技术领域
本发明涉及五子衍宗方的新用途。
背景技术
人类是通过有性繁衍的物种，生命的延续，离不开男性和女性双方的遗传信息及其载体-遗传基因。女性的卵母细胞有着女性的全部遗传基因，卵母细胞都来自卵巢。而成熟卵母细胞更是珍稀细胞，大多数妇女一生中也仅拥有400～500个。
随着医学诊断和治疗技术的不断进步，临床肿瘤患者的长期生存时间和生存质量得到提高，肿瘤患者也有年轻化趋势，但对大多数年轻女性肿瘤患者，尤其是盆腔肿瘤患者进行生殖器官的切除或者使用放疗或化疗仍然是必要的，使这些患者在很年轻时就要承受卵巢早衰甚至是丧失生育能力的风险。常规放疗和化疗方案在杀灭肿瘤细胞的同时，也直接破坏了生殖细胞，导致卵巢功能下降。加之越来越多育龄人群推迟生育，使得生育年龄的肿瘤患者，尤其是未生育的少女肿瘤患者在获得新生的同时，又不得不面临生育能力的丧失和卵巢早衰的问题。在因重大意外事件-譬如汶川大地震-而丧失亲人的不少再生育妇女，也面临同样的痛苦窘境。
目前，保护卵巢功能的方法主要有：激素疗法、药物干预、卵巢移位、卵巢组织冻存移植、卵母细胞冻存植入和胚胎冻存植入。激素疗法可外源性代替卵巢的内分泌功能，却不能改善生育能力，且有增加激素依赖性肿瘤的发生和诱发血栓的风险；药物保护和卵巢移位可短时间减少放化疗对卵巢的损害，但仍无法完全保护卵巢免受化疗药和放射线的危害；通过卵母细胞和胚胎的保存，可以收集经自然发情周期排卵，或者经化学药物诱导后实现超数排卵，并人工拾卵，随后受精；也可以通过卵巢切除术保存部分卵巢组织或保存整个卵巢，移植并收集各级卵泡组织获得卵母细胞。近四十年来，得益于辅助生殖技术—体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)、体外培养(IVC)和胚胎移植(ET)等的迅速发展，使卵母细胞及胚胎冷冻保存成为临床上最为成熟的辅助生殖技术，但因其时效性的局限，收集前需特殊处理，也无法恢复女性患者自身的卵巢分泌功能，且有法律、宗教及伦理的束缚，临床使用受到一定限制。而直接冷冻卵巢组织能保存大量不成熟卵母细胞，较之于成熟卵母细胞，不成熟卵母细胞体积小，结构简单，亚细胞器较少，代谢率低，无透明带，对低温敏感度低，不易受冷冻伤害，并且不需要刺激卵巢促卵泡成熟，可以在任何时候进行冷冻保存和移植，且不需要激素的处理，不存在伦理问题，而且可以提供生殖功能和内分泌功能的双重保障，是一种理想的保存女性生育能力的方法，也是上述方法中唯一可以完全重建卵巢功能的方法。
卵巢冻存移植，主要分为同种自体移植、同种异体移植和异种移植，其中，同种自体移植是较为常见的移植方法，它又包括卵巢自体原位移植和卵巢自体异位移植。卵巢自体原位移植是将冷冻保存卵巢组织移植到卵巢解剖部位卵巢窝或卵巢蒂的位置，手术创伤较大，对移植卵巢的观察较困难。可以恢复自然的卵巢功能，尤其是生育能力，实现自然妊娠。有报道，新鲜和冻存卵巢组织移植后，两者在术后的内分泌功能和生育能力的恢复无明显差异。已有成功自然妊娠后产下健康胎儿的报道。冷冻卵巢移植后4～8个月恢复卵巢功能，月经恢复，卵泡发育并排卵。
卵巢自体异位移植是将卵巢或卵巢组织移植到自身卵巢非正常解剖部位。移植部位有肾包膜下、肌肉、腹壁、腋窝、乳房和前臂等部位，只能恢复卵泡发育和卵巢内分泌功能，不能自然妊娠，需要借助体外受精-胚胎移植等辅助生殖技术。异位移植手术操作简单，便于检测，但卵巢移植皮下，血供较差，容易缺血坏死。将人卵巢组织移植皮下是为了便于检测移植卵巢组织卵泡发育和卵母细胞采集。有报道，移植到腹部皮下，经激素处理后，获得20个卵母细胞，其中8个采用胞浆内精子注射方法，获得一个4-细胞胚胎。移植到腹直肌的卵巢组织内分泌功能恢复，持续28周。
发明内容
本发明的目的在于提供五子衍宗方的新用途。
具体地，本发明提供了如下组合物在制备卵巢移植术术前或/和术后的辅助用药物中的用途：所述组合物的原料药包括如下重量配比的药味：
枸杞子15～50份、菟丝子15～50份、覆盆子15～25份、五味子3～7份、车前子7～13份。
进一步地，所述卵巢移植术为冻存卵巢移植手术。
更进一步地，所述冻存卵巢移植手术为冻存卵巢自体移植手术。
优选地，所述冻存卵巢自体移植手术为冻存卵巢自体异位移植手术。
其中，所述辅助用药物是提高移植卵巢的存活率，促进移植卵巢中卵泡生长，改善移植卵巢生殖能力或/和改善移植卵巢卵母细胞发育能力的药物。
进一步地，所述组合物的原料药包括如下重量配比的药味：枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
进一步地，所述组合物的原料药重量配比如下：枸杞子15～50份、菟丝子15～50份、覆盆子15～25份、五味子3～7份、车前子7～13份。
优选地，所述组合物的原料药重量配比如下：枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
本发明研究发现，在进行卵巢移植术前或/和后使用五子衍宗丸，可以促进冻存后自体移植卵巢卵泡生长发育，恢复自体移植冻存卵巢卵母细胞的发育能力，促进体外培养的未成熟卵母细胞成熟，提高体外胚胎发育的2-细胞胚胎发育率和桑葚胚发育率，对冻存后自体移植卵巢功能有良好的保护作用，可有效提高卵巢移植的成功率，为卵巢移植手术提供了一种新的辅助手段。
附图说明
图1冻存后自体异位移植第7天卵巢及邻近区域形态变化
图2冻存后自体异位移植第21天卵巢及邻近区域形态变化
图3冻存后自体异位移植第35天卵巢及邻近区域形态变化
图4回收卵巢均重变化趋势
图5冻存后自体异位移植第7天卵巢卵泡发育的组织形态学变化(HE 100x)：
图6冻存后自体异位移植第21天卵巢卵泡发育的组织形态学变化(HE 100x)：
图7冻存后自体异位移植第35天卵巢卵泡发育的组织形态学变化(HE 100x)：
图8冻存后自体异位移植第7天卵巢组织VEGF表达变化：
图9冻存后自体异位移植第21天卵巢组织VEGF表达变化：
图10冻存后自体异位移植第35天卵巢组织VEGF表达变化：
图11五子衍宗丸对冻存后自体异位移植卵巢组织细胞凋亡的影响
图12五子衍宗丸对移植卵巢卵泡及周围组织细胞凋亡的影响
图13冻存后自体异位移植卵巢与在位卵巢卵母细胞形态，其中，A：五子2-21d组卵母细胞(100x)；B：五子2-21d组MⅡ期卵母细胞(800x)；C：精子(800x)；D：在位卵巢卵母细胞(100x)；E：退化裸卵(400x)；F：PMSG-21d组卵母细胞(200x)；G：在位卵巢卵母细胞(100x)；H：MⅠ期卵母细胞(400x)；I：五子2-35d组卵母细胞(200x)；J：GV期卵母细胞(400x)。
图14回收卵母细胞数量，与模型组比较，*p＜0.05
图15补肾对移植卵巢卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响，其中，注：A：受精前卵母细胞(200x)；B：受精后卵母细胞(800x)；C：2-细胞胚胎(800x)；D：多个桑葚胚(200x)；E：
桑葚胚(800x)；F：退化的受精卵(800x)。
图16PCR扩增程序图
图17血管生成相关基因相对表达量
图18和图18续卵泡闭锁相关基因相对表达量
图19卵泡生长相关基因相对表达量
图20卵泡分化相关基因相对表达量
具体实施方式
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例1五子衍宗丸对冻存后自体异位移植小鼠卵巢体内发育的影响
卵巢为雌性哺乳动物的性腺，其主要功能为产生卵子并排卵和分泌雌性激素。卵巢中卵泡的发育始于胚胎时期，其内有大量原始卵泡形成，并进入自主发育和闭锁的轨道，直到发育期开始选择征募原始卵泡进入卵泡生长发育过程，产生成熟卵母细胞来繁殖后代，但终生仅有少量卵子在自然繁殖过程中得到利用，其余大多数卵泡通过细胞凋亡机制而自行退化。
近年来，卵巢冷冻保存技术和卵巢移植技术得到了迅速发展，在人类生殖医学领域，被认为是保存和延续女性生殖能力的一种有效方法。目前，在这一研究领域，以中医药理论和方法进行的研究报道尚不多见，本实验以肾主生殖理论为指导，研究左归丸、右归丸和五子衍宗丸对小鼠自体异位移植冻存复苏卵巢组织体内发育的影响，为发展辅助生殖领域的中医药技术积累基础资料。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
健康SPF级五周龄昆明小鼠，个体体重22-24克，购自成都达硕生物科技有限公司。合格证号：scxk(川)2008-24。适应性喂养五天，所有实验小鼠均采用自然光照，室温10～15℃，自由采食颗粒饲料和自由饮水方式饲养，随机分组进行实验。
1.1.2主要仪器与试剂
配置试剂：冷冻液：MEM+10％FBS+1.5MDMSO+0.1Msucrose；
解冻液：MEM+10％FBS+1.0MDMSO+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS+0.5MDMSO+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS
TBS液：三羟基氨基甲烷1.21g+氯化钠7.6g+优普水800ml，浓盐酸调PH值至7.2-7.4，定容至1000mlTBS-T液：TBS液+Tween 20(体积比0.05％)
抗原修复液：柠檬酸0.38g+柠檬酸三钠2.45g+优普水900ml，浓盐酸调PH值至6.0，定容至1000ml
