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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511000682.7 (22)申请日 2015.12.29 A61K 47/42(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61K 47/32(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/12(2006.01) A61K 39/187(2006.01) (71)申请人 瑞普 （保定） 生物药业有限公司 地址 071000 河北省保定市工业园区腾飞路 793 号 (72)发明人 何平有 邹立宏 刘涛 柳珊 韩佳丽 郑朝朝 郁宏伟 朱秀同 梁武 杨保收 (74)专利代理机构 石家庄冀科专。
2、利商标事务所 有限公司 13108 代理人 马世敏 (54) 发明名称 一种耐热保护剂、 猪瘟耐热保护剂活疫苗及 其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种耐热保护剂、 猪瘟耐热保 护剂活疫苗及其制备方法， 属于生物技术领域。 一 种耐热保护剂， 组方成分包括蔗糖1015%， 聚乙 烯吡咯烷酮 2 6%， 聚赖氨酸 2 4%， 酶解明胶 0.53%， 柠檬酸钠 0.2 1%， 硫脲 2 10%， 牛血 清白蛋白 2 6%， 芦布若尔 1 4%， 余量为水 ； 将 半成品病毒液与耐热保护剂混合， 冷冻干燥， 制成 猪瘟耐热保护剂活疫苗。本发明通过添加耐热保 护剂， 降低了病毒在冷冻和真空干燥过。
3、程中损伤， 提高了产品在保存和使用中的稳定性 ； 本发明方 法制备的猪瘟耐热保护剂活疫苗， 实现了储运过 程中冷藏保存， 保存期延长到 2 8保存 36 个 月。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105535987 A 2016.05.04 CN 105535987 A 1.一种耐热保护剂， 其特征在于， 是由以质量体积百分含量计的下列组分制成： 蔗糖1015%， 聚乙烯吡咯烷酮26%， 聚赖氨酸24%， 酶解明胶0.53%， 柠檬酸钠0.2 1%， 硫脲210%， 牛血清白蛋白26%， 芦布若尔14%， 余。
4、量为水。 2.根据权利要求1所述的耐热保护剂， 其特征在于， 所述耐热保护剂分为保护剂A和保 护剂B， 所述保护剂A是将蔗糖、 聚乙烯吡咯烷酮、 酶解明胶和芦布若尔溶解于水中， 除菌后 备用； 所述保护剂B是将聚赖氨酸、 柠檬酸钠、 硫脲、 牛血清白蛋白溶解于水中， 除菌后备用。 3.一种猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 其特征在于， 使用如权利要求2所述的耐热 保护剂， 并按以下步骤制备： a.病毒储存液制备： 将新鲜的制苗用脾淋组织半成品在210下捣碎至匀浆， 用稀释 液稀释匀浆， 匀浆与稀释液的质量体积比为1： 1， 将稀释的匀浆与部分保护剂B按体积比4： 1 4： 2混合， 混合液于2。
5、8的条件下放置分层， 下层液体为病毒储存液， 将病毒储存液分 装， 置-15以下保存； b.疫苗制备： 将病毒储存液室温放置， 至完全融化， 用稀释液将病毒储存液稀释14 倍， 然后按稀释的病毒液与耐热保护剂体积比1： 1加入保护剂A和剩余的保护剂B， 充分混 匀， 定量分装， 冷冻干燥， 制成猪瘟耐热保护剂活疫苗。 4.一种猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 其特征在于， 使用如权利要求2所述的耐热 保护剂， 并按以下步骤制备： a.病毒储存液制备： 将猪瘟细胞毒半成品病毒液与部分保护剂B按体积比4： 14： 2混 合， 制成病毒储存液， 置-15以下保存； b.疫苗制备： 将病毒储存液室温放。
