技术领域
本发明涉及动物模型，尤其涉及多囊卵巢动物模型的构建方法及应用。
背景技术
多囊卵巢综合征（PCOS）是常见的导致育龄妇女不孕的内分泌疾病，其病理特征呈现多样性和异质性，包括月经稀发或闭经、慢性无排卵、不孕、多毛及痤疮等，同时，常常伴发有肥胖、高雄激素血症、高胰岛素血症、慢性炎症等症状。
良好的动物模型对于研究PCOS的发病机制至关重要。国内外已建立了多 个PCO动物模型，有雄激素诱导、雌激素诱导、胰岛素联合促性腺激素诱导、芳香化酶抑制剂诱导等。
国家知识产权局于2016年06月08日公开了申请号为CN201410696583.6，名称为一种多囊卵巢动物模型的构建方法及应用的发明专利，包括将试验用动物至于实验空间；对动物进行持续光照，并观察动物卵巢是否出现多囊卵巢综合征的病理特征。该多囊卵巢动物模型的构建成功率极低，随机性太强，同时需要花费大量的时间。
现有的多囊卵巢动物模型与临床上PCOS的病理特征的符合程度不高、构建成功率低。因此，本领域急需开发一种动物模型，该动物模型构建成功率高，可高度符合临床上多囊卵巢综合征的病例特征，用于研究多囊卵巢对哺乳动物的影响，进而用于药物开发。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中多囊卵巢动物模型构建成功率低，随机性强，同时构建出来的多囊卵巢动物模型与临床多囊卵巢综合征的病理特征符合度低的问题；提出了多囊卵巢动物模型的构建方法及应用，实现了高效率的构建多囊卵巢动物模型，构建出来的动物模型与临床多囊卵巢病理特征符合度高，便于进一步药物开发。同时可以研究多囊卵巢综合征的炎症环境、雄激素环境对炎症因子分泌的影响以及炎症环境对脂肪组织的影响。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
多囊卵巢动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：筛选卵泡正常的试验用动物，并将试验用动物至于实验空间并标号1至N；
步骤2：检测每个试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平，分别记录为Wt1、AI1、Glu1，Wt2、AI2、Glu2，Wt3、AI3、Glu3，Wt4、AI4、Glu4，Wt5、AI5、Glu5……WtN、AIN、GluN；
步骤3：制备来曲唑缓释剂；来曲唑缓释剂日释放剂量为200 μg/天，每粒来曲唑缓释剂为80-100日释放量；
步骤3：将来曲唑缓释剂包埋在试验用动物的颈背部皮下；
步骤4：来曲唑缓释剂包埋持续6-10周后，筛选卵泡为空泡的试验用动物；并检测这些试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平，分别记录为Wt1，、AI1，、Glu1，，Wt2，、AI2，、Glu2，，Wt3，、AI3，、Glu3，，Wt4，、AI4，、Glu4，，Wt5，、AI5，、Glu5，……WtN，、AIN，、GluN，；
步骤5:步骤2和步骤4中的体重、雄激素水平和血糖耐受结果进行比较；筛选出多囊卵巢动物模型。
进一步地，本发明所述步骤1中所述卵泡正常为超声标准单侧或双侧卵巢内直径2-9mm的卵泡≥12个和/或卵巢体积≥10ml。
进一步地，本发明对步骤5中的多囊卵巢动物模型的循环系统和卵泡液中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10炎症因子进行了检测。
进一步地，本发明对步骤5中的多囊卵巢动物模型的循环系统中的TNF-α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17炎症因子进行了检测。
进一步地，本发明对上述炎症因子的检测采用了流失细胞仪和ELISA试剂盒。
进一步地，本发明将步骤5中的多囊卵巢动物模型按照不同剂量的雄激素处理巨噬细胞，分别测定mRNA水平、蛋白水平及分泌量。
进一步地，本发明检测步骤5中的多囊卵巢动物模型的脂滴。
进一步地，本发明将步骤5中的多囊卵巢动物模型按照体重注射TNF-α抗体。
进一步地，本发明所述TNF-α抗体注射剂量为3-6mg/kg，每2-5天用药一次，共用药5-8次。