1.2实验设计
小鼠随机分组，摘取卵巢并冻存，7天后将冻存卵巢复苏，自体移植到小鼠背部皮下。实验从卵巢移植当天开始计算天数，植入当天记为0d，分别于移植后7天、21天、35天和(或)42天回收移植卵巢，每次回收不少于六只小鼠。
本次实验中，按照补肾方药煎剂灌胃时间的不同，分为1组(灌胃6天后摘除卵巢，术后停止中药灌胃)、2组(灌胃6天后摘除卵巢，术后继续中药灌胃)和3组(摘除卵巢前不灌胃，摘除卵巢后中药灌胃)。
具体分组如下：
右归丸处理组：右归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天和(或)42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为右归1-7d组、右归1-21d组、右归2-7d组、右归2-21d组、右归2-35d组、右归3-7d组、右归3-21d组和右归2-42d组。
左归丸处理组：左归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天和(或)42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为左归1-7d组、左归1-21d组、左归2-7d组、左归2-21d组、左归2-35d组、左归3-7d组、左归3-21d组和左归2-42d组。
五子衍宗丸处理组：五子衍宗丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天和(或)42天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为五子1-7d组、五子1-21d组、五子2-7d组、五子2-21d组、五子2-35d组、五子3-7d组、五子3-21d组和五子2-42d组。
PMSG处理组：PMSG3IU每日腹腔注射，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为PMSG-7d组、PMSG-21d组和PMSG-35d组。
模型组：生理盐水每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后7天、21天、35天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢及卵泡发育。根据回收卵巢移植体的时间分为模型-7d组、模型-21d组和模型-35d组。
正常组：定期摘取卵巢观察卵巢及卵泡发育。分为正常-7d组、正常-21d组和正常-35d组。
1.3实验方法
1.3.1小鼠卵巢采集冻存和复苏
采集已编号小鼠腹腔注射1％Pentobarbital 0.25-0.3ml/只，5-10分钟四肢瘫软后，在超净台下，背部剪毛，75％酒精消毒手术部位，沿背正中线剪开皮肤，钝性分离皮下组织和肌肉组织，在背肌外缘进入腹腔，找到卵巢囊，将卵巢囊牵拉至切口外，避开血管，在卵巢囊上撕开一小口，暴露卵巢，钝性采取卵巢，即刻放入MEM培养液中，眼科镊压迫止血，对合肌层和皮下组织，缝合 皮肤。对手术后小鼠进行保温，待其苏醒后放入小鼠饲养笼中进行常规饲养，不需拆线。观察其健康状况。
冻存参照Gosden的冷冻程序，将MEM液清洗后的卵巢放入已加好1ml冷冻液的1.5ml冻存管中，4℃放置30分钟，放入程序冷冻仪中，起始温度：4℃，样品上机后，以-2℃/分钟的速率降至-7℃，soaking5分钟，人工置冰，以-0.3℃/分钟的速率降至-34℃，再以-10℃/分钟的速率降至-140℃，样品快速下机，迅速投入液氮中。
复苏将冻存管从液氮中取出，室温放置30秒，37℃水浴加温融化，在超净台下将卵巢组织依次放入解冻液中：
MEM+10％FBS+1.0MDMSO+0.1Msucrose中放置5分钟，MEM+10％FBS+0.5MDMSO+0.1Msucrose中放置5分钟，MEM+10％FBS+0.1Msucrose中放置5分钟，MEM+10％FBS中放置30分钟。
1.3.2冻存卵巢自体移植
卵巢摘除7天后行自体卵巢移植术，小鼠腹腔注射1％Pentobarbital 0.25-0.3ml/只，5-10分钟后四肢瘫软后，在超净台下，背部剪毛，75％酒精消毒手术部位，避开上次手术切口部位剪开皮肤，钝性分离皮下组织，纳入卵巢，缝合皮肤。对手术后小鼠进行保温，待其苏醒后放入小鼠饲养笼中进行常规饲养，不需拆线。观察其健康状况。
1.3.3移植卵巢回收
根据各组预定时间，每组每次取样不少于6个。先自眼眶内眦静脉丛取血，3000rpm离心10分钟，血清-40℃冰箱储存以备E2测定。小鼠断颈后，术野75％酒精消毒，取出移植卵巢并称重，用于组织学检查的卵巢放入中性福尔马林中室温保存，其余卵巢组织直接放入已用DEPC处理的冻存管中，-80℃冰箱储存，用于后续实验。
卵巢回收：取出的移植卵巢，存活，颜色红润，表面有血管分布或其周围有明显血管生长。
卵巢回收率(％)＝(回收卵巢数/移植卵巢数)×100％
1.3.4卵巢组织的脱水包埋和切片
卵巢组织经中性福尔马林液固定后，依次放入75％，80％，95％及100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明。放入60℃石蜡中浸渍，室温下冷却凝固。将石蜡块按5um的厚度连续切片，每间隔10张切片染色一张。将切片在40℃水中展平，平铺于载玻片上。将载玻片放入60℃烤箱中烤片。
1.3.5石蜡切片苏木素-伊红染色
二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，自来水洗片刻。苏木素液染核10分钟，自来水洗片刻，1％盐酸酒精分化30秒，流水冲洗片刻。复染0.5％伊红溶液染色5分钟。自来水洗片刻。逐级升浓度酒精脱水，二甲苯浸泡，中性树脂封片。光学显微镜观察。
卵泡分级标准：原始卵泡为单层扁平颗粒细胞包绕卵母细胞；初级卵泡为单层立方颗粒细胞包绕卵母细胞；次级卵泡为两层或两层以上立方颗粒细胞包绕卵母细胞；窦状卵泡为卵泡内有窦腔形成。若卵泡失去圆形或椭圆形结构，颗粒细胞缺失，出现核固缩，排列紊乱，卵母细胞核固缩，形态失常，均为形态异常的卵泡。
形态正常卵泡百分率(％)＝(形态正常卵泡/总卵泡)×100％
损伤卵泡百分率(％)＝(损伤卵泡/总卵泡)×100％
1.3.6VEGF免疫组化
烤片：将待做卵巢切片置于切片架上，60℃恒温烤箱过夜；
脱蜡：烤好的切片依次放入二甲苯Ⅰ中10分钟，之后二甲苯Ⅱ中10分钟；
水化：切片经下行酒精水化，分别在无水乙醇，95％酒精，80％酒精，75％酒精中依次浸泡各5分钟。TBS液浸泡5分钟；
微波修复抗原：先将枸橼酸抗原修复液(配制方法见1.1.2)，微波炉加热至92℃-98℃，再将切片浸入持续15分钟(注意控制好温度)。置室温下自然冷却后，自来水冲洗，优普水洗涤2×5分钟，TBS洗涤2×5分钟。
封闭：滴加封闭缓冲液，37℃湿盒孵育30分钟；
加一抗：滴加已稀释好的即用型VEGF一抗，4℃湿盒过夜；
洗涤：取出昨天过夜的湿盒，37℃复温30分钟，TBS-T洗涤3×5分钟；
封闭：滴加封闭缓冲液，37℃湿盒孵育10分钟；
加二抗：滴加生物素化羊抗兔IgG(浓度0.005mg/ml)，37℃湿盒孵育30分钟；
洗涤：TBS-T洗涤3×5分钟；
加HRP-SA：滴加HRP-SA液(浓度20nM)，37℃湿盒孵育30分钟；
洗涤：TBS-T洗涤3×5分钟，TBS洗涤2×5分钟；
显色：配制DAB工作液：计算好样本数量集中配制，每个样本用量为：50μl优普水加入2.5μl DAB-A Solution，混匀后再加入2.5μl DAB-B Solution和2.5μl DAB-C Solution，即用即配；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μl DAB工作液，室温显色反应30秒～2分钟，镜下控制反应时间，切片从显微镜上拿下来后直接入优普水终止反应并洗涤三次，每次5分钟。苏木素复染，3分钟后流水冲洗后，光学显微镜下观察并拍照。
结果判定：细胞浆内和细胞膜呈现棕黄色，明显高于背景为阳性细胞。
1.3.7TUNEL细胞凋亡原位检测分析
烤片：将待做卵巢石蜡切片置于切片架上，60℃恒温烤箱过夜；
脱蜡：烤好的石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ中10分钟，之后二甲苯Ⅱ中10分钟；
水化：切片经下行酒精水化，分别在100％无水乙醇、95％酒精、80％酒精和75％酒精中依次浸泡，每次5分钟；
洗涤：切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟；
促渗：用PBS液配制1％Triton X-100通透液，将切片浸入通透液中，室温促渗5分钟；
洗涤：切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟；
封闭：用甲醇+10％优普水+10％过氧化氢(30％)，配制封闭液，将切片浸入封闭液中，室温(15-25℃)封闭10分钟；
洗涤：切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟；
