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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610046461.1 (22)申请日 2016.01.22 A61K 51/10(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 103/00(2006.01) A61K 103/32(2006.01) (71)申请人 北京肿瘤医院 地址 100142 北京市海淀区阜成路 52 号 (72)发明人 杨志 朱华 张宏 沈靖 李振甫 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (54) 发明名称 。
2、核素标记 mAb109 单抗药物及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种新型的核素标记 mAb109 单 抗药物， 所述单抗药物是将单克隆抗体 mAb109 与 双功能螯合剂 NCS-Bz-DOTA 或 NCS-Bz-NOTA 偶联 后进行放射性核素标记得到的药物， 其中所述放 射性核素包括所有能与 DOTA 或 NOTA 结构配位的 放射性金属核素。本发明以具有较强的 Prx1 受 体亲和力的且具有较好研究基础的单克隆抗体 mAb109 为母体， 与双功能螯合剂进行偶联， 获得 可用于Prx1受体靶向的标记前体DOTA-mAb109或 NOTA-mAb109。并分别以不同性质的放射性核素。
3、 进行标记， 进行 Prx1 受体高表达肿瘤的诊断与治 疗。 本发明核素标记的mAb109单抗药物能够特异 性地与广泛表达在实体瘤患者体内的 Prx1 结合。 并通过各种核素的性质， 实现体内靶向分子诊疗 的目的， 以达到实体肿瘤早发现、 早诊断、 早治疗 的目标。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105617413 A 2016.06.01 CN 105617413 A 1.核素标记mAb109单抗药物， 其特征在于， 所述单抗药物是将单克隆抗体mAb109与双 功能螯合剂NCS-Bz-DOTA或。
4、NCS-Bz-NOTA偶联后进行放射性核素标记得到的药物； 其中所述放射性核素包括正电子诊断核素和负电子治疗核素， 所述正电子诊断核素包 括64Cu、 68Ga、89Zr中的至少一种， 所述负电子治疗核素包括90Y和/或177Lu。 2.权利要求1所述单抗药物在制备PET/CT分子诊断显像剂中的应用。 3.权利要求1所述单抗药物在制备肿瘤靶向药物中的应用。 4.权利要求1所述单抗药物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)向浓度为2-5mg/ml的mAb109单抗溶液中加入相当于单抗2-10倍摩尔当量的NCS-Bz- DOTA或NCS-Bz-NOTA， 用去离子化处理的0.1M碳酸氢钠。
5、溶液调节反应体系的pH值至8.0- 9.0， 在4-37条件下反应4-24h， 得到标记前体DOTA-mAb109或NOTA-mAb109； 2)当放射性核素为正电子诊断核素时， 向10-50 g标记前体中加入400-740MBq新鲜配 制的64Cu、 68Ga或89Zr淋洗液， 然后用0.1M醋酸钠溶液调至pH4.0-5.5， 22-90反应10- 50min， 反应结束后， 反应液经PD-10柱分离纯化， 即得； 3)当放射性核素为负电子治疗核素时， 向10-50 g标记前体中依次加入0.1M pH5.5的 醋酸钠溶液0.2-1.0mL， 400-4000MBq新鲜配制的90Y或177Lu。
6、淋洗液， 22-90反应10- 50min， 反应结束后， 反应液经PD-10柱分离纯化， 即得。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤1)中用去离子化处理的， 0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制mAb109单抗溶液； 所述去离子化处理的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液的制备方法为： 向0.01M pH7.4的磷 酸盐缓冲液中加入Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入24h后， 即得。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤1)中所述去离子化处理的0.1M碳酸氢 钠溶液的制备方法为： 向0.1M碳酸氢钠溶液中加入Chel。
7、ex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入24h后， 即得去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所得单抗药物经Radio-HPLC分析， 放化纯 度98。 8.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤2)和3)中所述淋洗液用磷酸盐缓冲液 配制。 9.根据权利要求4-8任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤2)和3)中PD-10柱使用前用 磷酸盐缓冲液淋洗， 然后将所得反应液加入到PD-10柱中， 先以2.5mL磷酸盐缓冲液淋洗除 杂， 然后以2.0mL磷酸盐缓冲液洗脱， 收集洗脱液。 10.根据权利要求9所述的方法， 。