本发明的有益效果：
（一）本发明提出了一种多囊卵巢动物模型的构建方法，实现了高效率的构建多囊卵巢动物模型，构建出来的动物模型与临床多囊卵巢病理特征符合度高，便于进一步药物开发。同时可以研究多囊卵巢综合征的炎症环境、雄激素环境对炎症因子分泌的影响以及炎症环境对脂肪组织的影响。
（二）本发明还提出了多囊卵巢动物模型的应用，主要是指免疫应用。本发明通过向多囊卵巢动物模型体内注射TNF-α抗体，可以缓解多囊卵巢动物模型的体重、雄激素水平、血糖耐受水平以及卵泡的空泡现象。证明了TNF-α抗体对多囊卵巢症状的免疫治疗作用。
附图说明
图1为空白对照组（CTL）与PCOS患者的炎症因子的对比图。
图2为脂滴的变化示意图。
图3为多囊卵巢动物模型的指标变化表格。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
多囊卵巢动物模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：筛选卵泡正常的试验用动物，并将试验用动物至于实验空间并标号1至N；具体为第一个卵泡正常的试验用动物标记为1；第二个卵泡正常的试验用动物标记为2，依次类推，第N个卵泡正常的试验用动物标记为N。
其中，卵泡正常为超声标准单侧或双侧卵巢内直径2-9mm的卵泡≥12个和/或卵巢体积≥10ml。
步骤2：检测每个试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平，分别记录为Wt1、AI1、Glu1，Wt2、AI2、Glu2，Wt3、AI3、Glu3，Wt4、AI4、Glu4，Wt5、AI5、Glu5……WtN、AIN、GluN；其中Wt1、AI1、Glu1分别代表标记为1的试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；Wt2、AI2、Glu2分别代表标记为2的试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；依次类推，WtN、AIN、GluN分别代表标记为N的试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平。
步骤3：制备来曲唑缓释剂；来曲唑缓释剂日释放剂量为200 μg/天，每粒来曲唑缓释剂为90日释放量；
步骤3：将来曲唑缓释剂包埋在试验用动物的颈背部皮下；
步骤4：来曲唑缓释剂包埋持续6-10周后，筛选卵泡为空泡的试验用动物；并检测这些试验用动物的体重、雄激素水平和血糖耐受水平，分别记录为Wt1，、AI1，、Glu1，，Wt2，、AI2，、Glu2，，Wt3，、AI3，、Glu3，，Wt4，、AI4，、Glu4，，Wt5，、AI5，、Glu5，……WtN，、AIN，、GluN，；其中Wt1，、AI1，、Glu1，分别代表标记为1的试验用动物来曲唑缓释剂包埋持续6-10周后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；Wt2，、AI2，、Glu2，分别代表标记为2的试验用动物来曲唑缓释剂包埋持续6-10周后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；依次类推，WtN，、AIN，、GluN，分别代表标记为N的试验用动物来曲唑缓释剂包埋持续6-10周后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平。
步骤5:步骤2和步骤4中的体重、雄激素水平和血糖耐受结果进行比较；筛选出多囊卵巢动物模型。
衡量多囊卵巢动物模型卵巢是否多囊改变主要通过卵巢组织切片计数卵泡个数、闭锁卵泡个数与同期同条件饲养试验用动物是否存在差异衡量，同时多囊卵巢动物模型多囊化卵泡的膜细胞层变薄，颗粒细胞变紧密。可以结合统计学进行筛选。
本发明对步骤5中的多囊卵巢动物模型的循环系统和卵泡液中的IFN-γ、IL-2（Th1型）、IL-4、IL-10（Th2型）炎症因子进行了检测。Th1型炎症因子在多囊卵巢动物模型中显著高于空白对照组。