通透：计算好样本数量，集中配制Proteinase K工作液，每个样本按98μl 1×PBS加入2μl 50×Proteinase K的比例配制，即用即配，每个样本上滴加100μl Proteinase K工作液，37℃湿盒孵育30分钟；
洗涤：切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟；
制阳性片：用60μl DNaseⅠ(50U/μl)加40μl DNaseⅠBuffer制100μl含3000U的DNaseⅠ反应液，在一张样本切片上滴加100μl上述配制好的DNaseⅠ反应液，37℃湿盒孵育10分钟；
洗涤：制好的阳性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟；
TdT酶反应：配制TdT酶反应液：每样本用量：45μl Equilibration Buffer加1.0μlBiotin-11-dUTP和4.0μl TdT Enzyme，计算好样本数集中配制(阴性对照片不计)，即用即配，注意避光；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μl TdT酶反应液，放入温盒中，37℃避光湿盒孵育60分钟(注：阴性对照样本不加TdT酶反应液)；
洗涤：孵育后的切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
荧光标记：配制Streptavidin-FITC标记工作液：每个样本用量为：45ul Labeling buffer加入5ul Streptavidin-FITC标记液，计算好样本数集中配置，阴性对照片同样计入，即用即配，注意避光；样本周围用吸水纸吸干，每个样本上滴加50μl配好的Streptavidin-FITC标记工作液，放入湿盒中，37℃避光孵育30分钟。
洗涤：孵育后的切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
DAPI复染：用DAPI室温避光复染细胞核10分钟；
洗涤：孵育后的切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5分钟，注意避光；
荧光显微镜检测：激发波长450-500nm，发射波长515-565nm，上机观察拍照。
细胞凋亡：卵母细胞或颗粒细胞核为绿色荧光，明显高于背景。
卵泡凋亡率：阳性细胞卵泡与总卵泡数的比值。
卵母细胞凋亡率：卵母细胞阳性细胞与总卵泡数的比值。
颗粒细胞凋亡率：颗粒细胞阳性细胞与总卵泡数的比值。
1.3.8小鼠雌二醇定量分析(ELISA法)
所需试剂和微孔板条室温平衡30分钟后，从铝箔袋中取出所需板条，微孔架固定；设置标准品孔、样本孔和空白孔，移取90μL标准品以及样本至相应微孔中(整个加样时间控制在10分钟内)；每孔加入提前复融的冻干雌二醇HRP酶结合物10μL，充分混合10秒，25-28℃避光孵育120分钟；弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置60秒，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物溶液100μL，室温(18-24℃)避光孵育20分钟。每孔加入终止液50μL，终止酶反应，10分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
1.3.9制备中药煎剂
药材均购自成都中医药大学第二附属医院中药房。
每剂药置于1000ml烧杯中，加优普水浸泡30分钟，先大火煮沸，文火维持沸腾25分钟后滤出药汤，将三次收取的药汤浓缩后储存备用。
方剂组成
右归丸：熟地黄24份 山药12份 山茱萸9份 枸杞子12份 菟丝子12份 鹿角胶12份 杜仲12 份 肉桂6份 当归9 附子6份
左归丸：熟地24份 山药12份 枸杞子12份 山茱萸12份 川牛膝12份 菟丝子12份 鹿胶12份 龟胶12份
五子衍宗丸：枸杞子40份、菟丝子40份、覆盆子20份、五味子5份、车前子10份。
1.3.10剂量设定
按照“实验动物与人按表面积等效量换算比率”，算出小鼠的等效剂量。专人给小鼠灌服，每天一次。
各复方药物人用剂量分别参见WS3-B-0054-89(右归丸)、WS1-B-0053-89(左归丸)和《中国药典》2010版一部532页(五子衍宗丸项)。
1.4数据处理及分析
运用Microsoft Excel2007软件进行实验数据处理和作图。采用spss20统计软件进行方差分析与显著性检验。实验数据以平均值±标准差表示，对卵巢回收率进行卡方检验。
2结果
2.1小鼠术后一般状态观察
小鼠一般术后1～3小时苏醒，苏醒前注意保暖。小鼠术后未见活动异常，对外界刺激反应灵敏，进食水正常，性情温顺。手术切口愈合良好，未见渗出感染化脓等现象。
2.2补肾对自体异位移植卵巢存活及回收率的影响
本次实验共有摘除卵巢后再自体异位移植昆明小鼠246只，摘除后经冻存再自体异位移植卵巢492个。冻存移植卵巢总有效回收率为68.70％。经卡方检验，各实验组间差异统计显著性分析见表1.1和表1.2。
表1.1 移植卵巢回收率(一)
注：与模型组比较，*p＜0.01；#p＜0.05
表1.2 卵巢移植回收率(二)
注：与同期模型组比较，*p＜0.01；#p＜0.05
2.3补肾对自体异位移植卵巢及邻近区域形态变化的影响
刚离体卵巢呈典型肾形，冻存复苏后外观无明显变化，移植后7～21天，回收卵巢均呈现不同程度的萎缩。移植后第7天多呈肾形或椭圆形，未观察到泡样结构；可回收卵巢表面可见网状血管分布，或周围结缔组织形成囊包，囊内见血液渗出，与周围组织结合较牢固，剥离时出血明显；不可回收卵巢呈苍白色，表面未见明显血管分布，与周围组织未形成囊包，且与周围组织结合疏松，剥离时不出血。移植21天后多呈圆形或椭圆形，未观察到明显泡样结构；可回收卵巢表面网状血管分布更清晰可见，血样囊包结构明显减少，且与周围组织融合，剥离时出血减少；不可回收卵巢呈苍白色，表面未见明显血管分布，萎缩明显，与周围组织结合疏松，剥离时不出血。移植35天后，移植卵巢较21天略有增大，卵巢呈圆形或椭圆形，体积大小差别明显；可回收卵巢表面网状血管分布更为显见，进一步与周围组织融合，并突出于组织表面，有补肾方药组小鼠剥离出的卵巢表面呈颗粒状，有的移植卵巢表面见暗红色斑点，或为出血卵泡，可观察到明显泡样结构，与在位卵巢外观一致；不可回收卵巢较少出现。见图1～3。
2.4补肾对自体异位移植卵巢重量的影响
正常组小鼠卵巢平均重量最大，PMSG组小鼠卵巢平均重量其次，模型组小鼠卵巢平均重量最小，其余各用药组小鼠卵巢平均重量介于PMSG组和模型组之间，卵巢平均重量在移植21天前多呈下降趋势，移植后21天～42天平均重量呈上升恢复趋势。结果见图4
2.5补肾对自体异位移植卵巢卵泡发育的影响
卵巢自体异位移植第7天，各组冻存后再自体异位移植卵巢都未观察到窦状卵泡和排卵前卵泡，组织多因缺血变性坏死，呈广泛性炎性浸润；卵巢自体异位移植第21天，回收卵巢组织切片可观察到原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡等各级卵泡生长，五子衍宗丸组变化最为显著，卵泡形态正常，黄体少见；卵巢移植后第35天，各用药组回收的移植卵巢中都可观察到窦状卵泡生长，出现卵丘扩展的卵母细胞，有黄体形成，以五子衍宗丸组显著，该组小鼠移植卵巢组织中观察到多 个近排卵前卵泡。见图5～7。
2.6补肾对自体异位移植卵巢组织VEGF表达水平的影响
自体异位移植卵巢组织切片经VEGF免疫组化方法检测，移植后第七天，各组自体异位移植卵巢组织皮质及其外周组织VEGF表达都有不同程度的增加。观察21天和35天VEGF免疫组化卵巢组织切片，在各级卵泡的卵泡细胞和颗粒细胞之外的间质细胞有增强表达。在卵巢和与其包绕的纤维结缔组织中也观察到有VEGF的表达。见图8～10。
2.7补肾对自体异位移植卵巢细胞凋亡的影响
TUNEL细胞凋亡原位检测(FITC标记)观察冻存后自体异位移植卵巢组织，7d组中，细胞凋亡阳性表达面积广泛，至21天，细胞凋亡阳性表达面积随时间而逐渐缩小，间质细胞是凋亡阳性细胞分布表达的主要区域，21天和35天，卵巢生长卵泡、黄体细胞和闭锁卵泡中也可见少量凋亡阳性细胞分布表达。35天后，随着移植卵巢优势卵泡的生长发育，凋亡阳性细胞也逐渐减少。见图11～12。
2.8补肾对自体异位移植卵巢合成雌二醇的影响
用雌二醇定量分析酶联免疫检测试剂盒检测各组小鼠血清，结果：卵巢移植后第21天，五子组与模型组、左归组、右归组和PMSG组组间差异有统计学意义(p＜0.05)。见表1.3。
表1.3 移植后雌二醇(ng/ml)比较
注：与五子组比较，*p＜0.05
3讨论
3.1补肾影响冻存后自体异位移植卵巢回收率
本次实验一共有摘除卵巢再自体异位移植小鼠246只，摘除冻存移植卵巢492个。有效回收卵巢338个，冻存移植卵巢总有效回收率为68.70％。经卡方检验，受体有效率组间差异无统计学意义。
各用药组卵巢总回收率均比模型组卵巢回收率高，其中模型组与五子1组、五子2组和五子3组组间差异有统计学意义，表明五子衍宗丸可以显著提高冻存卵巢自体移植后的存活能力。五子2组与左归2组，五子1组和右归1组组间差异有统计学意义，表明不同补肾方药对冻存卵巢自体移植后的存活影响存在差异。模型组与PMSG组组间差异有统计学意义，表明PMSG可以提高冻存卵巢自体移植后的存活能力。其它各组之间差异无统计学意义。