6、置， 至完全融化， 用稀释液将病毒储存液稀释至10万 100万RID/ml， 然后按稀释的病毒液与耐热保护剂体积比1： 1加入保护剂A和剩余的保护 剂B， 充分混匀后， 进行定量分装， 冷冻干燥， 制成猪瘟耐热保护剂活疫苗。 5.根据权利要求3或4所述的猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 其特征在于， 所述稀 释液为乳汉液、 汉克氏液或PBS液。 6.一种猪瘟耐热保护剂活疫苗， 其特征在于， 它按照权利要求3或4所述的方法生产的 猪瘟耐热保护剂活疫苗。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105535987 A 2 一种耐热保护剂、 猪瘟耐热保护剂活疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本。
7、发明涉及一种耐热保护剂、 猪瘟耐热保护剂活疫苗及其制备方法， 属于生物技 术领域。 背景技术 0002 猪瘟俗称“烂肠瘟“， 是一种具有高度传染性的疫病， 其特征是急性呈败血性变化， 实质器官出血， 坏死和梗死； 慢性呈纤维素性坏死性肠炎。 猪瘟是威胁养猪业的主要传染病 之一， 一年四季都可发生， 常给养猪业造成毁灭性损失， 预防猪瘟最有效的方法就是接种猪 瘟疫苗。 0003 市场上常用的猪瘟疫苗主要有两种： 猪瘟细胞苗和猪瘟脾淋苗。 这两种疫苗在储 运时均需在-15的条件下冷冻保存， 在使用的终端很难达到保存条件的要求， 疫苗容易失 活， 造成免疫效果参差不齐， 从而引起免疫失败导致疫病爆发。
8、。 其中猪瘟脾淋苗还存在高温 季节生产技术难度大、 半成品保存期短 （-15以下保存仅有15日） 和溶解不佳等问题。 因 此， 研发一种半成品保存期长、 保护功能强的猪瘟活疫苗耐热冻干保护技术显得尤为重要。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷， 提供一种耐热保护剂、 猪瘟 耐热保护剂活疫苗及其制备方法， 添加耐热保护剂的猪瘟活疫苗具有耐热性能好、 保护功 能强的特点。 0005 本发明的目的通过以下技术方案实现的： 一种耐热保护剂， 是由以质量体积百分含量计的下列组分制成： 蔗糖1015%， 聚乙烯吡咯烷酮26%， 聚赖氨酸24%， 酶解明胶0.53%， 柠檬酸钠。
9、0.2 1%， 硫脲210%， 牛血清白蛋白26%， 芦布若尔14%， 余量为水。 0006 上述耐热保护剂， 所述耐热保护剂分为保护剂A和保护剂B， 所述保护剂A是将蔗 糖、 聚乙烯吡咯烷酮、 酶解明胶和芦布若尔溶解于水中， 除菌后备用； 所述保护剂B是将聚赖 氨酸、 柠檬酸钠、 硫脲、 牛血清白蛋白溶解于水中， 除菌后备用。 0007 一种猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 使用如上述的耐热保护剂， 并按以下步 骤制备： a.病毒储存液制备： 将新鲜的制苗用脾淋组织半成品在210下捣碎至匀浆， 用稀释 液稀释匀浆， 匀浆与稀释液的质量体积比为1： 1， 将稀释的匀浆与部分保护剂B按体积比4：。
10、 1 4： 2混合， 混合液于28的条件下放置分层， 下层液体为病毒储存液， 将病毒储存液分 装， 置-15以下保存； b.疫苗制备： 将病毒储存液室温放置， 至完全融化， 用稀释液将病毒储存液稀释14 倍， 然后按稀释的病毒液与耐热保护剂体积比1： 1加入保护剂A和剩余的保护剂B， 充分混 匀， 定量分装， 冷冻干燥， 制成猪瘟耐热保护剂活疫苗。 0008 一种猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 使用如上述的耐热保护剂， 并按以下步 说 明 书 1/5 页 3 CN 105535987 A 3 骤制备： a.病毒储存液制备： 将猪瘟细胞毒半成品病毒液与部分保护剂B按体积比4： 14： 2混 合。
