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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510338251.5 (22)申请日 2015.06.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104887727 A (43)申请公布日 2015.09.09 (73)专利权人 泰山医学院 地址 271016 山东省泰安市高新区长城路 619号 (72)发明人 张维涛 付春香 綦岩 (51)Int.Cl. A61K 36/23(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 31/4166(2006.01) A61K 131/00(200。
2、6.01) (56)对比文件 CN 101780127 A,2010.07.21, 吴霞， 等.阿育魏实化学成分的研究. 中 国药学杂志 .2006,第41卷(第14期), 马庆东， 等.维吾尔药阿育魏实化学成分的 分离与鉴定. 沈阳药科大学学报 .2011,第28卷 (第7期), 审查员 张慧艳 (54)发明名称 阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物 中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种阿育魏果提取物的新用途， 该新用途是阿育魏果提取物在制备治疗前列腺 癌药物中的应用。 所述阿育魏果提取物是按如下 方法制备的： 以阿育魏果为原料， 采用30%-80%乙 醇低温提取， MCI凝胶柱色谱等进行。
3、纯化得到。 本 发明所提供的阿育魏果提取物对制备治疗前列 腺癌药物具有重要意义。 权利要求书2页 说明书8页 CN 104887727 B 2018.08.03 CN 104887727 B 1.阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 所述阿育魏果提取物是按如 下方法制备得到: （1） 阿育魏果， 用60%乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时间为4 小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提物A； （2） 将步骤 （1） 得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI 凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4:96的 甲醇-水洗脱， 再。
4、用份数比20:80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20:80的甲醇-水洗脱部分， 回 收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； （3） 将步骤 （2） 得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2:1混合均匀的MCI 凝胶-硅 胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集份 数比10:1-3:1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 2.根据权利要求1所述阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征 在于所述阿育魏果提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物15份 恩杂鲁胺2 份。 3.根据权利要求1所述阿育魏。
5、果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征 在于所述阿育魏果提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物10份 恩杂鲁胺1 份。 4.根据权利要求1所述阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征 在于所述阿育魏果提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物20份 恩杂鲁胺1.5 份。 5.一种阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的应用， 所述阿育魏果提取物是按 如下方法制备得到: （1） 阿育魏果， 用30%-80%乙醇为溶剂， 提取温度零下5-零下10， 提取次数为2-6次， 每次提取时间为4-10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10-15倍， 滤过， 提。
6、取液冷冻干 燥， 得阿育魏果粗提物A； （2） 将步骤 （1） 得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI 凝胶柱色谱纯化， 先用份数比3:97- 5:95的甲醇-水洗脱， 再用份数比6:94-30:70的甲醇-水洗脱， 收集份数比6:94-30:70的甲 醇-水洗脱部分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； （3） 将步骤 （2） 得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比3:1-1:3混合均匀的MCI 凝 胶-硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收 集份数比10:1-3:1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 。
