技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及绿原酸和/或其衍生 物在治疗肿瘤干细胞的药物中的应用。
背景技术
90％肿瘤引起的死亡，都是由于肿瘤复发并转移到其他关键器 官所致。肿瘤的复发和转移是由于肿瘤干细胞的存在。美国癌症研 究协会(AmericanAssociationforCancerResearch)2006年对肿瘤干 细胞给出的明确定义是：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性 肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞具有无限自我更新能力、多向分化潜 能、较高的端粒酶活性、强耐药性、抗凋亡、肿瘤组织中比例较低 和表达干细胞特异性标记物的特点。放化疗虽然可以杀灭大多数肿 瘤细胞，但是对肿瘤干细胞却没有作用，肿瘤干细胞经过增殖，最 终又可导致肿瘤复发。因此，放化疗不能清除体内的肿瘤干细胞， 而只要体内有肿瘤干细胞的存在，肿瘤就有可能复发和转移。
目前临床大多数的抗肿瘤药物主要作用于分化的肿瘤细胞，而 不是肿瘤干细胞，所以肿瘤干细胞被看做是肿瘤多药耐药性、复发 和转移的罪魁祸首，肿瘤干细胞成为目前国际上肿瘤研究的热点， 成为肿瘤治疗的新靶点，为肿瘤治疗带来新希望。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供绿原酸和/或其衍生 物在治疗肿瘤干细胞的药物中的应用，以使药物能够抑制和杀灭肿 瘤干细胞，有效地防止肿瘤的复发、转移以及多药耐药性的产生。
本发明提供了绿原酸和/或其衍生物的新用途，其技术方案为：
绿原酸和/或其衍生物在治疗肿瘤干细胞的药物中的应用。
进一步，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞、胃癌干细胞、肺癌干 细胞、肾癌干细胞、结肠癌干细胞、乳腺癌干细胞、急性髓系白血 病干细胞和急变期慢性髓系白血病干细胞。
脑肿瘤干细胞、肝癌干细胞、胃癌干细胞、肺癌干细胞、肾癌 干细胞、结肠癌干细胞、乳腺癌干细胞、急性髓系白血病干细胞和 急变期慢性髓系白血病干细胞属于不同的肿瘤干细胞，因每种肿瘤 干细胞的功能不同，其内部的信号通路、表面的识别蛋白及与靶点 是不同的，因此，绿原酸能否分别作用于脑肿瘤干细胞、肝癌干细 胞、胃癌干细胞、肺癌干细胞、肾癌干细胞、结肠癌干细胞、乳腺 癌干细胞、急性髓系白血病干细胞和急变期慢性髓系白血病干细胞 的相应靶点，其对相应的肿瘤干细胞起到抑制效果也是不可预测的。
本发明经过研究发现，绿原酸不仅能够作用于脑肿瘤干细胞， 也能够作用于肝癌干细胞、胃癌干细胞、肺癌干细胞、肾癌干细胞、 结肠癌干细胞、乳腺癌干细胞、急性髓系白血病干细胞和急变期慢 性髓系白血病干细胞的相应靶点，能够抑制和杀灭这些肿瘤干细胞， 防止这些肿瘤的复发、转移以及多药耐药性的产生。
进一步，所述绿原酸衍生物包括药学上可接受的绿原酸盐以及 化学合成的衍生物。
进一步，所述绿原酸盐包括绿原酸钠盐、绿原酸钾盐和绿原酸 钙盐。
本发明中，所述药物是具有抑制肿瘤干细胞增殖，下调肿瘤干 细胞比例，减弱肿瘤干细胞自我更新能力的功效的药物。
上述药物中的活性成分为绿原酸和/或其衍生物，因此，该药物 具有抑制肿瘤干细胞增殖，减少肿瘤干细胞数目，下调肿瘤干细胞 比例，减弱肿瘤干细胞自我更新能力的功效。