各用药组在手术后第7、21、35天卵巢回收率均比模型组卵巢回收率高，其中模型-7d组与五子1-7d组和五子3-7d组，五子2-21d组与m21d组间差异有统计学意义，表明五子衍宗丸可以提高冻存卵巢自体移植后的存活能力，且术前灌服五子衍宗丸煎剂也可以提高移植卵巢的存活率。
在卵巢自体移植中，移植卵巢存活的主要障碍是早期血管再生时间较长，导致移植卵巢血液灌 注障碍而坏死。有学者研究认为，移植卵巢的生长可分三个阶段，1)坏死期：移植第2～4天，卵巢的原有组织因组织缺血而处于退化状态，仅边缘可见原始卵泡和腔前卵泡；2)恢复期：移植第7-14天，卵巢逐渐恢复正常结构，血清激素水平开始上升；3)发育成熟期：移植第14天以后，移植卵巢内出现发育不同阶段的卵泡、黄体和大量间质腺，激素水平开始接近正常。移植卵巢组织生长和卵泡发育与局部血管的长入有明显的相关性，认为移植卵巢血液循环系统的重新建立是移植卵巢生长发育的前提条件。自体异位移植卵巢在重新建立血管系统后才能存活和生长发育，异位移植卵巢回收率还与其自身组织大小、移植手术过程和移植部位有关。
3.2补肾影响冻存后自体异位移植卵巢存活状态
关于移植卵巢存活状态的研究较少，移植后卵巢的生长情况可以从一定程度上反映其存活状态，检测其体积或者重量的变化不失为一种有效方法。考虑到本次研究的一些具体情况，实验中仅观察了自体异位移植卵巢重量的变化趋势，而没有进一步的量化。
3.3补肾影响冻存后自体异位移植卵巢卵泡发育
卵巢移植第7天，可能是由于移植后的缺血再灌注损伤，各组移植卵巢都未观察到窦前和窦状卵泡；卵巢移植第21天，可见原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦状卵泡等各级卵泡生长，五子衍宗丸组和右归丸组窦状卵泡相对较多，卵泡直径也较大，卵泡形态正常，黄体少见；卵巢移植后第35天和42天，回收卵巢中已有较多的窦状卵泡生长，出现卵丘扩展的卵母细胞，以五子衍宗丸最为显著，右归丸组次之。由于自体异位移植，卵巢的解剖位置改变，下丘脑-垂体-卵巢轴的反馈调节机制可能会受到干扰，较难产生排卵前LH峰，从而影响移植卵巢成熟卵泡的排卵，除五子衍宗丸组和右归丸组卵巢切片见有一定数量黄体形成外，其余各组黄体少见。
VEGF在哺乳动物卵巢中广泛表达，VEGF由卵巢组织中卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞产生，为原始和初级卵泡提供营养支持，通过旁分泌作用于局部血管，促进卵泡生长中新的血管网形成。血管丰富的卵泡能够有机会汲取更多的营养发育到优势卵泡阶段，而血管不足的卵泡可能被闭锁。另外，研究发现VEGF能诱导人抗凋亡因子Bcl-2产生，减少VEGF水平可导致体外培养的卵母细胞成熟延迟，VEGF能对抗颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。在本研究中，VEGF免疫组化检测发现VEGF在自体异位移植卵巢后第7天，移植卵巢皮质VEGF表达增加，原始卵泡也有弱表达。在卵巢移植第21天和35天，随着卵泡发育，在卵巢皮质和其外围包绕的纤维结缔组织中都能观察到有VEGF的表达。卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞有弱表达，卵巢皮质间质细胞也有表达。五子2-35d组移植卵巢卵泡的卵泡细胞和颗粒细胞之外的间质细胞有典型增强表达。表明五子衍宗丸可能是通过血管生成VEGF调节通路，促进移植卵巢存活和卵泡生长发育。
细胞凋亡是与卵巢正常发育和功能相关的连续过程，哺乳动物卵巢中超过90％以上的原始卵泡和初级卵泡通过凋亡走向闭锁。虽然凋亡存在于卵巢正常发育过程中，但是冻存和复苏卵巢既有温度剧烈变化，又有冷冻保护剂对卵巢组织细胞的化学毒性作用，在加上自体异位移植后卵巢组织缺血缺氧和血流再灌注的损伤，这些因素都可能诱导或加剧凋亡发生。有报道，1％DMSO作用肝癌细胞12小时，可以促进细胞凋亡。用TUNEL细胞凋亡原位检测(FITC标记)观察移植后卵巢组织细胞凋亡，在移植卵巢组织中，早期表现为广泛的细胞凋亡。卵巢移植21后，卵巢皮质凋亡阳性表达减少，髓质是凋亡阳性细胞的主要表达部位。生长卵泡、黄体细胞和闭锁卵泡中也可见少量凋亡阳性细胞 分布表达。在卵巢移植第35天和42天，移植卵巢凋亡阳性细胞的主要表达区间进一步缩窄，间质细胞是凋亡阳性细胞分布表达的主要区域，但范围局限。随着移植卵巢卵泡的生长发育，凋亡阳性细胞也逐渐减少。
用雌二醇定量分析酶联免疫检测试剂盒检测各组小鼠血清，至卵巢移植后第21天，随着存活卵泡的生长发育，血清雌二醇水平也逐渐升高，在各用药组中，五子2-21d组血清雌二醇水平最高，且与模型-21d组、左归2-21d组、右归2-21d组和PMSG-21d组各组间有统计学意义，表明五子衍宗丸较左、右归丸更好的促进自体异位移植卵巢组织卵泡发育。
4小结
本实验通过组织形态学、VEGF免疫组化、FITC标记TUNEL细胞凋亡原位检测和激素测定等方法，初步研究了右归丸、左归丸和五子衍宗丸煎剂对自体异位移植小鼠冻存卵巢组织体内发育的影响，结果如下：
1)本次实验一共有摘除卵巢再自体异位移植小鼠246只，摘除冻存移植卵巢492个。有效回收卵巢338个，冻存移植卵巢总有效回收率为68.70％。
2)五子衍宗丸和PMSG可以显著提高冻存卵巢自体移植后的存活能力，且预防性给予五子衍宗丸可以有效提高移植卵巢的存活率，体现了中医“治未病”思想。
3)补肾可能是通过血管新生的VEGF调节通路和细胞凋亡通路两途径，有效保护小鼠自体异位移植冻存卵巢组织的卵泡发育能力。
4)五子衍宗丸、右归丸和左归丸可以促进小鼠自体异位移植冻存卵巢组织的卵泡发育，五子衍宗丸最好，右归丸次之，其中机理值得进一步研究。
试验例2补肾对冻存后自体异位移植小鼠卵巢卵母细胞体外发育的影响
卵巢组织中含有不同发育阶段的卵泡，获取卵巢卵泡或卵母细胞并体外培养是获得成熟卵母细胞的两条有效途径。经体外成熟、体外受精和胚胎移植，获得后代。回收卵母细胞的数量和质量取决于被移植卵巢维持其正常功能的程度。右归丸、左归丸和五子衍宗丸对冻存后自体异位移植的卵巢卵泡和卵母细胞的生长发育、数量、体外成熟、体外受精和胚胎发育等有何影响，目前尚未见相关的研究报道。
本次研究将小鼠冻存复苏卵巢自体异位移植，给予补肾方药右归丸、左归丸和五子衍宗丸煎剂灌胃，进行自体异位移植卵巢卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外培养，研究右归丸、左归丸和五子衍宗丸对移植冻存卵巢卵母细胞体外发育能力的影响。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
健康SPF级五周龄昆明小鼠，个体体重22-24克，购自成都达硕生物科技有限公司。合格证号：scxk(川)2008-24。适应性喂养五天，所有实验小鼠均采用自然光照条件下，室温10～15℃，自由采食颗粒饲料和自由饮水方式饲养，以同周龄雄鼠作为精子供体。
1.1.2主要仪器与试剂
配置试剂：冷冻液：MEM+10％FBS+1.5MDMSO+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS+1.0MDMSO+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS+0.5MDMSO+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS+0.1Msucrose
解冻液：MEM+10％FBS
L15*液：L15+10％SPS
1.2实验设计
以卵巢自体移植皮下为0天，分别于移植后21天和35天回收植入卵巢。
右归丸处理组：小鼠卵巢摘除术前6天开始，用右归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后21天和35天回收卵巢移植体，研究右归丸煎剂对移植卵巢卵母细胞数量、体外培养、体外受精和胚胎体外培养的影响。根据回收卵巢移植体的时间分为右归1-21d组、右归2-21d组、右归3-21d组和右归2-35d组。
左归丸处理组：小鼠卵巢摘除术前6天开始，用左归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后21天和35天回收卵巢移植体，研究左归丸煎剂对移植卵巢卵母细胞数量、体外培养、体外受精和胚胎体外培养培养的影响。根据回收卵巢移植体的时间分为左归1-21d组、左归2-21d组、左归3-21d组和左归2-35d组。
五子衍宗丸处理组：小鼠卵巢摘除术前6天开始，用五子衍宗丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后21天和35天回收卵巢移植体，研究五子衍宗丸煎剂对移植卵巢卵母细胞数量、体外培养、体外受精和胚胎体外培养的影响。根据回收卵巢移植体的时间分为五子1-21d组、五子2-21d组、五子3-21d组和五子2-35d组。
PMSG处理组：小鼠卵巢摘除术后，用孕马血清促性腺激素3IU每日腹腔注射，于卵巢移植后21天回收卵巢移植体，研究PMSG对移植卵巢卵母细胞数量、体外培养、体外受精和胚胎体外培养的影响。根据回收卵巢移植体的时间分为PMSG-21d组。