7、6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于所述阿育魏果提取物是按如下方法制备得 到: （1） 阿育魏果， 用60%乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时间为4 小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提物A； （2） 将步骤 （1） 得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI 凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4:96的 甲醇-水洗脱， 再用份数比20:80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20:80的甲醇-水洗脱部分， 回 收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； （3） 将步骤 （2） 得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2:1混合均匀的M。
8、CI 凝胶-硅 胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集份 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 104887727 B 2 数比10:1-3:1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于所述阿育魏果提取物是按如下方法制备得 到: （1） 阿育魏果， 用50%乙醇为溶剂， 提取温度零下7， 提取次数为2次， 每次提取时间为 10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的15倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提物 A； （2） 将步骤 （1） 得到的阿育魏果粗提物A， 经。
9、过MCI 凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4.5: 95.5的甲醇-水洗脱， 再用份数比25:75的甲醇-水洗脱， 收集份数比25:75的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； （3） 将步骤 （2） 得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2:1混合均匀的MCI 凝胶-硅 胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集份 数比10:1-3:1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 8.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于阿育魏果提取物与化学药或中药组成治疗 前列腺癌的药物。 9.根据权利要求5所述的。
10、应用， 其特征在于所述的阿育魏果提取物通过加入药剂学允 许的各种辅料制成药剂学上的片剂、 颗粒剂或胶囊。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 104887727 B 3 阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 涉及一种中药材提取物在制备治疗前列腺癌药物中的 应用， 具体是涉及一种阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的应用。 背景技术 0002 在癌症的分类上， 前列腺癌是全球第六大癌症， 又是全球男性第二大癌症。 在中 国， 前列腺癌发病率约为2.41/10万人口， 前列腺癌发现时已多为晚期， 它有可能成为我国 男性的第一大杀手。 前。
11、列腺癌的药物治疗主要分为两个阶段， 激素依赖性肿瘤细胞为主阶 段和激素抵抗性肿瘤细胞为主阶段。 0003 未经治疗的前列腺癌(prostate cancer， PCa)细胞多为雄激素依赖性， 睾酮与其 表面雄激素受体(androgenreceptor， AR)结合后， 活化信号转导入胞核内调控细胞生长。 内 分泌治疗通过阻断雄激素促使雄激素依赖性癌细胞凋亡， 从而达到治疗目的。 0004 去势治疗的目的是减少或消除人体内雄激素的分泌， 从而抑制前列癌细胞的增 长。 包括手术去势和药物去势两种方法。 手术去势主要为双侧睾丸切除， 可迅速有效地降低 体内雄激素水平。 但睾丸切除后， 肾上腺还能产生。
