔周期内重复给药。重复给 药时，给药间隔可以为每天一次～几个月一次。例如，在作为缓释制剂(长效制 剂)给药时，或者在通过缓释泵(例如渗透泵)进行局部(例如鞘内)持续给药 时，给药间隔可以为几周～几个月一次。这种持续给药的优点在于，因为HGF蛋 白质长期逐渐地释放到脊髓损伤或脱髓鞘疾病的部位，所以HGF长期发挥作用， 能够得到更好的治疗效果。进一步的优点在于，由于给药次数少，减轻对患者的 负担。更进一步的优点在于，根据需要，可以将HGF蛋白质追加给予到皮下植入 的渗透泵。如上所述，作为给药方法优选为局部给药，但是也可以为诸如肌内给 药、皮下给药或点滴注射等其它给药方法。给药时间可根据剂型、疾病的程度、 患者年龄等因素适当地选择。例如，脊髓损伤的情况下，优选在刚损伤后14天内， 更优选在7天内，最优选在4天内进行给药。特别是对于脊髓损伤患者，考虑到 患者的状态在受伤后72小时内难以稳定，特别优选在刚损伤后约72小时～4天内 给药。上述给药时间包括持续给药时的给药开始时，或重复给药时的初次给药时。
实施例
以下使用实施例对本发明进行说明，但是本发明不被这些实施例所限定。在 以下的实施例中使用的HGF蛋白质为5个氨基酸缺失型重组HGF蛋白质(序列 号2)。
[实施例1]
(脊髓损伤动物的制备和HGF蛋白质的给药)
(1)脊髓损伤动物的制备
首先，无菌准备渗透泵(OsmoticPump)。将HGF蛋白质(浓度：1mg/mL， 溶解在PBS中)或PBS(对照)注入到Alzet小型渗透泵(miniosmoticpump)(ALZA Corporation制，Model2002)中。将用HGF蛋白质或PBS充满内腔的内径为0.3mm、 外径为0.7mm的硅胶管(株式会社イマムラ制，导管)与泵排出部连接，用另一 内径为1.0mm、外径为2.0mm的硅胶管(株式会社イマムラ制)覆盖连接部，接 着在37℃下培养泵和管部件12小时，然后用于实验。
通过14w/v％的水合氯醛的腹腔内给药，将成年雌性斯普拉格-道利 (Sprague-Dawley、SD)大鼠(周龄约10～12周，体重约250g)麻醉，将第十胸 椎和第十二胸椎椎板切除。然后将渗透泵(用上述方法预先填充有HGF蛋白质溶 液)植入到右背侧皮下，导管从皮下区域通过肌肉层。之后，导管的顶端到达第 十二胸椎椎弓。然后，用IH冲击器(PrecisionSystems制)在第十胸部脊髓节段 制造200k达因(kDyne)的挤压伤。之后，在头尾向的轴的方向上使第十二胸部 脊髓的硬膜和蛛网膜一起裂开，由此将导管插入到蛛网膜下腔且导管的顶端到达 损伤脊髓点。使用外科用粘接剂アロンアルファA“三共”(三共株式会社制)将导 管固定在肌肉层的内侧和外侧。粘接剂充分干燥后，分别缝合肌肉层和皮肤，完 成手术。
(2)HGF蛋白质的给药
手术后(挤压伤后)，通过上述渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药2周(HGF 蛋白质的给药量，200μg/2周)。对照组仅给予PBS。
[实施例2]
(组织分析和结果)
在固定的手术后期间后，通过14w/v％水合氯醛的腹腔内给药对大鼠进行深度 麻醉，接着，依次用PBS、用4w/v％的多聚甲醛/PBS从心脏的左心室进行灌注。 取出脊髓断片，随后在4℃下固定在4w/v％的多聚甲醛/PBS中24小时。将组织样 品在4℃下先后浸渍在10w/v％的蔗糖/PBS溶液和30w/v％的蔗糖/PBS溶液各24 小时，之后植入到OCT复合物(サクラファインテクニカル社)中。立即在液氮 中冷冻植入的组织，制备20μm的冷冻切片。然后，用苏木精和曙红(HE)对组 织切片进行染色，进行组织检查。其结果如图1所示，与对照组相比，在HGF蛋 白质组中，由于运动神经的退化和细胞死亡引起的的腔形成得到显著抑制，由此 表明，挤压引起的脊髓退化得到抑制。
[实施例3]
(髓鞘染色和结果)
用95v/v％乙醇处理通过实施例2记载的方法制备的切片，之后，在60℃下， 于勒克司坚牢蓝(LuxorFastBlue、LFB)溶液中培养2小时。从培养器取出后， 放置切片直至冷却至室温，用95v/v％乙醇和蒸馏水进行洗涤。然后，重复进行用 碳酸锂溶液和70v/v％乙醇进行的分馏以及用蒸馏水进行的洗涤，直至得到适当的 对照，之后，将切片脱水、密封，并观察髓鞘。如图2所示，与对照组相比，在 HGF蛋白质组中的LFB-阳性髓鞘表面积大，表明由于脊髓损伤引起的脱髓鞘得到 抑制。
[实施例4]
(免疫组织化学分析和结果)
用多克隆5HT抗体(1:100稀释)和多克隆抗-GAP43抗体(1:1000稀释)对 通过实施例2记载的方法制备的切片进行染色。即，在室温下用含有5v/v％山羊血 清和0.1w/v％曲通(Triton)X-100的PBS封闭1小时后，在4℃下，于上述抗体 溶液中培养切片一整夜。用PBS洗涤这些切片，然后在室温下，于用Alexa488(绿) 和Alexa546(红(1:1000稀释))进行荧光标记的二次抗体内培养1小时，密封 到载玻片上，在荧光显微镜下观察5HT阳性神经纤维和GAP43阳性神经纤维。其 结果如图3所示发现，与对照组相比，在HGF蛋白质组中，5HT阳性神经纤维在 距离损伤部位4mm尾侧显著多。而且，如图4所示，在5HT阳性信号与GAP43 阳性信号的局部具有良好的一致性。5HT阳性神经纤维负责脊髓损伤后的运动机 能以及GAP43在成体中仅在再生神经纤维中表达，表明通过HGF蛋白质的给药 使与运动机能相关的神经纤维的再生得到促进。