模型组：小鼠卵巢摘除术前6天开始，用生理盐水每日灌胃一次，并分别于卵巢移植后21天和35天回收卵巢移植体，观察移植后卵巢卵母细胞数量、体外培养、体外受精和胚胎体外培养的情况。根据回收卵巢移植体的时间分为模型-21d组和模型-35d组。
正常组：定期摘取卵巢观察卵母细胞数量、体外培养和体外受精的情况。分为正常-21d组和正常-35d组。
1.3实验方法
1.3.1卵巢采集和移植
同试验例1。
1.3.2移植卵巢回收和促性腺激素处理
移植卵巢回收根据各组预定时间，每组每次取样不少于6个。在超净台下，小鼠脱臼断颈后，术野75％酒精消毒，面积宜大。用备好的已高压灭菌眼科剪及镊子皮下取出卵巢，把取出的卵巢迅速放入取卵用L15*液皿中，移至体视显微镜下。
促性腺激素处理:每只小鼠于回收卵巢前48小时腹腔注射PMSG 10IU。
1.3.3卵母细胞回收
将卵巢移植体从皮下剥离出来后,放入L15*液皿中,清洗并换皿，在生物显微镜下用一次性1ml注射器针头挑破卵巢，刺破有腔卵泡,释放出卵母细胞，用制好的巴氏管将卵母细胞另移入L15*液皿中,在倒置显微镜下进行观察和形态学评价，显微照相并计数后，放置于CO2培养箱中。
统计并计算：各组小鼠卵巢
卵母细胞数量＝平均每个移植卵巢回收的卵母细胞数量；
成熟卵母细胞数量＝平均每个移植卵巢回收的MⅡ期卵母细胞数量。
1.3.4体外成熟培养
分离在L15*液中的卵母细胞，先在HTF+10％SPS液中清洗,再移入过夜平衡的HTF+10％SPS液滴培养,上盖石蜡油，CO2培养箱中培养l8小时，在倒置显微镜下观察卵母细胞成熟状况,进行显微照相。
统计并计算：
成熟率＝(经过培养后达到MⅡ期的卵母细胞数/培养前未达到MⅡ期的卵母细胞数)×100％。
1.3.5精子获能
将雄鼠脱臼断颈，迅速术野消毒，面积宜大。将已备好的眼科剪及镊子逐层进入腹腔，取出附睾尾部及部分输精管，把取出的附睾尾部及部分输精管快速地放入L15*液洗涤皿中洗涤，洗涤后转移至HTF+10％SPS液皿中。用消毒后的眼科剪剪开附睾和输精管，使精子游弋于培养液中，用移液枪将精液移入另一过夜平衡的HTF+10％SPS液培养皿内，置CO2培养箱中l小时获能。
1.3.6体外受精
用移液枪以100ul/皿的剂量将静置好的精液移至各受精皿中，将精卵相遇的受精皿放入CO2培养箱中培养4小时。在生物显微镜下，用吸管吹打除去附着的精子并清洗，再用巴氏管把精液中的卵母细胞移入另一过夜平衡HTF+10％SPS液皿中，上盖石蜡油，快速放回培养箱中，24h后观察其受精情况。
计算：
受精率＝(出现两个原核的胚胎数/受精卵母细胞数)×100％；
囊胚发育率＝(囊胚数/出现两个原核的胚胎数)×100％。
1.4数据处理及分析
运用Microsoft Excel2007软件进行实验数据处理和作图。采用spss20统计软件进行方差分析与显著性检验。对2细胞胚胎发育率、囊胚进行卡方检验。
2结果
2.1自体异位移植卵巢卵母细胞形态学观察
自体移植卵巢第21天，各组卵巢共回收卵母细胞64个，多数为退化裸卵，透明带消失，胞质颜色变深，也未见MⅡ期卵母细胞，未见生发泡。五子2-21d组自体异位移植卵巢回收卵母细胞中见GV期和MⅡ期细胞，细胞形态正常，正常-21d组卵巢回收卵母细胞以GV期细胞为主，透明带完整，生发泡清晰，多为裸卵；自体移植卵巢第35天，各组自体异位移植卵巢回收卵母细胞共69个，仍以退化裸卵为主，五子2-35组回收卵母细胞中见GV期和MⅡ期细胞，细胞形态正常。见图13。
2.2补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞发育的影响
冻存卵巢自体移植后第21天，各组共回收卵母细胞62个，五子2-21d组回收10个卵母细胞最多，左归1-21d组回收0个卵母细胞最少，模型-21d组回收1个卵母细胞；自体移植后第35天，5个移植组共回收卵母细胞69个，五子2-35d组回收24个卵母细胞最多，模型-35d组回收6个卵母细胞最少；全部组共回收卵母细胞131个。在21-35天移植期中，小鼠冻存后自体异位移植卵巢卵母细胞数量有增加的趋势。各组卵母细胞数量见图14。
2.3补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞体外培养的影响
除正常-21d组外，其余各用药组21天冻存后自体移植卵巢卵母细胞中，五子2-21d组GV期卵母细胞经体外培养18小时后，收集到MⅡ期卵母细胞；35天各组中，五子2-35d组GV期卵母细胞经体外培养18小时后，收集到MⅡ期卵母细胞，右归2-35d组GV期卵母细胞经体外培养18小时后，未收集到MⅡ期卵母细胞。见表2.1
表2.1 补肾对自体异位移植卵巢未成熟卵母细胞体外成熟的影响
2.4补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响
本次实验，在各用药组中，五子衍宗丸组小鼠自体异位移植卵巢成熟卵母细胞经体外受精后，第二天镜下能够观察到原核和第二极体，形态与同期在位卵巢体外成熟卵母细胞经体外培养受精后形成的原核和第二极体形态一致。于第4天观察到桑葚胚，未观察到囊胚。见图15和表2.2。
表2.2 补肾对冻存后自体异位移植卵巢卵母细胞体外受精后胚胎发育数量的影响
3讨论
3.1补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞回收的影响
本研究将小鼠冻存后卵巢自体异位移植，于移植后21天和35天回收移植卵巢卵母细胞，除左归1-21d组外，其余各组回收移植卵巢卵母细胞数量均比同期模型组有不同程度增加。与上节冻存后自体异位移植卵巢体内卵泡发育观察结果的趋势相一致。21天组中，五子2-21d组回收卵母细胞10枚，PMSG-21d组回收卵母细胞13枚，与模型-21d组组间差异有统计学意义，表明五子衍宗丸和PMSG有提高冻存后卵巢自体异位移植后卵母细胞数量的作用；35天组中，右归2-35d组回收卵母细胞16枚，五子2-35d组回收卵母细胞24枚，与模型-35d组组间差异有统计学意义，表明五子衍宗丸 和右归丸能提高冻存后卵巢自体异位移植后卵母细胞数量，而且五子衍宗丸在21-35天的整个移植期内都能有效提高移植卵巢卵母细胞数量。五子2-35d组与五子2-21d组，右归2-21d组与右归2-35d组组间差异有统计学意义，表明冻存卵巢自体移植后21-35天，随着时间的延长，五子衍宗丸和右归丸促进冻存后自体异位移植卵巢功能进一步恢复，使卵母细胞数量增加。
3.2补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞体外培养的影响
将小鼠冻存后卵巢自体异位移植，于移植后21天和35天分别回收移植卵巢卵母细胞，除正常组外，其余各组回收的卵母细胞多为退化裸卵，仅五子2-35d组与五子2-21d组有回收到的未成熟卵母细胞经体外培养后发育到MⅡ期，表明五子衍宗丸不仅能够提高冻存卵巢自体异位移植后卵母细胞数量，而且能够延缓小鼠冻存后自体异位移植卵巢卵母细胞的退化，有效提高移植卵巢卵母细胞的质量，可能是五子衍宗丸所具有的填精补髓、种嗣衍宗之功效的体现。
3.3补肾对自体异位移植卵巢卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响
本实验中，多数组冻存卵巢自体异位移植后回收的卵母细胞不能完成体外受精和胚胎体外发育，表明冻存复苏和自体异位移植过程对移植卵巢生殖功能和移植卵巢卵母细胞的发育能力造成了破坏。五子2-35d组与五子2-21d组未成熟卵母细胞经体外成熟、体外受精，和直接回收的MⅡ期卵母细胞进行体外受精都能完成正常的受精过程，胚胎经体外培养发育到2-细胞阶段，并进而发育到桑葚胚，表明冻存后卵巢自体异位移植后，五子衍宗丸可以有效减轻和恢复冻存后自体异位移植小鼠卵巢生殖功能和卵母细胞损伤的发育能力，但其后所有桑葚胚均未能进一步发育到囊胚期，其中机制有待进一步研究和探讨。
4小结
在体卵巢卵泡发育并产生卵母细胞的过程是通过各种信号通路，以内分泌、旁分泌和自分泌方式，由受体、生长因子和激素协调参与的复杂过程。卵巢在冻存过程中会造成各级卵泡的损伤，在移植和再移植过程中会遭受缺血再灌注损伤，较长时间的供血不足也会对各级卵泡的生长产生不利影响。移植过程还会伤及卵巢神经，神经控制卵泡卵母细胞的发育和供血。虽然冻存后卵巢自体异位移植后发生神经和血管再生，但冻存和移植过程，体外培养、体外受精和体外胚胎培养体系均可能对卵泡生长和卵母细胞发育能力造成影响。
补肾有效提高冻存后自体异位移植卵巢卵母细胞的发育能力。
1)五子衍宗丸和PMSG提高冻存后卵巢自体异位移植第21天卵母细胞数量。
2)五子衍宗丸和右归丸提高冻存后卵巢自体异位移植第35天卵母细胞数量。
3)在冻存后卵巢自体异位移植的21-35天移植期内，随着时间的延长，五子衍宗丸和右归丸促进冻存后自体异位移植小鼠卵巢功能进一步恢复，卵母细胞数量增加。
4)五子衍宗丸促进体外培养的未成熟卵母细胞成熟。
5)五子衍宗丸维持冻存后卵巢自体异位移植后的卵巢功能，恢复冻存后自体异位移植卵巢卵母细胞的发育能力，提高胚胎体外培养的2-细胞发育率和桑葚胚发育率。
试验例3补肾对冻存后自体异位移植小鼠卵巢卵泡生长发育相关基因表达的影响
在位卵巢原始卵泡经过初始募集进入发情周期，获得对促性腺激素的反应能力，对内分泌环境发生的变化产生应答而进入周期募集。经过原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦状卵泡和排卵前卵 泡几个生长阶段而排卵。