11、， 制成病毒储存液， 置-15以下保存； b.疫苗制备： 将病毒储存液室温放置， 至完全融化， 用稀释液将病毒储存液稀释至10万 100万RID/ml， 然后按稀释的病毒液与耐热保护剂体积比1： 1加入保护剂A和剩余的保护 剂B， 充分混匀后， 进行定量分装， 冷冻干燥， 制成猪瘟耐热保护剂活疫苗。 0009 上述猪瘟耐热保护剂活疫苗的制备方法， 所述稀释液为乳汉液、 汉克氏液或PBS 液。 0010 一种猪瘟耐热保护剂活疫苗， 它按照上述方法生产的猪瘟耐热保护剂活疫苗。 0011 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 本发明在半成品病毒液储存时加入保护剂, 有效延长半成品的保存期， 保。
12、证半成品病 毒在常温状态下生物活性的维持， 实现了常温直接融化疫苗半成品， 生产工序更简化， 且降 低了能耗。 0012 耐热保护剂中添加表面活性剂芦布若尔、 氨基酸聚合物聚赖氨酸， 并与酶解明胶、 聚乙烯吡咯烷酮等最适配比， 降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中损伤， 且提高了产品在 保存和使用中的稳定性。 0013 本发明方法制备的猪瘟耐热保护剂活疫苗可实现疫苗储运过程中的冷藏保存， 延 长了保存期， 由原来-15以下保存24个月提高到28保存36个月， 37保存期可达15 天， 在降低了产品储运要求和成本的同时提高产品质量和使用的便捷性。 具体实施方式 0014 下面结合具体实施方式做进一步。
13、的说明。 0015 实施例1 耐热保护剂的制备 蔗糖、 聚乙烯吡咯烷酮 （K30） 和酶解明胶等耐热保护剂组方原料均为常规试剂， 市场上 有售。 0016 （1） 配制耐热保护剂1 配制1000ml耐热保护剂， 称取蔗糖 100g、 聚乙烯吡咯烷酮 （K30） 60g、 聚赖氨酸 20g、 酶解明胶5g、 柠檬酸钠10g、 硫脲100g、 牛血清白蛋白20g 和芦布若尔10g。 配制时将蔗糖、 聚 乙烯吡咯烷酮 （K30） 、 酶解明胶、 芦布若尔加入去离子水中并定容到500ml， 充分溶解， 配成 保护剂A， 除菌后备用； 将聚赖氨酸、 柠檬酸钠、 硫脲、 牛血清白蛋白加入去离子水中并定容 。
14、到500ml， 充分溶解， 配成保护剂B， 除菌后备用。 0017 （2） 配制耐热保护剂2 配制1000ml耐热保护剂， 称取蔗糖 150g、 聚乙烯吡咯烷酮 （K30） 20g、 聚赖氨酸 40g、 酶解明胶30g、 柠檬酸钠2g、 硫脲20g、 牛血清白蛋白60g 和芦布若尔40g。 配制时将蔗糖、 聚 乙烯吡咯烷酮 （K30） 、 酶解明胶、 芦布若尔加入去离子水中并定容到500ml， 充分溶解， 配成 保护剂A， 除菌后备用； 将聚赖氨酸、 柠檬酸钠、 硫脲、 牛血清白蛋白加入去离子水中并定容 到500ml， 充分溶解， 配成保护剂B， 除菌后备用。 0018 实施例2 制备猪瘟耐热。
15、保护剂活疫苗 （猪瘟脾淋苗） 猪瘟脾淋组织半成品由瑞普 （保定） 生物药业有限公司提供， 按照2000版 中华人民共 说 明 书 2/5 页 4 CN 105535987 A 4 和国兽用生物制品规程（以下简称 “规程” ） 制备， 病毒毒种购自中国兽医药品监察所。 0019 （1） 病毒储存液的制备 将两份相同体积的新鲜的猪瘟脾淋组织半成品 （100g） ， 在210下捣碎至匀浆， 分别 用100ml汉克氏液稀释匀浆， 两份稀释的匀浆分别加入耐热保护剂1的保护剂B和耐热保护 剂2的保护剂B混合均匀， 稀释的匀浆 （200ml） 与保护剂B的体积比 （V： V） 为4： 2 （稀释的匀浆 20。