12、一定量的雄激素。 若同时切除肾上腺则并 发症较多， 一般不联合应用。 药物去势的优点在于无手术危险及因手术给患者造成的心理 影响。 去势药物可分为两大类： 雌激素及其类似物。 雌激素可抑制垂体促黄体生成素(LH) 释放， 使血中睾酮含量下降， 从而发挥治疗作用。 黄体生成素释放激素(LHRH)药物。 包括 LHRH激动剂(LHRH- )及LHRH拮抗剂。 LHRH- 为临床最广泛使用的去势药物， 是欧美国家转 移性前列腺癌内分泌治疗首选的一线去势药物。 LHRH- 应用第一周， 血清睾酮一过性升高， 随后通过负反馈效应引起睾酮急剧下降， 34周可达到去势水平(血清睾酮降低5 10)。 但LHR。
13、H- 于肾上腺不产生作用。 目前临床常用的药物有戈舍瑞林、 亮丙瑞林、 曲普瑞 林。 由于应用初期会导致睾酮释放的增加， 故在注射此类药物时应同时给予抗雄激素药物2 周。 LHRH拮抗剂作用机制与LHRH- 相似， 能直接对抗LHRH的作用。 使用后不会导致一过性血 清睾酮明显升高及因此带来的副反应。 常用药物为阿巴瑞克(abarelix)， 有研究比较阿巴 瑞克和激动剂亮丙瑞林的临床疗效， 结果显示前者的去势治疗效果优于后者。 但是， 随着使 用时间的延长， 阿巴瑞克引发的组胺释放可能产生严重过敏反应， 因此， FDA仅批准晚期PC 在无其他可选去势方法的情况下使用。 0005 虽然内分泌治。
14、疗可以使大多数患者的病情得到控制和改善， 但在经过中位时间为 1830个月的缓解期后， 绝大多数患者会发展为激素抵抗性前列腺癌。 此类患者生存率较 低， 其中位生存期仅为18-24个月。 因此， 对于此类病人进行有效地管理与治疗， 就成为了临 床工作的难点。 0006 阿育魏果为伞形科植物细叶糙果芹(Trachyspermum ammi(L.)Sprague.)的成熟 果实， 维吾尔语名称 “Juwine” ， 音译为 “居维纳” ， 汉语通用名称为 “阿育魏果” ， 是维吾尔医 常用的药材品种， 收载于 卫生部药品标准： 维吾尔药分册 。 阿育魏果所含的麝香草酚对口 腔、 咽喉黏膜细菌和真菌。
15、有抑制作用， 对龋齿有防腐、 局麻作用， 还可用于皮肤化脓性感染 说 明 书 1/8 页 4 CN 104887727 B 4 及真菌和放线菌病， 此外有驱钩虫作用。 阿育魏果油可毒害蚯蚓， 其醇提取物(10)对葡萄 糖球菌、 大肠杆菌有抑制作用， 稀释后可作祛痰剂。 有关研究表明阿育魏果乙醇提取物中含 有麝香草酚、 槲皮素、 -谷甾醇、 豆甾醇、 胡萝 卜苷、 东莨菪内酯、 山奈素、 羟基桂皮酸、 4-羟基 薄荷-1-烯-7-酸、 6-羟基麝香草酚6-O- -D葡萄糖等。 目前有关阿育魏果的基础研究尚十分 有限， 尚未见阿育魏果或阿育魏果提取物治疗前列腺癌作用研究的报道。 发明内容 0007。
16、 本发明的目的在于提供一种阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的应用。 0008 本发明是通过如下技术方案实现的： 0009 本发明所用阿育魏果为伞形科植物细叶糙果芹(Trachyspermum ammi(L .) Sprague.)的成熟果实。 0010 阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的应用， 所述阿育魏果提取物是按如 下方法制备得到： 0011 (1)阿育魏果， 用30-80乙醇为溶剂， 提取温度零下5-零下10， 提取次数为 2-6次， 每次提取时间为4-10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10-15倍， 滤过， 提取液 冷冻干燥， 得阿育魏果粗提物A； 0012 (2)将。
17、步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比3 97-5： 95的甲醇-水洗脱， 再用份数比6 94-30 70的甲醇-水洗脱， 收集份数比6 94-30 70的 甲醇-水洗脱部分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0013 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比3 1-1 3混合均匀的MCI 凝胶-硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并 收集份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0014 优选的阿育魏果提取物制备方法： 0015 (。
18、1)阿育魏果， 用60乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时 间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提 物A； 0016 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4 96的甲醇-水洗脱， 再用份数比20 80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20 80的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0017 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相。
