技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种芦荟发酵原浆化妆品及其制备方法与应 用。
背景技术
芦荟(Aloe)系百合科，多年生常绿肉质多汁草本植物。芦荟是一种集药食、保健、 美容和观赏于一体的重要经济植物。芦荟的化学成分相当复杂，经长期研究发现芦荟 中含有以芦荟素为首的80多种有效成分。主要含有蒽醌及其甙类、苷、萘酮、树脂、 有机酸、糖类、蛋白质、草酸钙、纤维、微量元素等。芦荟在美容及化妆品方面起主 要作用的是黏液成分，其中的多糖物质与氨基酸构成了天然的保湿剂，可以补充皮肤 中的水分，恢复胶原蛋白的功能，防止面部皱纹，保持皮肤光滑，富有弹性。芦荟中 的芦荟熊果苷、芦荟乌辛(Aloeulcin)能治疗胃及十二指肠溃疡、黏膜溃烂。芦荟熊果 苷还可以预防皮肤老化。我国芦荟资源丰富，为开发应用芦荟提供有利条件。随着荟 栽培业迅速发展及应用范围拓宽，对芦荟营养成分及在医疗保健作用方面研究也逐步 深入。对芦荟活性物质的提取工艺也不断完善，但是提取方法主要以闪式提取法、水 提法为主。
现有的芦荟活性物提取最常采用的是水提法：芦荟干品粉碎后加去离子水，真空 抽滤后取滤液，将滤液在旋转蒸发仪上浓缩，最后冰箱冷藏并使用乙醇沉淀，离心后 得到产物。但是该方法在提取过程中引入有机物，不仅破坏环境，且在应用的过程中 存在潜在的安全隐患。因此，为了避免上述问题，需要提供一种利用发酵工程技术对 芦荟活性物质进行提取的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种芦荟发酵原浆化妆品及其制备方法与应用，该方法利用 发酵工程技术从芦荟中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何外来物质，制备 得到的芦荟发酵物即芦荟发酵原浆对皮肤安全无伤害，具有更高的美白和抗衰老活性。
本发明提供的芦荟发酵原浆的制备方法，包括如下步骤：将芦荟原浆、水和发酵 菌混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到所述芦荟发酵原浆。
上述的制备方法中，所述初始体系中，所述发酵菌、所述芦荟原浆和水的配比可 为(18～35)mL：(15～30)g：(250～400)mL，所述发酵菌的浓度可为(106～109)CFU/mL； 具体地，所述初始体系中，所述发酵菌、所述芦荟原浆和水的配比可(18～35)mL： (15～30)g：320mL；更具体地，所述初始体系中，所述发酵菌、所述芦荟原浆和水 的配比为20mL：18g：320mL，所述芦荟原浆的浓度可为106～109CFU/mL。
上述的制备方法中，所述发酵培养的温度可为30～45℃，具体可为35℃；时间可 为24～38h，具体可为28h。
上述的制备方法中，所述发酵菌可为链球菌，具体可为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus；所述芦荟原浆来自芦荟的叶片，为匀浆机粉碎后得到的浆状物，具体可 为在1000～1200r/min转速下粉碎3～10min获得的浆状物质。
上述的制备方法中，所述发酵菌以其培养液或悬浮液的形式存在；所述发酵菌培 养液或所述发酵菌悬浮液的pH值可为6.5～7.5，具体可为7.0。
上述的制备方法中，所述方法在所述发酵培养之后，还包括对发酵液依次进行灭 菌、离心和取上清液的步骤。
上述的制备方法中，所述灭菌的条件如下：灭菌温度可为115～121℃，具体可为 115℃；灭菌时间可为15～25min，具体可为20min。
上述的制备方法中，所述离心的条件如下：离心转速可为4000～6000r/min，具体 4700r/min；所述离心时间可为20～30min，具体可为25min；所述离心的半径可为9cm。
本发明进一步提供了一种由上述的制备方法制备得到的芦荟发酵原浆。
上述芦荟发酵原浆在制备具有下述1)-4)中至少一种功能的化妆品中的应用或 在直接作为具有下述1)-4)中至少一种功能的化妆品中的应用，也在本发明的保护 范围内：
1)抑制酪氨酸酶活性；
2)皮肤美白；
3)清除DPPH自由基；
4)抗衰老。
上述的1)-4)的应用中，所述化妆品包括但不限于：面膜、精华液或爽肤水。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的芦荟发酵物(即芦荟发酵原浆)的制备方法采用发酵工程技术， 通过选择合适的菌种及发酵条件，从芦荟中提取得到活性物质。一方面，最大程度的 保留了植物中的活性成分，且相对与传统的水提法，避免了有机溶剂的引入，安全环 保；另一方面，不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了 生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量 的稳定性。
(2)本发明提供的芦荟发酵原浆中含有健康皮肤不可或缺的氨基酸、矿物质等 自然成分，且由于在制备过程中未引入外来物质，不含任何化学成分，可以直接作为 面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤 造成任何负作用；且获得成分分子量小，易于让皮肤充分吸收。
(3)本发明提供的芦荟发酵原浆，具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进 细胞代谢，增强细胞活力，改善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞 老化，具有抗衰老的功效。
(4)本发明提供的芦荟发酵原浆，可抑制酪氨酸酶的活性，其美白效果相当于 0.44％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。
附图说明
图1为芦荟发酵原浆的活性多肽分子量分布HPLC图谱。
图2为不同浓度的芦荟发酵原浆与DPPH自由基清除率的关系曲线。