在冻存复苏后卵巢自体异位移植过程中，第一，如何减少自体异位移植后卵巢卵泡丢失。经过温度剧烈变化和冻存保护剂的细胞毒作用，冻存卵巢移植后，移植卵巢和周围组织没有血供建立，组织缺血缺氧，会损失大量卵泡，降低缺血缺氧对移植卵巢存活的不利影响，可减少卵泡损失，增加移植卵巢卵泡存活，有利于自体异位移植卵巢功能恢复。第二，如何促进自体异位移植卵巢卵泡发育。在位卵巢原始卵泡启动、卵泡发育并产生卵母细胞的过程是通过各种信号通路，以内分泌、旁分泌和自分泌方式，由受体、生长因子和激素协调参与的复杂过程。激素调节卵泡生长分化和凋亡，在卵泡逐渐发育至排卵前阶段过程中，大多数生长卵泡发生闭锁，只有极少数卵泡得以存活排卵，或卵泡黄体化形成黄体。卵泡闭锁显著降低卵泡数，也是激素控制的凋亡过程，可以发生在卵泡发育的各个阶段。通过卵泡的生长分化和凋亡机制保证实现卵巢的正常生理功能。冻存后自体异位移植的卵巢卵泡的发育于在位卵巢卵泡是否相同，右归丸、左归丸和五子衍宗丸对其有何影响，目前知之甚少。
本次实验采用Q-PCR技术比较研究冻存复苏后自体异位移植卵巢和正常卵巢中卵泡生长发育相关基因的表达变化规律，以探索右归丸、左归丸和五子衍宗丸对小鼠冻存复苏后自体异位移植卵巢卵泡发育、卵泡分化、血管生长和细胞凋亡相关基因表达的影响，从分子水平初步研究探讨冻存复苏后自体异位移植卵巢卵泡发育的规律。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
健康SPF级五周龄昆明小鼠，个体体重22-24克，购自成都达硕生物科技有限公司。合格证号：scxk(川)2008-24。适应性喂养五天，所有实验小鼠均采用自然光照条件，室温10～15℃，自由采食颗粒饲料和自由饮水方式饲养，随机分组进行实验。
1.1.2主要仪器和试剂
主要试剂
1.2实验设计
小鼠冻存卵巢自体异位移植到皮下。移植当天记为0d，分别于移植后7天、21天和35天回收移植卵巢。
本次实验中，按照中药煎剂灌胃时间的不同，分为1组(灌胃6天后摘除卵巢，术后停止中药灌胃)、2组(灌胃6天后摘除卵巢，术后继续中药灌胃)和3组(摘除卵巢前不灌胃，摘除卵巢后中药灌胃)。
右归丸处理组：右归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢自体异位移植后7天、21天和35天回收卵巢移植组织，研究冻存后自体异位移植卵巢卵泡凋亡和生长分化相关基因表达变化规律。根据回收卵巢移植组织的时间分为右归1-7d组、右归1-21d组、右归2-7d组、右归2-21d组、右归2-35d组、右归3-7d组和右归3-21d组。
左归丸处理组：左归丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢自体异位移植后7天、21天和35天回收卵巢移植组织，研究冻存后自体异位移植卵巢卵泡凋亡和生长分化相关基因表达变化规律。根据回收卵巢移植组织的时间分为左归1-7d组、左归1-21d组、左归2-7d组、左归2-21d组、左归2-35d组、左归3-7d组和左归3-21d组。
五子衍宗丸处理组：五子衍宗丸煎剂每日灌胃一次，并分别于卵巢自体异位移植后7天、21天和35天回收卵巢移植组织，研究冻存后自体异位移植卵巢卵泡凋亡和生长分化相关基因表达变化规律。根据回收卵巢移植组织的时间分为五子1-7d组、五子1-21d组、五子2-7d组、五子2-21d组、五子2-35d组、五子3-7d组和五子3-21d组。
PMSG处理组：孕马血清促性腺激素3IU每日腹腔注射，并分别于卵巢自体异位移植后7天、21天、35天回收卵巢移植组织，研究冻存后自体移植卵巢卵泡凋亡和生长分化相关基因表达变化规律。根据回收卵巢移植组织的时间分为PMSG-7d组、PMSG-21d组和PMSG-35d组。
模型组：生理盐水每日灌胃一次，并分别于卵巢自体异位移植后7天、21天、35天回收卵巢移植组织，研究冻存后自体移植卵巢卵泡凋亡和生长分化相关基因表达变化规律。根据回收卵巢移植组织的时间分为模型-7d组、模型-21d组和模型-35d组。
正常组：定期摘取卵巢观察卵巢及卵泡发育。分为正常-7d组、正常-21d组和正常-35d组。
1.3实验方法
1.3.1卵巢冻存、移植与回收
同试验例1。
1.3.2总RNA的提取
研磨组织用内切式组织匀浆器研磨已加入0.6mlTrizol试剂冻存管中的卵巢组织，注意研磨完全。
分离相位室温静止5分钟。加入0.12ml氯仿于冻存管中，用力摇匀30秒，4℃，12000rmp，离心15分钟。小心取出水相于另一新管中。
RNA沉淀加入等量异丙醇，充分混匀，从水相中沉淀RNA，4℃，12000rmp，离心10分钟。
洗涤用移液管小心移去上清，加入0.6ml75％酒精洗涤脱水，4℃，7500rmp，离心5分钟。
RNA重溶用移液管移去75％酒精溶液，室温干燥5-15分钟。加入适量DEPC处理水溶解RNA。
操作过程中戴一次性口罩和橡胶手套，所用器具提前用DEPC预处理。
1.3.3RNA定量和检测
用紫外分光光度计测定RNA在260nm和280nm波长处的吸光度，计算数量。测得RNA260nm/280nm 的吸光值，检测分析RNA的纯度。
1.3.4反转录合成cDNA
采用iScript cDNA SynthesisKit，总20ul反应体系。
42℃孵育一小时，70℃10分钟终止反应，-40℃冰箱保存。
1.3.5Q-PCR扩增检测表达水平
采用primerexpress3.0软件设计引物，经Blast检索无同源性，本次实验所用引物均由成都金杰生物公司合成。
表3.1 Q-PCR引物序列
PCR扩增
按照IQSYBR Green Supermix试剂盒说明书操作进行。
PCR反应体系：
IQSYBR Green Supermix(2x)5ul；Forward primers 0.5ul；
Reverse primers 0.5ul；cDNA template 0.05ul；H2O 3.95ul；
PCR扩增程序如图16所示。
1.3.6PCR产物分析
公式说明：
Ratio：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；
GOI：目的基因；Norm：内参基因；
E：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率。
1.4数据处理及分析
运用MicrosoftExcel2007软件进行实验数据处理和作图。采用spss20统计软件进行方差分析与显著性检验。
2结果
本次实验所提取的总RNA的OD260/OD280比值介于1.8-2.0之间，符合实验要求。经Q-PCR方法检测，本次实验各组小鼠卵巢移植卵巢均能检测出目的基因GDF-9、AMH、FSHR、LHR、VEGF、Ang2、Bax、Bcl-2、fas和fasl。
2.1补肾对移植卵巢血管生成相关基因表达的影响
VEGF：
各组VEGF mRNA表达水平与模型组比较均下调。其中，与模型-7d组比较，五子2-7d组和左归2-7d组VEGF mRNA表达水平降低，组间差异有统计学意义(p＜0.01)；与模型-21d组比较，右归2-21d组VEGF mRNA表达水平降低，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。
Ang2：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组Ang2mRNA表达水平小幅上调，左归丸组和右归丸组Ang2mRNA表达水平下调，21d组和35d组中，五子衍宗丸组、右归丸组和左归丸组Ang2mRNA表达水平均上调。与模型-21d组比较，五子2-21d组、右归2-21d组和左归2-21d组Ang2mRNA表达水平上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)；与模型-35d组比较，五子2-35d组Ang2mRNA表达水平上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)，右归2-35d组和左归2-35d组Ang2mRNA表达水平上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)。其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。见图17。
2.2补肾对移植卵巢卵泡闭锁相关基因表达的影响
Bax：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组和右归丸组Bax mRNA表达上调，左归丸组表达下调，21d组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组Bax mRNA表达均下调，35天组中，五子衍宗丸组和右归丸组Bax mRNA表达下调，左归丸组表达上调。各组之间差异均无统计学意义(p＞0.05)。