进一步，所述药物中含有绿原酸和/或其衍生物以及药用辅料。
进一步，所述药物为联合药物，所述药物中还含有现有的抗肿 瘤药物。
上述药物中可以采用绿原酸和/或其衍生物作用活性成分，也可 以将绿原酸和/或其衍生物与现有的抗肿瘤药物组合作为联合药物 而使该药物具有更好的治疗效果。
进一步，所述现有的抗肿瘤药物为阿霉素。
进一步，所述药物的每制剂单位中含有绿原酸和/或其衍生物 1～1000mg。
优选地，所述药物的每制剂单位中含有绿原酸和/或其衍生物 500mg。
进一步，所述药物的剂型为口服制剂或者注射制剂。
本发明的有益效果：
本发明所提供的绿原酸和/或其衍生物在治疗肿瘤干细胞的药 物中的应用，为绿原酸提供了一种新用途，通过将绿原酸应用于治 疗肿瘤干细胞的药物中，使药物能够抑制和杀灭肿瘤干细胞，有效 地防止肿瘤的复发、转移以及多药耐药性的产生。
附图说明
图1为实施例1中所述的细胞株H460的肿瘤球形成实验的结果 图；
图2为实施例1中所述的细胞株H466的肿瘤球形成实验的结果 图；
图3为实施例1中所述的侧群细胞(SP)检测的结果图；
图4为实施例2中所述的药物干预后微球体培养结果图；
图5为实施例2中所述的药物干预后微球体细胞中CD44+CD24 ﹣/low细胞比例的变化结果图；
图6为实施例2中所述的药物干预后微球体细胞中侧群细胞 (SP)的检测结果图；
图7为实施例2中所述的药物干预后微球体细胞中MDR1、BCRP 的mRNA表达的差异图。
具体实施方式
实施例1
绿原酸对肺癌干细胞生长的影响
肿瘤球形成实验：常规培养的人肺癌细胞株H460和H466的细 胞分别经胰酶消化后以1000rpm的离心速度离心2min，弃上清后加 入3ml无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，轻柔吹散、洗涤细胞沉淀并离 心。反复洗涤3次后加入肿瘤球培养基(无血清培养基)，制备成 单细胞悬液。
测定制备的细胞株H460的单细胞悬液的细胞浓度并调整细胞 密度为1500cells/ml，将单细胞悬液均匀地转移到超低粘附的6孔板 内，并分别设立A、B、C和D组进行肿瘤球培养；测定制备的细胞 株H466的单细胞悬液的细胞浓度并调整细胞密度为1500cells/ml， 将单细胞悬液均匀地转移到超低粘附的6孔板内，并分别设立A、B、 C和D组进行肿瘤球培养。其中，A组均为空白组，选用生理盐水 处理；B组均选用浓度为1μMol/L的绿原酸处理；C组均选用浓度 为2μMol/L的绿原酸处理；D组均选用浓度为3μMol/L的绿原酸 处理。每3天更换培养液1次，7天后观察肿瘤球形成情况。
根据肺癌干细胞能在无血清培养基中生长并形成微球的特性， 这些微球由少数肿瘤干细胞自我更新形成，因此，通过检测微球形 成体积，可以标示肿瘤干细胞的数量而设置了上述实验。实验结果 如图1和图2所示，图1为细胞株H460的肿瘤球形成实验的结果图； 图2为细胞株H466的肿瘤球形成实验的结果图。其中B、C和D组 的肿瘤球体积均小于空白组，说明绿原酸对肺癌干细胞具有抑制作 用；同时，随着绿原酸的浓度增大，肿瘤球的体积逐渐减小，说明 随着绿原酸的浓度的增大，其对肿瘤干细胞的抑制作用越强，可以 有效地减少肺癌干细胞的数量。