19、同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0018 优选的阿育魏果提取物制备方法： 0019 (1)阿育魏果， 用50乙醇为溶剂， 提取温度零下7， 提取次数为2次， 每次提取时 间为10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的15倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗 提物A； 0020 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4.5 95.5的甲醇-水洗脱， 再用份数比25 75的甲醇-水洗脱， 收集份数比25 75的甲醇-水洗脱 部分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B；。
20、 说 明 书 2/8 页 5 CN 104887727 B 5 0021 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0022 本发明的阿育魏果提取物与化学药或中药组成治疗前列腺癌的药物。 0023 本发明的阿育魏果提取物通过加入药剂学允许的各种辅料制成药剂学上的片剂、 颗粒剂或胶囊。 0024 本发明的阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物。 0025 阿育魏。
21、果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征在于所述阿育魏果 提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物15份恩杂鲁胺2份。 0026 阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征在于所述阿育魏果 提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物10份恩杂鲁胺1份。 0027 阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物， 其特征在于所述阿育魏果 提取物与恩杂鲁胺的重量份数比为： 阿育魏果提取物20份恩杂鲁胺1.5份。 0028 本发明的阿育魏果提取物可有效抑制PC-3M的细胞增殖(P0.01)， 并促进癌细胞 凋亡。 同时能显著减少Cyclin D1的表达以及下调内。
22、源性p-ERK1/2水平(P0.01)。 阿育魏 果提取物与恩杂鲁胺均可抑制DU-145细胞增殖， 诱导其凋亡， 呈剂量、 时间依赖性； 二者联 合应用有协同作用， 其作用可能与Bcl-2介导有关。 具体实施方式 0029 下面通过具体实验例和实施例对阿育魏果提取物在制备治疗前列腺癌药物中的 应用做进一步说明， 但不限于本发明。 0030 实施例1： 阿育魏果提取物的制备 0031 (1)阿育魏果12kg， 用30乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为2次， 每次提 取时间为10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的15倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏 果粗提物A； 0032 (2)。
23、将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比5 95的甲醇-水洗脱， 再用份数比30 70的甲醇-水洗脱， 收集份数比30 70的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0033 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比3 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0034 实施例2： 阿育魏果提取物的制备 0035 (1)阿育魏果15kg， 用80乙醇为。
24、溶剂， 提取温度零下10， 提取次数为6次， 每次 提取时间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏 果粗提物A； 0036 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比3 97的甲醇-水洗脱， 再用份数比6 94的甲醇-水洗脱， 收集份数比6 94的甲醇-水洗脱部分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0037 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比1 3混合均匀的MCI凝胶- 说 明 书 3/8 页 6 CN 104887727 B 6 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 。
25、以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0038 实施例3： 阿育魏果提取物的制备 0039 (1)阿育魏果10kg， 用60乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提 取时间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果 粗提物A； 0040 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4 96的甲醇-水洗脱， 再用份数比20 80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20 80的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇，。