如图1所示：本发明对步骤5中的多囊卵巢动物模型的循环系统中的TNF-α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17炎症因子进行了检测。
其结果显示：TNF-α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17炎症因子水平升高，该多囊卵巢动物模型的循环系统的炎症水平明显升高。
本发明对上述炎症因子的检测采用了流失细胞仪和ELISA试剂盒。
本发明将步骤5中的多囊卵巢动物模型按照不同剂量的雄激素处理巨噬细胞，分别测定mRNA水平、蛋白水平及分泌量。
雄激素浓度达到100μM时睾酮对巨噬细胞的生长产生抑制，而随着时间的推移，高浓度睾酮干预下，巨噬细胞分泌出的TNF-α浓度逐渐升高。综合考量iNOS、TNF-α等巨噬细胞M1型极化代表性biomarker及IL-10、Arg1等M2型代表性biomarker的MRNA水平，睾酮诱使巨噬细胞向M1型极化并弱化M2型极化。此外，通过综合考量IκB、NF-κB等炎症信号通路相关的指标，睾酮会随着时间的推移诱使炎症信号通路显著激活。
本发明检测步骤5中的多囊卵巢动物模型的脂滴。
初步试验发现，多囊卵巢动物模型的脂滴要显著大于空白对照组，且PPARγ等脂肪相关基因也有不少发生了变化显著变化并伴随有TNF-α等炎症因子水平升高。而经过TNF-α抑制剂进行免疫治疗后，脂滴显著减小，且呈现变化的基因也收到了抑制。
炎症环境会显著刺激脂肪细胞的分化及脂滴的募集，进而加剧PCOS的肥胖特征，是PCOS的重要发病环节之一。
通过上述多囊卵巢动物模型可以清晰的看出多囊卵巢综合征的炎症环境、雄激素环境对炎症因子分泌的影响以及炎症环境对脂肪组织的影响。便于药品和治疗方式的进一步研究。
本发明还公开了多囊卵巢动物模型的应用：将步骤5中的多囊卵巢动物模型按照体重注射TNF-α抗体。
本发明中TNF-α抗体注射剂量为5mg/kg，每4天一次，共用药7次。
注射TNF-α抗体后，多囊卵巢动物模型的体重、雄激素水平和血糖耐受水平，分别记录为Wt1，，、AI1，，、Glu1，，，Wt2，，、AI2，，、Glu2，，，Wt3，，、AI3，，、Glu3，，，Wt4，，、AI4，，、Glu4，，，Wt5，，、AI5，，、Glu5，，……WtN，，、AIN，，、GluN，，。其中Wt1，，、AI1，，、Glu1，，分别代表标记为1的多囊卵巢动物模型按照上述注射要求注射TNF-α抗体后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；Wt2，，、AI2，，、Glu2，，分别代表标记为2的多囊卵巢动物模型按照上述注射要求注射TNF-α抗体后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平；依次类推，WtN，，、AIN，，、GluN，，分别代表标记为N的多囊卵巢动物模型按照上述注射要求注射TNF-α抗体后的体重、雄激素水平和血糖耐受水平。
图3为步骤2中的试验用动物、步骤5中的多囊卵巢动物模型以及注射TNF-α抗体后三个阶段的体重、雄激素水平和血糖耐受水平变化。
（-）表示血糖耐受水平未受损。
（++++）表示血糖量均明显高于正常对照组，提示血糖耐受水平受损严重。
（+++）表示血糖量明显高于正常对照组，提示血糖耐受水平异常稍改善。
（+）表示血糖量明显高于正常对照组，提示血糖耐受水平异常改善较好。
从上述试验数据可以看出：本发明所述的多囊卵巢动物模型的构建方法构建得到的是体重、雄激素水平和血糖耐受水平明显下降的多囊卵巢动物模型，经过注射TNF-α抗体后，有效地抑制了体重、雄激素水平和血糖耐受水平。本发明所述方法与实际PCOS患者的症状及其相似。
同时，如图2所示，其中，CTL为空白对照组。PCOS为多囊卵巢动物模型组。PCOS+ETA为多囊卵巢动物模型组注射TNF-α抗体（依那西普）；PCOS+Diane+Met为多囊卵巢动物模型注射达英35和二甲双胍；PCOS+ETA+Diane+Met为多囊卵巢动物注射TNF-α抗体、达英35和二甲双胍。
TNF-α抗体进行免疫治疗后，脂滴显著减小，且呈现变化的基因也收到了抑制。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。