侧群细胞检测(SP)：将肺癌细胞株H460细胞分为三组，编 号为A、B和C。A组为空白组，采用生理盐水孵育3天；B组和C 组分别采用浓度为1μMol/L和3μMol/L的绿原酸孵育3天。3天后， 将A、B和C组的细胞弃去培养液，4℃的PBS冲洗，再经胰酶-EDTA 消化并以2％胎牛血清1640培养基重悬为单细胞悬液，计数并调整 细胞密度为1×105cells/ml。细胞加入适当浓度的Hoechst33342，在 37℃缓慢旋转孵育90min后于4℃离心5min，并以预冷PBS重悬细胞。 共洗涤细胞2次。细胞保存在冰上以抑制Hoechst33342染料外流。 样品保存于冰上，直至上机检测。
SP(sidepopulation)细胞是细胞群体中极少的一部分,它们可将 进入细胞核的荧光染料排出胞外,在荧光显微镜下观察或流式细胞 检测时表现为不着色,故称为SP细胞.已发现SP细胞和干细胞具有很 多共性,且与肿瘤干细胞很相似，因此，可以通过检测SP细胞而判 断肿瘤干细胞的生长情况。
如图3所示，为侧群细胞(SP)检测的结果图。其中，B组和C 组中的SP细胞数量均小于A组，且C组SP细胞数量小于B组。因 此，说明绿原酸在较低浓度下就可对SP细胞起到抑制作用，且绿原 酸的抑制效应随着浓度的增加而增强，即绿原酸可以减少肺癌干细 胞的数量。
实施例2
绿原酸对乳腺癌肿瘤干细胞的作用
1.小鼠乳腺癌细胞系MCF-7的无血清悬浮微球体培养——富集 乳腺癌干细胞
将购进的MCF-7乳腺癌细胞常规复苏后，用含10％胎牛血清的 DMEM/F12培养基(SSM)培养，以0.25％胰酶﹣0.02％EDTA消化 细胞传代。取SSM培养的对数生长期的MCF-7细胞，用0.25％胰酶 ﹣0.02％EDTA消化并机械吹打成单细胞悬液，经台盼蓝染色并计数 后以2×104/ml接种于无血清培养基(SFM，即不含胎牛血清的 DMEM/F12培养基，添加20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF、2％B27)， 在37℃、5％CO2培养箱中静止培养，3天离心换液，当形成细胞球 后，用0.25％胰酶﹣0.02％EDTA的10倍稀释液消化成单细胞悬液重 悬于SFM中，仍以2×104/ml的浓度接种于SFM中，约6～7天传代 一次。
2.实验分组及用药
取SFM培养的第10代乳腺癌细胞球，以10倍稀释的0.25％胰酶 ﹣0.02％EDTA消化成单细胞悬液并重悬于SFM中，调整细胞密度为 5×104/ml，接种于25ml培养瓶中，每瓶2ml，共20瓶。20瓶细胞 随机分为4组，分别为空白对照组，绿原酸组、阿霉素组、绿原酸+ 阿霉素组。对照组加入生理盐水20μl，阿霉素组加入0.1mg/ml阿霉 素20μl，绿原酸组加入1mg/ml绿原酸20μl，阿霉素+绿原酸组加入 0.2mg/ml阿霉素10μl和2mg/ml绿原酸10μl。在37℃、5％CO2培 养箱中静止培养，48h离心换液，继续SFM培养。10天后观察细胞 的成球情况；收集细胞用流式细胞仪检测CD44+CD24﹣/low细胞比 例、侧群细胞(SP)；RT-PCR技术检测细胞中耐药基因MDR1和 BCRPmRNA表达。
3.各组药物作用后SFM培养的MCF-7细胞成球情况