Bcl-2：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组和右归丸组Bcl-2mRNA表达上调，左归丸组表达下调， 21d组和35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组Bcl-2mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，五子2-7d组Bcl-2mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-35d组比较，五子2-35d组和右归2-35d组Bcl-2mRNA表达均上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)。其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。
Fas：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组和左归丸组Fas mRNA表达下调，右归丸组表达上调；21d组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组Fas mRNA表达均上调；35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组Fas mRNA表达均下调。各组之间差异均无统计学意义(p＞0.05)。
Fasl：
7d组中，与模型组比较，右归丸组和左归丸组Fasl mRNA表达下调，五子衍宗丸组表达上调；21d组和35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组Fasl mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，五子2-7d组和左归2-7d组组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-35d组比较，五子2-35d组、右归2-35d组和左归2-35d组组间差异有统计学意义(p＜0.01)。其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。见图18。
2.3补肾对移植卵巢卵泡生长相关基因表达的影响
AMH：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组AMH mRNA表达均上调；21d组中，五子衍宗丸组和右归丸组AMH mRNA表达上调，左归丸组表达下调；35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组AMH mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，五子2-7d组AMH mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-21d组比较，右归2-21d组AMH mRNA表达上调，差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-35d组比较，五子2-35d组和右归2-35d组AMH mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)，其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。
GDF-9：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组GDF-9mRNA表达上调，左归丸组和右归丸组表达下调；21d组中，五子衍宗丸组和右归丸组GDF-9mRNA表达上调，左归丸组表达下调；35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组GDF-9mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，五子2-7d组GDF-9mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-21d组比较，右归2-21d组GDF-9mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。见图19。
2.4补肾对移植卵巢卵泡分化相关基因表达的影响
FSHR：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组FSHR mRNA表达上调，左归丸组和右归丸组表达下调；21d组和35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组FSHR mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，五子2-7d组FSHR mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)，左归2-7d组FSHR mRNA表达下调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-35d组比较，五子2-35d 组和右归2-35d组FSHR mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)，左归2-35d组FSHR mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。
LHR：
7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组LHR mRNA表达上调，左归丸组和右归丸组LHR mRNA表达下调；21d组和35天组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组LHR mRNA表达均上调。
与模型-7d组比较，左归2-7d组LHR mRNA表达下调，组间差异有统计学意义(p＜0.05)；与模型-21d组比较，五子2-21d组和右归2-21d组LHR mRNA表达上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)；与模型-35d组比较，五子2-35d组、右归2-35d组和左归2-35d组LHR mRNA表达均上调，组间差异有统计学意义(p＜0.01)；其余各组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。见图20。
3讨论
3.1补肾对移植卵巢血管生成相关基因表达影响的机理
血管生成包括血管形成(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)两个过程。有两条调节途径参与了血管生成过程：一条是血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(flt-1等)调节通路，另一条是血管生成素(Ang)及其受体(Tie)调节通路。这两条途径协同作用，共同促进机体血管生成。
血管内皮生长因子(VEGF)是VEGF家族成员之一，是1989年从牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化出来的一类糖蛋白，分子量34～45kD，具有四种亚型，4种VEGF的生物学活性未发现明显差异。VEGF是体内重要的血管生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖、增强血管通透性的作用，与创伤组织的修复、缺血、炎症及肿瘤的发生密切相关。VEGF在缺氧、缺血刺激下表达增强。
血管生成素家族有四种亚型，血管生成素-1(Ang-1)，成体组织中Ang-1分布广泛，肌肉、前列腺、卵巢、子宫中均有表达，其表达受表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-β(TGF-β)的调控。血管生成素-2(Ang-2)，主要表达于血管内皮细胞中，在人体组织分布较为局限，正常成年人仅表达于卵巢、子宫和胎盘等富含血管的组织中。血管内皮细胞上Ang-2可以通过抑制Ang-1活化程度，形成内分泌调节环路来维持血管生长、退化的动态平衡，缺氧、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促进Ang-2表达，而Ang-1、TGF-β抑制其表达。而血管生成素-3(Ang-3)和血管生成素-4(Ang-4)尚未在卵巢组织中观察到。Tie是血管内皮细胞上特异的酪氨酸激酶型受体，包括Tie1、Tie2两种，由于尚未发现Tie1受体的配体，所以目前大多数研究都集中在Tie2受体。Tie2受体主要在血管内皮细胞表达。
Ang/Tie调节途径在成人期血管生成过程中起重要作用，Ang和VEGF有类似功能，它们在胚胎发育和多种病理过程中起协同作用，共同参与血管生成的调节过程。Ang-1与Tie2受体结合，其促血管生成的作用是诱导内皮细胞出芽形成正常的血管树样结构，并维护血管结构的稳定和完整。转基因过表达Ang-1的新生小鼠皮肤血管比正常粗大，毛细血管、小静脉数量和分支增多，血管腔变大，内皮细胞保持完整。Ang-2也可与Tie2受体结合，但Ang-2起抑制血管生成的作用。Ang-2可竞争性抑制Ang-1的促Tie2磷酸化作用。不同浓度的Ang-2可使内皮细胞上Tie2表达量减少，呈剂量依赖性，表明Ang-2是Tie2的抑制性配体。转基因过表达Ang-2鼠血管网呈广泛不连续改变，血管结构由正常树状变为虫蛀状，血管内皮细胞从血管表面分离，这些现象较Ang-1或Tie2基因敲除鼠更为严重。