图3为10％的芦荟发酵原浆和1％的熊果苷对酪氨酸酶的抑制率的对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养 基中的浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，pH值为7.0。
下述实施例中的YPD培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其在液体培养 基中的浓度为：酵母提取物1％(质量分数)，胰蛋白胨2％(质量分数)，葡萄糖2％ (质量分数)，pH值为7.0。
下述实施例中的芦荟原浆为芦荟叶片在转速为1000～1200r/min的匀浆机中粉碎 3～10min得到的浆状物质，所用芦荟叶片来自市面销售。
下述实施例中的嗜热链球菌Streptococcusthermophilus的ATCC编号为19258，公 众可从ATCC购买得到。
下述实施例中的嗜热链球菌菌液通过如下步骤制备得到：
1、菌种的活化
挑取嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌落一环于液体培养基中，放入摇 床中将菌种活化，得到活化后嗜热链球菌菌液。
2、菌种的纯化
将步骤1得到的活化后的菌液梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后嗜热 链球菌。
3、菌种的扩大培养
将步骤2得到的纯化后的菌种接种到YPD培养基(pH值为7.0)中，在25℃的 摇床中培养，当OD值＝0.6～1.2时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度为106～109CFU/mL)。
实施例1、制备芦荟发酵原浆
按照如下步骤制备芦荟发酵原浆
(1)将20mL上述步骤3得到的嗜热链球菌发酵菌菌液接种到18g的芦荟原浆和 320mL的水中，得到发酵体系；
(2)将发酵体系在35℃摇床中发酵28小时，得到发酵产物；
(3)将发酵产物在115℃下灭菌20min，使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；
(4)将灭菌后的发酵产物在4700r/min、离心半径为9cm的条件下离心25min， 弃沉淀，收集上清液，即为芦荟发酵原浆。
实施例2、芦荟发酵原浆在作为化妆品中的应用
一、芦荟发酵原浆的性质
将实施例1所制备所得的发酵原浆采用活性炭脱色、去味。其外观为粘稠液体、 颜色为淡黄色至棕黄色。pH值5.2-6.3，粘度200-500cP，可溶性固含物含量1.5-5.0％， 菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品 细菌总数不高于1000CFU/mL，所以此发酵原浆符合化妆品质量要求。
对该芦荟发酵原浆进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖 检测方法参照GB/T5009.8-2008；黄酮检测方法参照GB/T5009.124-2003；总酚检测 方法参照GB/T8313-2008，所得结果如下：
本发明制得的芦荟发酵原浆含蛋白质4.35g/kg、粗多糖15.36g/kg、总黄酮 0.086g/kg(以芦丁计)、总酚0.14g/kg。
二、芦荟发酵原浆的安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1 获得的芦荟发酵原浆进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法
称取0.020g-0.025g固体样品或半固体的样品放入斑试器中备用。将液体样品 0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白 对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油(本实施例 采用蒸馏水)。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。 测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求， 不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等 待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h 分别再观察一次。
3、试验结果
斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下："-"＝阴性反应；"±"＝ 可疑反应：仅有微弱红斑；"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有 丘疹；"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超 出受试区；"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、 融合性疱疹；反应超出受试区。
判断标准：根据化妆品卫生规范2007，30例受试者中出现1级皮肤不良反应的 人数多于5例，或出现二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三 级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不 良反应。
表1、实施例1获得的芦荟发酵原浆的斑贴试验结果
从表1中可以看出：实施例1得到的芦荟发酵原浆未产生可疑反应，说明本发明 提供的芦荟发酵原浆均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
三、芦荟发酵原浆的分子量大小检测
分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱 (HPLC)测定实施例1制备的芦荟发酵原浆的分子量大小。具体步骤如下：
1、试验的试剂和溶液的制备
(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝30：70：0.1(v/v/v)。