8、其特征在于， 所述磷酸盐缓冲液为去离子化处理的， 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液， 其制备方法为： 向0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入 Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入24h后， 即得。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105617413 A 2 核素标记mAb109单抗药物及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及核医学领域， 具体地说， 涉及一种核素标记mAb109单抗药物及其制备 方法。 背景技术 0002 恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的最重要因素。 肿瘤的发生与周围环境有密不 可分的关系， 在有氧条件下， 电离辐射。
9、/生物体的代谢反应都会使细胞中的水分子发生电离 后， 产生大量活性氧族(Reactive Oxygen Species， ROS)， 包括H2O2、 超氧阴离子等。 活性氧 族在体内积累可以作用于细胞核DNA， 破坏生物大分子， 使脂质过氧化、 蛋白质和核酸的氧 化、 DNA双键断裂等， 进而产生严重的生物学效应， 以至于促进肿瘤的发生。 为了更好地适应 环境， 生物体在进化过程中发展形成各种抗氧化系统， 包括过氧化物酶(Cat)、 超氧化物歧 化酶(SOD)以及过氧化物还原酶(Peroxire-doxin， Prxs)等。 Prxs蛋白是新近发现的一类过 氧化物酶， 属于抗氧化蛋白超家族， 。
10、广泛存在于原核生物和真核生物中， 其催化活性和蛋白 序列与其他抗氧化剂完全不同。 大量的研究表明， Prxs蛋白具有多种生物学功能： 它通过硫 氧还蛋白还原过氧化物和超氧化物， 具有强大的抗氧化和清除自由基的作用。 此外Prxs还 具有参与细胞增殖、 分化， 增强自然杀伤细胞(natural killer cell， NK)细胞活性， 保护自 由基敏感蛋白， 调节细胞内过氧化氢浓度参与细胞信号转导及调控细胞凋亡等功能。 前期 已通过杂交瘤技术制备出对Prxs具有靶向性的单克隆抗体mAb109， 并针对该抗体的抗原性 质进行了长时间的深入研究。 通过生物质谱分析， 可以基本确定该抗体针对的抗原为。
11、Prx I 型硫氧过氧化物酶， 通过免疫组化分析证实了该抗原主要表达在肿瘤细胞的细胞膜和细胞 质中。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种新型的核素标记mAb109单抗药物。 0004 本发明的另一目的是提供所述单抗药物的制备方法。 0005 为了实现本发明目的， 本发明提供的核素标记mAb109单抗药物， 所述单抗药物是 将单克隆抗体mAb109与双功能螯合剂NCS-Bz-DOTA或NCS-Bz-NOTA偶联后进行放射性核素 标记得到的药物； 其中所述放射性核素包括所有能与DOTA或NOTA结构配位的放射性金属核 素， 比如正电子诊断核素和负电子治疗核素。 所述正电子诊断核素包括64C。
12、u、 68Ga、89Zr等中 的至少一种， 所述负电子治疗核素包括90Y和/或177Lu等。 0006 本发明还提供所述单抗药物在制备PET/CT分子诊断显像剂中的应用。 0007 本发明还提供所述单抗药物在制备肿瘤靶向药物中的应用。 0008 本发明的核素标记mAb109单抗药物的制备方法， 包括以下步骤： 0009 1)向浓度为2-5mg/ml的mAb109单抗溶液中加入相当于单抗2-10倍(优选3倍)摩尔 当量的NCS-Bz-DOTA或NCS-Bz-NOTA， 用去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液调节反应体系的 pH值至8.0-9.0， 在4-37(优选4)条件下反应4-24h(优选24。
13、h)， 得到标记前体DOTA- 说 明 书 1/4 页 3 CN 105617413 A 3 mAb109或NOTA-mAb109； 0010 2)当放射性核素为正电子诊断核素时， 向10-50 g标记前体中加入400-740MBq新 鲜配制的64Cu、 68Ga或89Zr淋洗液， 然后用0.1M醋酸钠溶液调至pH4.0-5.5， 22-90反应 10-50min， 反应结束后， 反应液经PD-10柱分离纯化， 即得； 0011 3)当放射性核素为负电子治疗核素时， 向10-50g标记前体中依次加入0.1M pH5.5的醋酸钠溶液0.2-1.0mL， 400-4000MBq新鲜配制的90Y或1。