26、 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0041 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0042 实施例4： 阿育魏果提取物的制备 0043 (1)阿育魏果， 用50乙醇为溶剂， 提取温度零下7， 提取次数为2次， 每次提取时 间为10小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的15倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗 提物A； 0044 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果。
27、粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4.5 95.5的甲醇-水洗脱， 再用份数比25 75的甲醇-水洗脱， 收集份数比25 75的甲醇-水洗脱 部分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0045 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0046 实施例5： 阿育魏果提取物片的制备 0047 取实施例2阿育魏果提取物35g， 加入淀粉10g， 混。
28、匀， 制粒， 干燥， 过筛， 加微晶纤维 素4g， 硬脂酸镁1g， 混匀， 压制成100片， 即得阿育魏果提取物片。 0048 实施例6： 阿育魏果提取物颗粒的制备 0049 取实施例3阿育魏果提取物35g， 加入糊精20g， 蔗糖15g， 混匀， 制粒， 干燥， 整粒， 即 得阿育魏果提取物颗粒。 0050 实施例7： 阿育魏果提取物胶囊的制备 0051 取实施例4阿育魏果提取物30g， 加淀粉30g， 混匀， 制粒， 干燥， 整粒， 装胶囊100粒， 即得阿育魏果提取物胶囊。 0052 实施例8： 阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物 0053 (1)阿育魏果， 用60乙醇为溶剂。
29、， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时 间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提 物A； 0054 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4 96的甲醇-水洗脱， 再用份数比20 80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20 80的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0055 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 说 明 书 4/8 页 7 CN 104887727 B 7 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 。
30、以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0056 (4)取步骤(3)所得阿育魏果提取物15g与恩杂鲁胺2g混匀， 即得阿育魏果提取物 与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物。 0057 实施例9： 阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物 0058 (1)阿育魏果， 用60乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时 间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提 物A； 0059 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MC。
31、I凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4 96的甲醇-水洗脱， 再用份数比20 80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20 80的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0060 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶- 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0061 (4)取步骤(3)所得阿育魏果提取物10g与恩杂鲁胺1g混匀， 即得阿育魏果提取物 与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物。 0062。