(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/mL的样品，再在用微孔膜 (0.45μm)过滤后供进样。
(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mr67000)、B12(Mr1335)、氧化型谷胱 甘肽(Mr614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/mL。
2、试验方法
将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw67000)，维生素B12(Mw1335) 和氧化型谷胱甘肽(Mw614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠 等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)” 中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透 层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。 再按照同样的方法将实施例1中制备的芦荟发酵原浆进行HPLC分析，得到相应峰的 洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的芦荟发酵原浆的分子 量大小。
色谱条件：色谱柱：TsKgel2000SWXL300mm×7.8mm；检测波长：UV280nm； 流速：1ml/min；柱温：30℃。
3、试验结果
标准物质的分子量与洗脱时间的如表2所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图 得到标准曲线：y＝-2.4738x+17.656，R2＝0.9998。其中y为洗脱时间(min)；x为 分子量对数。
表2、标准物质的分子量与洗脱时间
实施例1制备的芦荟发酵原浆的HPLC图谱如图1所示：从图1中可以看出，芦 荟发酵原浆的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11.63min，将洗脱时间代入标 准曲线：y＝-2.4738x+17.656，计算出峰的分子量为272.85Da，并且根据峰面积计算 芦荟发酵原浆占99.95％。一般认为分子量500Da左右活性肽成分更易被皮肤吸收，所 以芦荟发酵物中存在容易被吸收的活性多肽。
四、芦荟发酵原浆的抗氧化性能检测
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有 机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除 剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。 因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
取不同量的实施例1制备得到的芦荟发酵原浆溶于去离子水中，制得体积百分浓 度为0.63％、1.25％、2.50％、5.00％和10.00％的一系列芦荟发酵原浆待测液。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；
(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2(1)
以芦荟发酵原浆的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作芦荟发酵原浆 对DPPH自由基清除作用曲线，见图2。
由图可知，实施例1所得芦荟发酵原浆对DPPH清除作用的IC50＝8.82％，说明芦 荟发酵原浆具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改 善机体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
五、芦荟发酵原浆的美白功效分析
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程，其活性程度对色素的 沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美 白作用，故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。
通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，以10％(v/v，溶剂为去 离子水)芦荟发酵原浆为待测样品，测定其对酪氨酸酶活性的抑制效果。
表2、溶液配制列表
溶液 C1(mL) C2(mL) T1(mL) T2(mL) L-酪氨酸 2 2 2 2 样品 0 0 2 2 PBS 4 5 2 3 酪氨酸酶 1 0 1 0 总体积 7 7 7 7
注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL。
按表2配置各溶液，按照如下步骤对样品中酪氨酸酶的活性抑制率进行测定：
(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1mL，继续水浴10 分钟，测定C1吸光度值。
(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)。
活性抑制率T(％)的计算公式为：T(％)＝(C1-T1)/C1×100％(2)
实验证明，10％芦荟发酵原浆对酪氨酸酶活性的抑制率为43.81％，1％(v/v，溶 剂为去离子水)的熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制率99.52％，见图3。即芦荟发酵原浆 的美白效果相当于0.44％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。