16、0ml加入保护剂B 100ml） ， 混合液置于28放置4小时， 固液分离出下层液体， 制成病毒 储存液1和病毒储存液2， 分别分装， 置-15保存。 同时设立不添加保护剂的空白对照。 将三 组病毒储存液保存0、 0.5、 2、 4和8个月时分别测定病毒含量。 测定结果如表1所示， 表1 不同保存期病毒储存液病毒含量检测结果 单位： lg(RID/ml) 组别0月0.5月2月4月8月 病毒储存液15.35.25.25.15.1 病毒储存液25.35.25.25.15.0 对照5.35.24.744 添加耐热保护剂1和耐热保护剂2的两组猪瘟病毒储存液在-15保存8个月， 病毒含量 下降仅为0.3。
17、 lg(RID/ml)， 满足 “规程” 要求 （制苗用半成品病毒含量应 5.0 lg （RID/ ml） ） ； 对照组-15保存其病毒含量迅速下降， 仅能储存0.5个月， 保存2个月病毒含量不合 格。 因此， 添加本发明的保护剂B有效延长了半成品病毒液保存期 （至8个月） ， 为生产高效价 的猪瘟脾淋苗提供保障。 0020 （2） 疫苗制备 将两种病毒储存液 （300ml） 室温放置至完全融化， 然后用汉克氏液将病毒储存液稀释2 倍 （至600ml） ， 将稀释的病毒液 （不计保护剂B体积， 即500ml） 与耐热保护剂按体积比1： 1 （V： V） 补充保护剂A （250ml） 和剩余的。
18、保护剂B （150ml） ， 充分混匀后， 定量分装， 冷冻干燥， 制成 猪瘟耐热保护剂活疫苗1和猪瘟耐热保护剂活疫苗2。 同时按照农业部443号公告 （猪瘟耐热 保护剂活疫苗 （兔源） 制造及检验试行规程、 同类耐热苗行业标准） 方法制备同类耐热苗作 为对照1； 按 “规程” 方法制备的常规苗作为对照组2。 0021 （3） 疫苗稳定性测定 检测冷藏保存的稳定性： 于冻干前、 冻干后28放置0、 6、 12、 24和36个月时随机取 样测定病毒含量， 3瓶/次。 测定结果见表2 检测37保存的稳定性： 每批取20瓶， 于37放置0、 5、 10和15天时随机取样测定病 毒含量， 3瓶/次。 。
19、测定结果见表3 表2 不同保存期猪瘟脾淋苗病毒含量检测结果 （28） 单位： RID/头 组别冻干前0月6月12月24月36月 耐热保护剂疫苗1700650600550500450 耐热保护剂疫苗2700650550500450450 对照1 （同类耐热苗）700600500450250100 对照2 （常规苗）700500300100100100 表3 不同保存期猪瘟脾淋苗病毒含量检测结果 （37） 说 明 书 3/5 页 5 CN 105535987 A 5 单位： RID/头 组别0天5天10天15天 耐热保护剂疫苗1650600550500 耐热保护剂疫苗2650600500450 对。
20、照1 （同类耐热苗）600450200100 对照2 （常规苗）500100100100 由以上结果可以看出： 采用本发明方法制备的两组猪瘟耐热保护剂活疫苗， 28条 件下保存36个月其病毒含量下降31%， 病毒含量为450 RID/头， 远高于 “规程” 要求(制苗用 半成品病毒液病毒含量应 150 RID/头)， 冷藏条件下保存期可达36个月； 对照1 （同类耐热 苗） 和对照2 （常规苗） 28条件下保存， 病毒含量下降较快， 对照1保存期为24个月、 对照2 保存期仅为6个月。 0022 本发明制备的两组猪瘟耐热保护剂活疫苗在37条件下保存15天其病毒含量下 降幅度为31%， 病毒含量。
21、远高于 “规程” 规定， 保存期可达15天； 对照1 （同类耐热苗） 和对照2 （常规苗） 37条件下保存， 病毒含量迅速下降， 对照1保存期为10天、 对照2保存期不足5天。 0023 实施例3 制备猪瘟耐热保护剂活疫苗 （猪瘟细胞苗） 猪瘟细胞毒半成品病毒液由瑞普 （保定） 生物药业有限公司提供， 按照农业部1719号公 告 （猪瘟活疫苗 （传代细胞源） 制造及检验试行规程、 行业标准） 制备， 病毒毒种购自中国兽 医药品监察所。 0024 （1） 病毒储存液的制备 将两份相同的猪瘟细胞毒半成品病毒液 （1000ml） 分别与耐热保护剂1中的保护剂B和 耐热保护剂2中的保护剂B按照体积比 。