32、 实施例10： 阿育魏果提取物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物 0063 (1)阿育魏果， 用60乙醇为溶剂， 提取温度零下5， 提取次数为6次， 每次提取时 间为4小时， 每次溶剂用量为阿育魏果重量的10倍， 滤过， 提取液冷冻干燥， 得阿育魏果粗提 物A； 0064 (2)将步骤(1)得到的阿育魏果粗提物A， 经过MCI凝胶柱色谱纯化， 先用份数比4 96的甲醇-水洗脱， 再用份数比20 80的甲醇-水洗脱， 收集份数比20 80的甲醇-水洗脱部 分， 回收甲醇， 干燥， 得阿育魏果粗提物B； 0065 (3)将步骤(2)得到的阿育魏果粗提物B， 经过重量份数比2 1混合均匀的MCI凝胶-。
33、 硅胶混合色谱柱， 用石油醚-丙酮梯度洗脱， 以硅胶G薄层层析检测， 合并相同流份， 并收集 份数比10 1-3 1的石油醚-丙酮洗脱液合并， 回收溶剂， 干燥， 即得阿育魏果提取物。 0066 (4)取步骤(3)所得阿育魏果提取物20g与恩杂鲁胺1.5g混匀， 即得阿育魏果提取 物与恩杂鲁胺组成的治疗前列腺癌药物。 0067 实验例1： 阿育魏果提取物对人前列腺癌PC-3M细胞周期与凋亡的影响试验 0068 1.材料与方法 0069 1.1材料 0070 1.1.1细胞人前列腺癌PC-3M细胞， 购自上海肿瘤研究所。 0071 1 .1 .2药物与试剂阿育魏果提取物(按实施例2、 实施例3方。
34、法制备)批号： 20130303、 20130304； DMEM培养基： Invitrogen公司； 小牛血清： Amersco公司； 胰蛋白酶： Amersco公司； 0.25胰酶： Gibco公司； 甲基偶氮唑盐(MTT)： Sigma公司； 二甲基亚砜 (DMSO)： 南京建成生物工程研究所； PI染色试剂盒： Roche公司； Cyclin D1蛋白抗体： 南京建 成生物工程研究所； DAB显色试剂盒： 北京中杉金桥生物技术有限公司； p-ERK1/2抗体： Invitrogen公司。 蛋白裂解液： 南京建成生物工程研究所。 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)： Invitrogen公司。。
35、 说 明 书 5/8 页 8 CN 104887727 B 8 0072 1.1.3仪器Model 311CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)。 IX71-A21PH倒置显微 镜(日本Olympus公司)。 SZX型超净工作台(上海浦东跃欣科学仪器厂)。 GelDoc XR+凝胶成 像系统(美国Bio-rad公司)。 JC303A-T电热恒温培养箱(成都一恒科技有限公司)。 0073 1.2方法 0074 1.2.1细胞培养无菌环境下， 培养基RPMI-1640中加入新配置15FBS、 200 g/mL青 霉素、 150 g/mL链霉素(4保存)。 PC-3M细胞复苏后， 接种在培。
36、养瓶安置CO2培养箱中孵化 (37， 5CO2)。 D-Hank S液冲洗3次， 加入5mL 0.25的胰蛋白酶液， 置37约10min。 终止 消化后， 细胞悬液移人无菌刻度离心管中， 低速离心10min后消化3次， 进行细胞计数步骤。 0075 1.2.2分组及给药精密称取实施例2阿育魏果提取物、 实施例3阿育魏果提取物各 300 g， 用含10小牛血清的RPMI-1640培养基稀释成不同浓度的终浓度(0、 90、 180、 360 M)， 每孔100 L， 同时设5个平行孔/组， 重复实验5次， 获取平均值数据应用Graphpad Prism 软件计算IC50(半数抑制率)， 即阿育魏果。
37、提取物治疗PC-3M细胞24、 48、 72h后的IC50值， 同时 增设对照组。 0076 细胞增殖抑制率(OD对 照-OD治 疗)/(OD对 照-OD空 白)100。 0077 1.3指标检测MTT法检测MR对PC-3M抑制率， PI染色检测细胞形态学的变化， 免疫组 织化学法检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达， Western blot法检测细胞外调节蛋白激 酶1/2(ERK1/2)磷酸化蛋白水平。 0078 1.4统计学方法采用SPSS 13.0软件， 数据以XS表示， 组间比较采用t检验， P 0.05为差异有统计学意义。 0079 2结果 0080 2.1阿育魏果提取物。
38、给药后对PC-3M细胞抑制作用： MTT法结果显示， 不同浓度阿育 魏果提取物抑制PC-3M的作用逐渐增强， 与空白组比较差异有统计学意义(P0.01)。 此外， 随着时间的增加， 阿育魏果提取物的抑制作用不断增强， 提示阿育魏果提取物治疗有一定 的时间-剂量依赖性。 0081 2.2阿育魏果提取物给药后对PC-3M细胞组织形态学变化的作用： 不同浓度阿育魏 果提取物给药， PC-3M细胞皱缩、 脱落、 密度降低， 同时凋亡细胞计数增多。 0082 2.3阿育魏果提取物给药后对PC-3M细胞Cyclin D1表达的影响： 免疫组化结果显 示， 空白组中PC-3M细胞Cyclin D1阳性细胞数。
39、量较多， 处于激活状态。 经阿育魏果提取物给 药后， PC-3M细胞Cyclin D1阳性细胞表达明显减少， 与空白组比较差异有统计学意义(P 0.01)。 0083 Western blotting结果显示， 空白组内源性p-ERKI/2抗体水平上调， 处于过表达 状态， 经阿育魏果提取物给药后， PC-3M细胞增加的p-ERKI/2抗体表达有效地下调， 与空白 组比较差异有统计学意义(P0.01)。 0084 实验例2： 对前列腺癌DU-145细胞增殖凋亡的影响试验 0085 1材料与方法 0086 1.1材料人前列腺癌细胞株DU-145购自中国科学院上海细胞库。 阿育魏果提取物 为实施例。