如图4所示，为药物干预后微球体培养结果图。其中，阿霉素 组(编号C)和空白对照组(编号A)都能看到微球体的出现，在悬 浮细胞培养48h后逐渐形成细胞团，在倒置相差显微镜下可见细胞 团由几个到十几个正在分裂的新生细胞组成，随着细胞分裂，部分 细胞发生分化，并渐渐与周围细胞融合，10天后可看到明显的微球 体形成。但是绿原酸组(编号B)在第10天后，看不到明显的微球 体，新生细胞也较少。绿原酸+阿霉素组(编号D)存活细胞极少， 细胞凋亡裂解。能形成微球的细胞数量减少表示肿瘤干细胞的数量 减少，即说明其可以杀灭肿瘤干细胞，因此，说明绿原酸可以显著 抑制癌细胞的微球形成数量，即可以靶向乳腺癌细胞里的肿瘤干细 胞，抑制其形成微球，即可以抑制肿瘤干细胞；绿原酸和阿霉素一 起使用可以抑制肿瘤干细胞，同时也抑制新生细胞，从而绿原酸也 可以和阿霉素联合用药。
4.CD44+CD24﹣/low细胞的比例测定
SSM培养的MCF-7细胞及SFM条件培养的单细胞悬液，低速 离心去除细胞碎片，以PBS调整细胞密度每管1×106/100μl，实验 组加入大鼠抗小鼠CD44-PE抗体10μl和CD24-FITC抗体5μl，对 照组加入同剂量的同型对照抗体，常温避光温育，60min后用流式 细胞仪检测CD44+CD24﹣/low细胞比例，常规检测3次。
如图5所示，为药物干预后微球体细胞中CD44+CD24﹣/low细 胞比例的变化结果图。其中，空白对照组(编号A)、绿原酸组(编 号B)、阿霉素组(编号C)细胞形成的细胞球中CD44+CD24﹣/low 细胞比例分别为(71.8±1.4)％、(69.1±2.3)％、(11.8±2.7)％。 绿原酸组明显低于空白对照组和阿霉素组。阿霉素组和空白对照组 比较差异不显著。绿原酸+阿霉素组细胞太少(绿原酸和阿霉素联 合使用抑制作用较强)，未能进行CD44+CD24﹣/low细胞比例分析。 因此，从肿瘤干细胞标志物的表达上说明，绿原酸可以靶向肿瘤干 细胞，杀灭肿瘤干细胞，避免肿瘤的复发和转移。
5.侧群细胞(SP)的检测
MCF-7各组在加药培养48h后进行检测。细胞弃去培养液，4℃ 的PBS冲洗；0.25％胰酶消化3min，弃掉胰酶并终止消化；4℃离心； 4℃的PBS充分洗涤细胞2次；PBS悬浮细胞，调节浓度为1×106/ml， 取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加抗体10μl混匀后于温室避 光孵育30min，PBS重新重悬，流式细胞仪分析。
与微球体形成结果相对应，流式细胞仪双波长分析显示，如图6 所示，为药物干预后微球体细胞中侧群细胞(SP)的检测结果图。 其中，空白对照组(编号A)MCF-7悬浮成球细胞中SP细胞比率最 高，阿霉素组(编号C)对SP细胞无明显变化，和空白组无明显差 异，而绿原酸组(编号B)基本检不出SP细胞，因此，说明绿原酸 可以靶向肿瘤干细胞，改变肿瘤干细胞的状态，使培养细胞或肿瘤 组织干细胞数量明显降低。
6.耐药基因MDR1、BCRP的检测
取5×106/ml细胞提取细胞RNA并进行RNA纯度鉴定及完整性 检测。采用RT-PCR技术检测各组细胞中MDR1、BCRPmRNA表达。 基因的表达量以对照组表达为1，其余各组与其比较以相对表达量表 示。
如图7所示，为药物干预后微球体细胞中MDR1、BCRP的mRNA表 达的差异图。其中，绿原酸组(编号B)细胞球中MDR1、BCRP相 对基因表达量明显低于对照组。阿霉素组(编号C)与空白对照组 (编号A)比较差异不显著。肿瘤细胞多药耐药性的产生导致肿瘤 患者出现化疗抵抗，使疗效欠佳甚至复发，而多药耐药基因MDR1 以及乳腺癌耐药蛋白BCRP的持续过表达与肿瘤多药耐药性密切相 关；同时，研究表明肿瘤干细胞中MDR1和BCRP高表达，因此， 说明绿原酸可以降低肿瘤干细胞高表达的MDR1和BCRP，即绿原 酸可以通过抑制或杀灭肿瘤干细胞，防止肿瘤多药耐药性的产生。