14、77Lu淋洗液， 22-90反应 10-50min， 反应结束后， 反应液经PD-10柱分离纯化， 即得。 0012 前述的方法， 步骤1)中用去离子化处理的， 0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制 mAb109单抗溶液。 0013 前述的方法， 所得单抗药物经Radio-HPLC分析， 放化纯度98。 0014 前述的方法， 步骤2)和3)中所述淋洗液用去离子化处理的0.01M pH7.4的磷酸盐 缓冲液配制。 0015 本发明中所述去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液的制备方法为： 向0.1M碳酸氢钠 溶液中加入Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入。
15、24h后， 即得去离子化处理 的0.1M碳酸氢钠溶液。 0016 前述的方法， 步骤2)和3)中PD-10柱使用前用磷酸盐缓冲液淋洗， 然后将所得反应 液加入到PD-10柱中， 先以2.5mL磷酸盐缓冲液淋洗除杂， 然后以2.0mL磷酸盐缓冲液洗脱， 收集洗脱液。 其中， 所述磷酸盐缓冲液为去离子化处理的， 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液。 0017 本发明中所述去离子化处理的， 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液的制备方法为： 向 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入 24h后， 即得。 0018 以17。
16、7Lu-DOTA-mAb109单抗药物为例， 制备方法如下： 0019 (1)将标记前体DOTA-mAb109配制成2-10mg/mL溶液， 以N2保护后密封， 分装 0.005mL/支， 于-20下静置。 0020 (2)向标记前体中依次加入0.1M NaAc溶液(5-10 L)、 185MBq新鲜配制的177LuCl3 淋洗液， 室温反应20-30min， 即得177Lu-DOTA-mAb109。 测定标记率及放射化学纯度， 当标记 率小于90， 需用PD-10柱分离， 所得177Lu-DOTA-mAb109的放射化学纯度大于95。 0021 (3)PD-10柱使用前用磷酸盐缓冲液淋洗， 。
17、然后将所得反应液加入到PD-10柱中， 先 以2.5mL磷酸盐缓冲液淋洗除杂， 然后以磷酸盐缓冲液洗脱， 收集洗脱液， 即177Lu-DOTA- mAb109注射液。 主要放射性杂质177Lu3+将残留于PD-10柱中。 0022 上述制备的177Lu-DOTA-mAb109经SPECT显像结果表明， 177Lu-DOTA-mAb109能够准 确定位Prx1受体阳性肿瘤， 并在6-96h内人脑胶质瘤细胞种植的裸鼠中清晰可见。 177Lu- DOTA-mAb109的红外显像显示， 111In-NIRF-CCPM-RGD能够准确定位Prx1受体阳性肿瘤， 并在 6-96h内种植的胰腺癌(PANC-。
18、1)裸鼠中清晰可见。 以上结果表明， 177Lu-DOTA-mAb109可作为 一种特异性对Prx1受体高表达肿瘤分子显像剂。 0023 本发明以具有较强的Prx1受体亲和力的且具有较好研究基础的单克隆抗体 mAb109为母体， 与双功能螯合剂进行偶联， 获得可用于Prx1受体靶向的标记前体DOTA- mAb109或NOTA-mAb109。 并分别以不同性质的放射性核素进行标记， 进行Prx1受体高表达肿 瘤的诊断与治疗。 本发明核素标记的mAb109单抗药物能够特异性地与广泛表达在实体瘤患 说 明 书 2/4 页 4 CN 105617413 A 4 者体内的Prx1结合。 并通过各种核素的。
19、性质， 实现体内靶向分子诊疗的目的， 以达到实体肿 瘤早发现、 早诊断、 早治疗的目标。 附图说明 0024 图1为本发明实施例1中制备的177Lu-DOTA-mAb109单抗药物的Radio-HPLC分析结 果。 0025 图2为本发明实施例2中177Lu-DOTA-mAb109在模型动物体内的SPECT显像情况； 其 中， A表示模型动物的横断面， B表示模型动物的冠状位， C表示模型动物的矢状位。 具体实施方式 0026 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0027 以。
20、下实施例中单抗mAb109的制备方法如下： 1)通过向Balb/C小鼠腹腔注射0.5ml sigma不完全佐剂， 6天后腹腔注射约1106个可产生单抗mAb109的109细胞(109细胞由北 京肿瘤医院细胞库提供， 细胞编号BCH-601-109， 参考朱华， 李囡， 张宏， 林新峰， 李振甫， 杨 志。 111In-DOTA-mAb109单克隆抗体探针的制备及其分子显像的研究。 化学学报,2015,73 (1):36-40)； 2)109细胞在脾脏(肝脏)中产生腹水后于7-10日进行收集， 而后以饱和硫酸铵 沉淀腹水， 通过进一步的纯化， 通过SDS-PAGE验证得到单一的单抗mAb109。。