40、3样品， 恩杂鲁胺为Merck公司产品， 胎牛血清、 胰蛋白酶及F12培养基均为美国 Gibco公司产品， 噻唑蓝(MTT)购白天津灏洋生物有限公司。 Annexin-V凋亡试剂盒为美国BD 公司产品。 Bcl-2兔抗人多克隆抗体和DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物制品有限公 说 明 书 6/8 页 9 CN 104887727 B 9 司。 0087 1.2实验方法 0088 1.2.1细胞培养将DU-145细胞(培养于含有90F12的培养液中)置于含10胎牛 血清， 青、 链霉素各100U/mL的培养基中， 37、 5CO2培养箱内常规培养， 每24h更换培养液 1次。 细胞90汇合时用。
41、0.25胰蛋白酶消化传代， 每周2、 3次， 取对数生长期细胞进行实 验。 0089 1.2.2细胞干预及细胞生长抑制率检测将DU-145细胞以1105/mL密度接种于96 孔培养板中， 150 L/孔， 每个浓度设6个复孔， 置于37、 5CO2培养箱内培养24h。 待细胞贴 壁后分为三组。 阿育魏果提取物组分别加人10、 100、 1000nmol/L的阿育魏果提取物； 恩杂鲁 胺组分别加入10、 20、 40、 80 mol/L的恩杂鲁胺； 联合组分为联合1、 2、 3组， 分别加入10、 100、 1000nmol/L的阿育魏果提取物及40 mol/L的恩杂鲁胺， 继续培养48h。 对。
42、照组不做特殊处 理， 每天更换F12培养基。 终止前4h每孔加入MTT溶液20 L(5g/L)， 继续培养， 终止时吸尽培 养液， 每孔加入DMSO 50 L水平摇床上振荡10min， 于酶标仪上(波长490nm)测定各孔吸光度 值(OD值)。 0090 细胞生长抑制率()1-(药物组平均OD值/对照组OD值)100。 0091 1.2.3细胞干预及细胞凋亡率检测将DU-145细胞悬液(1106个)接种于6孔培养 板中， 阿育魏果提取物加入浓度100nmol/L的阿育魏果提取物； 恩杂鲁胺组加入浓度为40 mol/L的恩杂鲁胺； 联合组加入上述两种药物(浓度同上)， 在37、 5CO2培养箱内。
43、培养 48h； 对照组不做特殊处理， 每天更换F12培养基。 收集贴壁及悬浮细胞， 1000r/min， 离心 5min， 弃上清液。 加入PBS(pH7.4)2mL洗涤， 1000r/min， 离心5min弃上清液， 将细胞重悬于 200 L Binding Buffer； 加入10 L Annexin V-FITC和5 L PI， 轻轻混匀， 避光室温反应 15min， 加入300 L Binding Buffer， 1h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 0092 1.2.4细胞干预及Bcl-2表达检测将DU-145细胞以1104/mL接种于6孔培养板中， 150 L/孔， 置于37、 5。
44、CO2培养箱内培养24h。 待细胞贴壁后， 细胞分组及干预同1.2.3。 干 预后继续培养48h， 倾去培养液， 每孔PBS洗2次， 3min/次， 每孔加4多聚甲醛2mL， 固定细胞 30min， PBS洗2min3次， 制成细胞爬片。 按照免疫组化染色试剂盒使用说明书进行操作， 以 PBS替代第一抗体作为阴性对照。 结果判定： Bcl-2阳性染色为细胞质棕黄色颗粒。 排除爬片 边缘细胞， 随机观察10个高倍视野， 计算高倍视野细胞中Bcl-2蛋白阳性细胞百分数， 取平 均值作标记指数(PI)， PI(视野中阳性细胞数)/(视野中阳性细胞数+视野中阴性细胞数) 100。 0093 1.2.5。
45、统计学方法应用SPSSl3.0统计软件进行数据处理。 计量资料以Xs表示， 组 间比较采用t检验和方差分析。 以P0.05为差异有统计学意义。 0094 2结果 0095 2.1细胞生长抑制率阿育魏果提取物、 恩杂鲁胺及二者联合应用对DU-145细胞增 殖均有明显抑制作用， 且呈时间和剂量依赖性。 各干预组细胞生长抑制率与对照组(0nmol/ L)比较， P均0.05； 联合组分别与阿育魏果提取物组及恩杂鲁胺组比较， P均0.05。 阿育 魏果提取物干预对DU-145细胞生长抑制率可达到65， 恩杂鲁胺干预对DU-145细胞生长抑 制率可达到70， 阿育魏果提取物及恩杂鲁胺联合干预对DU-14。
46、5细胞生长抑制率可达到 85。 说 明 书 7/8 页 10 CN 104887727 B 10 0096 2.2细胞凋亡率干预48h后对照组、 阿育魏果提取物组、 恩杂鲁胺组及联合组细胞 凋亡率分别为(8.281.23)、 (28.672.28)、 (29.673.67)、 (63.565.24)。 各 实验组与对照组比较， P均0.05， 联合组分别与阿育魏果提取物组、 恩杂鲁胺组比较， P均 0.05； 阿育魏果提取物组与恩杂鲁胺组比较差异无统计学意义。 0097 2.3细胞Bcl-2蛋白表达对照组、 阿育魏果提取物组、 恩杂鲁胺组及联合组Bcl-2蛋 白阳性表达率分别(71.235.38)、 (38.186.22)、 (33.555.88)、 (12.06 1.35)， 各干预组与对照组比较， P均0.05， 其中联合组分别与阿育魏果提取物组、 恩杂 鲁胺组比较， P均0.05； 阿育魏果提取物组与恩杂鲁胺组比较差异无统计学意义。 说 明 书 8/8 页 11 CN 104887727 B 11 。