22、（V： V） 4： 1 （加入保护剂B 250ml） 充分混匀， 制成病毒 储存液1和病毒储存液2， 置-15保存， 设立不添加保护剂的空白对照， 并于保存0、 3、 4、 6和 12个月时分别测定病毒含量。 检测结果如表4所示 表4 不同保存期病毒储存液病毒含量检测结果 单位： lg(RID/ml) 组别0月3月4月6月12月 病毒储存液16.005.955.905.855.70 病毒储存液26.005.905.855.785.70 对照6.005.704.7044 添加耐热保护剂1和耐热保护剂2两组猪瘟病毒储存液-15储存12个月， 病毒含量下 降幅度仅有0.3 lg(RID/ml)， 满。
23、足 “规程” 要求 （制苗用的半成品病毒液病毒含量应 4.7 lg(RID/ml)） ， 对照组-15保存其病毒含量迅速下降， 到6个月时其病毒含量低于 “规程” 要 求， 即为不合格产品。 因此， 本发明方法有效延长了半成品病毒液保存期 （至12个月） ， 为生 产高效价的猪瘟细胞苗生产提供保障。 0025 （2） 疫苗制备 将两组病毒储存液室温放置至完全融化， 用乳汉液 （1000 ml） 将病毒储存液稀释至50 万RID/ml （不计保护剂B体积） ， 然后按稀释的病毒液 （不计保护剂B体积， 即2000 ml） 与耐热 保护剂1： 1的体积比 （V： V） ， 在病毒储存液1中加入耐热。
24、保护剂1的保护剂A （1000 ml） 和剩余 的保护剂B （750 ml） ， 在病毒储存液2中加入耐热保护剂2的保护剂A （1000 ml） 和剩余的保 说 明 书 4/5 页 6 CN 105535987 A 6 护剂B （750 ml） ， 充分混匀后， 定量分装， 冷冻干燥， 制成猪瘟耐热保护剂活疫苗。 同时按 “规 程” 方法制备的常规苗作为对照。 0026 （3） 疫苗稳定性测定 检测冷藏保存的稳定性： 于冻干前、 冻干后28放置0、 6、 12、 24和36个月时随机取 样测定病毒含量， 3瓶/次。 测定结果见表5 检测37保存的稳定性： 每批取20瓶， 于37放置0、 5、 。
25、10和15天时随机取样测定病 毒含量， 3瓶/次。 测定结果见表6 表5 不同保存期猪瘟细胞苗病毒含量检测结果 （28） 单位： RID/头 组别冻干前0月6月12月24月36月 耐热保护剂疫苗1300002800028000240001500015000 耐热保护剂疫苗230000280002800024002000015000 对照 （常规苗）30000200007500500050005000 表6 不同保存期猪瘟细胞苗病毒含量检测结果 （37） 单位： RID/头 组别0天5天10天15天 耐热保护剂疫苗128000280002400015000 耐热保护剂疫苗228000240002。
26、000015000 对照 （常规苗）20000500050005000 由以上结果可以看出： 采用本发明方法制备的两组猪瘟耐热保护剂活疫苗， 28条 件下保存36个月其病毒含量下降46%， 高于标准要求(疫苗病毒含量应 7500 RID/头)， 保 存期可达36个月； 对照疫苗 （常规苗） 28条件下保存， 病毒含量迅速下降， 保存期仅为6 个月。 0027 本发明方法制备的两组猪瘟耐热保护剂活疫苗在37条件下保存15天其病毒含 量下降46%， 高于标准要求， 保存期可达15天； 对照疫苗 （常规苗） 37条件下保存， 病毒含量 迅速下降， 保存期不足5天。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105535987 A 7 。