[实施例5]
(运动机能评价和结果)
通过旷场试验观察通过实施例1记载的方法刚产生脊髓损伤后，开始用HGF 蛋白质(200μg/2周)治疗动物的运动机能。由多个观察者目视观察动物的行为， 用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分系统进行评价，其中以0(完全瘫痪)～ 21(正常)的21等级评价运动机能。手术后6周评价后肢运动机能。结果如图5 所示。
由图5明显可知，在HGF蛋白质组中，脊髓损伤4天后开始观察到机能恢复， 与5周后观察到的对照组相比，具有显著的机能恢复效果(p＜0.05)。
[实施例6]
以与实施例1同样的方法制备脊髓损伤动物，随后进行充满有HGF蛋白质 (2mg/mL，溶解于PBS中)或PBS(对照)的渗透泵的植入和导管的插入。手术 后(挤压伤后)，通过渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药4周(HGF蛋白质的给 药量，400μg/4周)。对照组仅给予PBS。直至手术后9周通过实施例5所述的方 法进行运动机能评价。其结果如图6所示。
由图6明显可知，与对照动物相比，用HGF蛋白质治疗的动物的机能恢复明 显得到改善。自脊髓损伤4天后明显不同。而且，甚至在HGF蛋白质给药结束后， BBB评分还持续升高。
[实施例7]
通过14w/v％的水合氯醛的腹腔内给药，将成年雌性斯普拉格-道利 (Sprague-Dawley、SD)大鼠(周龄约10～12周，体重约250g)麻醉，用IH冲 击器(PrecisionSystems制)在第十胸部脊髓节段制造200k达因的挤压伤，由此 提供脊髓损伤动物。为了植入渗透泵，在挤压伤后4天、2周或8周对脊髓损伤动 物进行再手术。通过与实施例1相同的方法皮下植入充满有HGF蛋白质(2mg/mL， 溶解于PBS中)或PBS(对照)的渗透泵，将导管插入到蛛网膜下腔，然后导管 的顶端到达受损脊髓点，最终固定导管。在挤压伤后4天、2周或8周开始，通过 渗透泵将HGF蛋白质溶液鞘内给药4周(HGF蛋白质的给药量，400μg/4周)。 对照组仅给予PBS。通过与实施例5相同的方法随时间变化对运动机能进行评价。 其结果如图7、图8和图所示。
由图7明显可知，在挤压伤后4天开始进行HGF治疗的动物组中，观察到机 能恢复比对照组动物快。
由图8明显可知，与对照组相比，在挤压伤后2周开始进行HGF治疗的动物 组中，观察到在开始HGF治疗2周后(挤压伤4周后)机能恢复的促进效果。
由图9明显可知，在挤压伤后8周开始进行HGF治疗的动物组中，观察到给 予HGF蛋白质的动物与对照动物之间的机能恢复没有差异。
[制剂实施例1]
将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，重均分子量＝10,000，和光纯药工 业株式会社制)1.9g溶解在3.0mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添 加HGF蛋白质冷冻干燥粉末100mg，使用混合磨(株式会社レッチェ)精细研磨， 由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL 中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸 发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水 洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃ 下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的 配比：5.3w/w％)。
[制剂实施例2]
将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，重均分子量＝10,000，和光纯药工 业株式会社制)1.89g和氧化锌10mg溶解在3.0mL的二氯甲烷中。接着，向该有 机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末100mg，使用混合磨(株式会社レッ チェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚 乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌 3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微 囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除 去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF 相对于生物高分子的配比：5.3w/w％)。
[制剂实施例3]