本实施例中的所有数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析，具 有统计学意义。
实施例3
绿原酸对白血病干细胞的影响
材料：急性髓系白血病干细胞或急变期慢性髓系白血病病人的 外周血或骨髓细胞。
方法：外周血细胞用白细胞分离液除去红细胞，骨髓细胞用氯 化铵和碳酸氢钠处理去除红细胞，然后用无血清培养基培养，洗涤3 次。分成三组，并分别用生理盐水、浓度为1μg/mL和5μg/mL的 绿原酸处理3小时，再用无血清培养基洗涤，去除绿原酸，用甲基 纤维素IMAM培养液(1％甲基纤维素、30％牛血清白蛋白、0.2mM巯基 乙醇、2mM谷氨酰酰胺、50ng/ml重组人干细胞因子、10ng/ml促红 细胞生成素、50ng/ml粒细胞集落生产因子)配成50000cells/ml， 放入培养箱，培养10天，观察细胞集落。
集落形成率是评价肿瘤干细胞自我更新和增殖能力的经典方 法，其实验结果见下表1。
表1
由表1可知，绿原酸对白血病干细胞具有抑制作用，并可以减 弱肿瘤干细胞自我更新能力；同时，绿原酸对白血病干细胞的抑制 效果随着绿原酸浓度的增加而提高。
根据上述实施例中实验方法，用绿原酸钠盐、绿原酸钾盐或绿 原酸钙盐等药学上可接受的绿原酸盐取代绿原酸分别进行上述实 验，发现绿原酸钠盐、绿原酸钾盐和绿原酸钙盐均具有药效。
容易理解的，药学上可以接受的绿原酸化学合成衍生物，其和 绿原酸具有相同的母核结构，因而可具有相似的药效。
根据上述实施例中的实验方法，还分别验证了绿原酸对肝癌干 细胞、胃癌干细胞、肾癌干细胞、结肠癌干细胞等也具有上述药效。
实施例4
绿原酸丸剂的制备
处方：纯度为98％的绿原酸1g，淀粉50g以及药用量的聚维酮 K30和无水乙醇。
制法：按照丸剂的常规方法制备，采用搓丸法制得绿原酸丸剂 1000粒，没粒绿原酸丸剂含绿原酸1mg。
实施例5
绿原酸散剂的制备
处方：纯度为99.1％的绿原酸1000g以及药用量的辅料。
制法：按照散剂的常规方法制备，将绿原酸和辅料经粉碎、过 筛后混合均匀，制备成散剂。在无菌条件下分装成1000袋，每袋散 剂含绿原酸1000mg。
实施例6
绿原酸冻干粉针剂的制备
处方：绿原酸500g，作为支架剂的甘露醇55g，作为抗氧化剂 的亚硫酸氢钠4g。
制法：采用现有的冻干粉针剂制法，首先将上述处方中的各组 分完全溶解于纯化水中，再分别经过超滤膜过滤，无菌灌装，冷冻 干燥和压盖，按照无菌粉针剂的常规操作制成2ml粉针剂，共1000 支，每支含绿原酸500mg。
容易理解的，上述绿原酸作为药物活性成份根据其给药途径还 可以制成其他剂型，例如胶囊、片剂和颗粒剂等。
实施例4-6中的还可以用绿原酸钠盐、绿原酸钾盐、绿原酸钙 盐等药学上可接受的绿原酸盐衍生物代替绿原酸作为治疗肿瘤干细 胞的药物中的活性成份。
容易理解的，用于治疗肿瘤干细胞的药物中的活性成份也可以 含有绿源酸、绿原酸钠盐、绿原酸钾盐、绿原酸钙盐中的两种或多 种。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。