21、 mAb109单抗在使 用前过PD-10柱进行纯化， 以去离子化处理的， 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱， 通 过紫外分光光度计法测定纯化后其浓度为2-5mg/ml(相当于13.3-33.3nmol/L)， 并通过 MALDI-TOF确定其分子量为147kDa。 0028 以下实施例中使用的试剂及其制备如下： 0029 去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液， 其制备方法为： 向0.1M碳酸氢钠溶液中加入 Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加入24h后， 即得去离子化处理的0.1M碳酸 氢钠溶液。 0030 磷酸盐缓冲液为去离子化处理的， 0。
22、.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液， 其制备方法为： 向0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液中加入Chelex 100树脂， 料液比按g： mL计为1： 100， 树脂加 入24h后， 即得。 0031 淋洗液采用去离子化处理的， 0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液配制。 0032 实施例1 DOTA-mAb109的放射性核素177Lu标记 0033 177Lu标记的DOTA-mAb109单抗制备方法如下： 0034 向浓度为2-5mg/ml的mAb109单抗溶液中加入相当于单抗3倍摩尔当量的NCS-Bz- DOTA， 以去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液调节反应体系的pH值为8.5。 4条。
23、件下反应 24h， 得到标记前体DOTA-mAb109。 0035 取30 g单抗前体加入200 L 0.1M pH5.5的醋酸钠溶液中， 然后， 向其中加入100 L (约74MBq)的新鲜配制的177Lu3+淋洗液， 然后控制温度为40， 孵育30min。 以Radio-HPLC分 析其标记率60左右， 经PD-10柱分离纯化， 收集产品。 0036 PD-10柱使用前用经磷酸盐缓冲液淋洗， 然后将所得反应液加入到PD-10柱中， 先 以2.5mL磷酸盐缓冲液淋洗除杂， 然后以2.0mL磷酸盐缓冲液洗脱， 收集洗脱液， 即177Lu- 说 明 书 3/4 页 5 CN 105617413 。
24、A 5 DOTA-mAb109注射液。 主要放射性杂质177Lu3+将残留于PD-10柱中。 0037 Radio-HPLC分析放化纯度98。 HPLC分析条件： Agilent SEC-3柱； 流动相： 0.01M pH 7.4PBS溶液。 流速1.0mL/min。 目标产物的保留时间约为6.2min。 Radio-HPLC分析结果见 图1。 0038 实施例2 177Lu-DOTA-mAb109在Prx高表达荷人胰腺癌PANC-1模型动物的Nano- SPECT/CT显像实验 0039 nanoScan SPECT/CT作为当今最先进的小动物SPECT/CT成像系统之一， 其分辨率 能达到。
25、0.275mm(Micro PET设备能达到1.0mm)， 灵敏度达到10000cps/MBq。 其可以准确反映 出药物在小动物体内代谢情况。 0040 裸鼠注射前未禁食， 通过尾静脉注射18.5MBq/0.3mL的177Lu-DOTA-mAb109， 注射后 1h、 2h进行PET显像。 显像前在Summit AS-1-000-7小动物麻醉系统中经混有3异氟烷的氧 气麻醉， 显像过程中维持含1异氟烷的氧气麻醉。 PET显像结果通过Philips Gimini TF PET/CT仪系统采集， 显像时间5min。 显像结果见图2。 0041 在为静脉注射72小时后， 其在肿瘤部位表现出非常明显的。
26、富集。 另外在肝脏上也 就非常强的富集， 表现力一个单抗的性质。 该显像结果再次表明， 177Lu-DOTA-mAb109具有较 好的肿瘤特异性， 是一种潜在的肿瘤分子探针。 0042 实施例3 DOTA-mAb109的放射性核素68Ga标记 0043 68Ga标记的DOTA-mAb109单抗制备方法如下： 0044 向浓度为2-5mg/ml的mAb109单抗溶液中加入相当于单抗3倍摩尔当量的NCS-Bz- DOTA， 以去离子化处理的0.1M碳酸氢钠溶液调节反应体系的pH值为8.5。 4条件下反应 24h， 得到标记前体DOTA-mAb109。 0045 取30 g的DOTA-mAb109单。
27、抗前体， 向其中加入1.0mL(约370MBq)新鲜配制的68GaCl3 淋洗液， 然后立刻向其中加入1.0M醋酸钠溶液调至pH 4.0。 控温90， 反应10min。 以Radio- HPLC分析其标记率60左右， 经PD-10柱分离纯化， 收集产品。 0046 PD-10柱使用前用经磷酸盐缓冲液淋洗， 然后将所得反应液加入到PD-10柱中， 先 以2.5mL磷酸盐缓冲液淋洗除杂， 然后以2.0mL磷酸盐缓冲液洗脱， 收集洗脱液， 即68Ga- DOTA-mAb109注射液。 主要放射性杂质68Ga将残留于PD-10柱中。 0047 Radio-HPLC分析放化纯度98。 除此之外， 无其它放射性物质的残留。 0048 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105617413 A 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 7 CN 105617413 A 7 。