将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝15,000，和光纯药工 业株式会社制)1.7g溶解在2.7mL的二氯甲烷中。接着，向该有机溶剂溶液中添 加HGF蛋白质冷冻干燥粉末300mg，使用混合磨(株式会社レッチェ)精细研磨， 由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚乙烯醇水溶液800mL 中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌3小时使二氯甲烷蒸 发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微囊用400mL蒸馏水 洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除去残留溶剂，在40℃ 下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF相对于生物高分子的 配比：17.6w/w％)。
[制剂实施例4]
将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝15,000，和光纯药工 业株式会社制)1.69g和氧化锌10mg溶解在2.7mL的二氯甲烷中。接着，向该有 机溶剂溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末300mg，使用混合磨(株式会社レッ チェ)精细研磨，由此制备HGF蛋白质分散液。将该分散液添加到0.1w/v％的聚 乙烯醇水溶液800mL中，然后使用均相混合机进行搅拌、均质化。在室温下搅拌 3小时使二氯甲烷蒸发，之后，通过离心分离(约2,000rpm)收集微囊。然后将微 囊用400mL蒸馏水洗涤两次后，加入D-甘露糖醇0.2g并进行冷冻干燥。为了除 去残留溶剂，在40℃下真空干燥3天，由此得到含HGF蛋白质的缓释微囊(HGF 相对于生物高分子的配比：17.8w/w％)。
[制剂实施例5]
将DL-乳酸聚合物(乳酸/乙醇酸＝100/0，重均分子量＝5,000，和光纯药工业株 式会社制)5g溶解在50mL的二氯甲烷中，由此制备10w/v％的溶液。接着，向该 溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末2.5mg。然后将制得的混合物加入另外加热 至40℃的0.5w/v％壳聚糖水溶液中，之后，使用均相混合机在1000rpm的搅拌速 度下搅拌使其乳化。得到的乳液在室温下进行再搅拌3小时以使二氯甲烷蒸发， 之后，收集通过离心分离(约2,000rpm)生成的微球体。将该微球体使用预先加 热至40℃的蒸馏水洗涤5次，然后在室温下真空干燥，由此得到含HGF蛋白质的 微球体(HGF相对于生物高分子的配比：0.05w/w％)。
[制剂实施例6]
将乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝75/25，重均分子量＝5,000，和光纯药工 业株式会社制)10g溶解在200mL的二氯甲烷/乙醇(4:1)中，由此制备5w/v％的 溶液。接着，向该溶液中添加HGF蛋白质冷冻干燥粉末2.5mg。使用均相混合机 在500rpm的速度下搅拌，将制得的混合物每次少量地加入另外加热至40℃的 1w/v％明胶水溶液中，由此实现乳化。对得到的乳液在室温下进行再搅拌3小时以 使二氯甲烷和乙醇蒸发，之后，收集通过离心分离(约2,000rpm)生成的微球体。 将该微球体使用预先加热至40℃的蒸馏水洗涤5次，在室温下真空干燥，由此得 到含HGF蛋白质的微球体(HGF相对于生物高分子的配比：0.025w/w％)。
[制剂实施例7]
将2w/v％的HGF蛋白质水溶液0.2mL与2％端胶原的磷酸盐缓冲剂溶液2mL 混合，进行冷冻干燥。使用液氮、将冷冻干燥材料在低温下粉碎后，放入模具内 进行压缩成型以得到圆柱状的含HGF的缓释制剂(HGF相对于生物高分子的配比： 10w/w％)。
[制剂实施例8]
将0.01w/v％的HGF蛋白质水溶液100mL与2w/v％胶原水溶液50g均匀地混 合搅拌，然后进行冷冻干燥。使用液氮、将冷冻干燥材料在低温下粉碎后，粉碎 的材料被压缩成型为棒状，由此得到含HGF的缓释制剂(HGF相对于生物高分子 的配比：1w/w％)。
[制剂实施例9]
将HGF蛋白质1mg溶解在2mL的2w/v％端胶原溶液中后，进行冷冻干燥。 将得到的复合体粉碎后，压缩成型为圆柱状，得到含HGF的缓释制剂(HGF相对 于生物高分子的配比：2.5质量％)。
[制剂实施例10]
透明质烷的钠盐(特性粘度4500cc/g)0.58g与20mL的水混合，使其溶胀。 接着，向该混合物中加入2mL的2N氢氧化钠，进行搅拌以形成均匀的溶液。然 后加入2.4mL水中的二乙烯基砜0.10g并进行搅拌。将制得的混合物放置70分钟， 之后，将得到的凝胶放入223mL的BioTris缓冲液(含0.15M的NaCl且pH约为 7.2的磷酸盐缓冲液)，使其溶胀3小时。接着，向该混合物中加入1mL的2NHCl。 1小时后，加入0.6mL的2NHCl，将该混合物放置16小时。随后加入0.35mL的 2NHCl，之后，在缓冲液中缓慢地搅拌溶胀的凝胶3天。得到具有均匀的粘弹性 的软凝胶。该凝胶用0.15M的NaCl透析5天。然后，将该凝胶与缓冲盐水中的 1w/v％的HGF蛋白质混合，将HGF蛋白质的最终浓度调整为0.25w/v％，由此得 到含HGF的制剂(HGF相对于生物高分子的配比：2.5w/w％)。
产业上的可利用性
本发明提供对脊髓损伤和脱髓鞘疾病的治疗有用的药剂。