血管生成是多种调节因子直接或间接作用的结果，VEGF和Ang是两种主要的促血管生成因子。 VEGF作用于血管形成早期，促进原始血管网形成，而Ang-1则作用于随后的血管改建、塑形，促进形成有空间结构的血管网。血管内皮细胞表达Ang-2是血管生成的早期信号，Ang-2能拮抗Ang-1的活化Tie2作用，当VEGF存在时，Ang-2可拮抗Ang-1促血管结构稳定的作用，消除血管基底膜和血管周围细胞对血管形成的限制，并增加血管内皮细胞对VEGF的敏感性，有利于血管出芽、生长；当VEGF缺乏时，Ang-2抑制Ang-1则有利于血管的消退。
Ang与内皮细胞凋亡关系密切。Ang-1可抑制人脐带血管内皮细胞的凋亡且呈剂量依赖关系，并且与VEGF有协同作用。大剂量的Ang-2(800μg/L)抑制内皮细胞凋亡，而小剂量Ang-2(50-400μg/L)无此效应。这种量-效关系可能是Ang-2在血管生成中作用复杂性的原因之一。
冻存后自体异位移植卵巢生长发育是以移植卵巢血液循环系统的重新建立为前提条件。自体异位移植卵巢在重新建立血管系统后才能存活和生长发育。VEGF具有促进血管内皮细胞增殖、增强血管通透性的作用，在移植卵巢组织的修复中发挥重要作用。在缺氧、缺血刺激下VEGF表达增强。本实验研究中，五子衍宗丸组、右归丸组和左归丸组在三个时间点的VEGF mRNA表达水平与模型组比较均降调。表明补肾能有效改善冻存后卵巢自体异位移植后的早期组织缺血状态，缩短卵巢组织坏死期的时间，使各补肾组卵巢组织较模型组卵巢组织更早从组织损伤坏死期进入组织恢复期，从而发挥改善移植卵巢组织血供，抑制卵巢细胞凋亡，增加卵巢存活的作用。VEGF作用于血管形成早期，促进原始血管网形成，而Ang-1则作用于随后的血管改建、塑形，当VEGF存在时，Ang-2可拮抗Ang-1促血管结构稳定的作用，消除血管基底膜和其周围细胞对血管形成的限制，增加内皮细胞对VEGF的敏感性，促进血管出芽、生长。21d组和35d组中，五子衍宗丸组、右归丸组和左归丸组Ang2mRNA表达水平较模型组均上调，同期VEGF mRNA表达水平下调，表明补肾方药干预21天和35天时，药物组异位移植卵巢组织较模型组卵巢组织，新生血管生长更良好和更稳定，卵泡生长发育良好。7d组中，与模型组比较，五子衍宗丸组Ang2mRNA表达水平小幅上调，左归丸组和右归丸组Ang2mRNA表达水平下调，表明五子衍宗丸较右归丸和左归丸对自体异位移植卵巢血管生长的影响启动更早，可能是五子衍宗丸组自体异位移植卵巢存活率最高的原因之一。
3.2补肾对移植卵巢卵泡闭锁相关基因表达影响的机理
在正常卵巢中，卵泡闭锁可以发生在卵泡发育的各个阶段。Bcl-2基因抑制细胞凋亡，而Bax基因促进细胞凋亡，二者以二聚体的形式在细胞凋亡中发挥作用，一般认为，Bcl-2/Bax的比例决定细胞生死存亡，Bcl-2/Bax比值越高则抑制细胞趋向凋亡，Bcl-2/Bax比值越低则细胞趋向凋亡。卵泡闭锁死亡受Bcl-2和Bax等的调节，Bcl-2是卵巢内一个重要的细胞存活因子，而在鼠类卵巢中决定细胞存活的关键因素是Bcl-2/Bax比值的大小。在优势卵泡生长过程中其LHR mRNA表达增加，Bcl-2mRNA表达增加，而Bax mRNA表达下降。卵巢中细胞凋亡与发情周期激素变化密切相关，卵巢Bax蛋白水平在间情期达到最高，随后至发情后期稳步下降，相反，Bcl-2蛋白水平在间情期最低，随后至发情后期稳步上升。免疫组化显示Bcl-2在排卵前健康优势卵泡中更常见，排卵后主要存在于新形成的黄体中。
Fas属Ⅰ型糖蛋白，与FasL同为肿瘤坏死因子受体家族，通常认为它们是致死基因，它们以膜分子或可溶性分子形式存在于哺乳动物机体细胞株表面介导细胞凋亡，两者的相互作用往往导致表达Fas的细胞发生凋亡。其可能机制有以下两个方面：靶细胞自身表达Fas及FasL，通过自身构象的 变化导致靶细胞凋亡；通过CTL的FasL与靶细胞表面的Fas抗原相结合，介导表达Fas的靶细胞凋亡。Fas介导早期有腔闭锁卵泡的颗粒细胞的凋亡。表达FasL的卵母细胞和(或)颗粒细胞可能通过与Fas结合诱导颗粒细胞凋亡，不过，促性腺激素(FSH和LH)能有效抑制体外培养的颗粒细胞发生Fas-FasL介导的细胞凋亡。
卵泡闭锁死亡受Bcl-2和Bax的调节，鼠类卵巢中决定细胞存活的关键因素是Bcl-2/Bax比值的大小，Bcl-2/Bax比值越高则细胞趋向存活，Bcl-2/Bax比值越低则细胞趋向凋亡。本实验研究中，TUNEL细胞凋亡原位检测(FITC标记)观察冻存后自体异位移植卵巢组织，细胞凋亡阳性表达区域随用药次数增加而面积逐渐减少。五子衍宗丸组在7d、21d和35d三个时间点的Bcl-2/Bax比值均升调，左归丸组和右归丸组在21d和35d二个时间点的Bcl-2/Bax比值均升调，表明补肾通过Bcl-2和Bax的调节通路，有效抑制冻存后自体异位移植卵巢组织细胞凋亡。7d组中，五子衍宗丸组升调Bcl-2/Bax比值，左归丸组和右归丸组降调Bcl-2/Bax比值，表明就早期抑制自体异位移植卵巢组织细胞凋亡的作用而言，五子衍宗丸较右归丸和左归丸作用更优，是五子衍宗丸组自体异位移植卵巢存活率高的通路因素之一。
本次实验中，观察各组卵巢移植第21天组织切片，五子衍宗丸组较左、右归丸组的窦状卵泡相对较多。可能是五子衍宗丸可以在早期通过VEGF旁分泌作用于局部血管，为原始和初级卵泡提供营养支持，促进卵泡生长中新的血管网形成，使其有机会汲取更多的营养发育到优势卵泡阶段，同时VEGF能诱导Bcl-2产生，使优势卵泡生长过程中，Bcl-2mRNA表达增加，而Bax mRNA表达下降，与其协同对抗颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。这可能是五子衍宗丸较左、右归丸的优势所在。
本次实验，Fas和FasL在移植卵巢内均有表达，卵巢移植7天和21天时，其变化无明显规律；在移植35天，各组FasL表达上调，但同时Fas下调。推测五子衍宗丸、左归丸和右归丸对Fas、FasL的调控影响作用不明显，可能与卵巢内的Fas、FasL低表达和FSH能有效抑制其介导的细胞凋亡有关，除了应对细胞凋亡的确切机制进一步探讨外，还应联合考虑诸如促性腺激素和血管生成因子等对其的影响，相关机制尚需进一步实验验证。
3.3补肾对移植卵巢卵泡生长相关基因表达影响的机理
AMH，是生长分化因子TGF-β家族成员，AMH是早期卵泡生长的主要调节因子。AMH表达开始于初级卵泡颗粒细胞，在腔前卵泡和早期窦状卵泡颗粒细胞中表达最高，形成卵泡腔后，仅在卵丘细胞中表达。在卵泡发育过程中，AMH对卵泡生长起重要调节作用，AMH抑制原始卵泡成为生长期卵泡，降低卵泡对FSH的敏感性。体外实验中，AMH可使新生小鼠卵巢生长卵泡数量减半，而除去AMH基因的小鼠出现原始卵泡募集加快，导致卵巢储备下降。AMH水平不受促性腺激素的影响，只反映卵泡数，是评价卵巢储备力的很好的标记。小鼠AMH水平和原始卵泡数均随年龄增长而降低，其原始卵泡库从4月龄开始减少，AMH水平开始没有变化，在小鼠生殖早期生长卵泡数保持恒定，此时，AMH水平也恒定不变。
在窦状卵泡之前，是局部旁分泌因子启动卵泡的生长，卵泡发育并不依赖促性腺激素。其中之一就是只在卵母细胞表达的GDF-9，是早期卵泡生长发育所必需。GDF-9是TGF-β超家族成员，在初级卵泡阶段，GDF-9mRNA开始表达，持续到卵泡发育成熟。无GDF-9基因的突变小鼠是不育的，表现为卵泡发育停留在初级阶段。表明卵母细胞产生的GDF-9是卵泡发育成熟所必需的。体外实验表 明GDF-9能促进初级卵泡继续发育。卵母细胞产生的GDF-9通过旁分泌作用，促进其周围颗粒细胞增殖，调节FSH依赖的卵泡功能，使其对FSH敏感而成为优势卵泡。
本实验研究中，与模型组比较，除左归-21d组AMH mRNA表达下调外，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组AMH mRNA表达均上调，且五子2-7d组差异显著。AMH表达开始于初级卵泡颗粒细胞，在卵泡发育过程中，AMH对卵泡生长起重要调节作用，其只反映卵泡数，是评价卵巢储备力的很好的标记。表明补肾能有效保护冻存后自体异位移植卵巢的原始卵泡和初级卵泡数，从而调节移植卵巢存活卵泡的生长发育。且五子衍宗丸和右归丸在保护原始卵泡储备方面，比左归丸更有优势。
只在卵母细胞表达的GDF-9，是早期卵泡生长发育所必需，GDF-9在初级卵泡阶段开始表达，通过旁分泌作用，促进其周围颗粒细胞增殖，调节FSH依赖的卵泡功能，使其对FSH敏感而成为优势卵泡，持续到卵泡发育成熟。本次实验，与模型组比较，7d、21d、和35d组中，五子衍宗丸组GDF-9mRNA均表达上调，左归丸组和右归丸组7d组表达下调，而后在21d组和35天组中表达上调。这也与五子衍宗丸组自体异位移植卵巢组织生长卵泡相对较多和该组体外实验卵母细胞回收率高相一致。表明补肾能有效促进冻存后自体异位移植小鼠卵巢组织存活卵泡发育生长，且五子衍宗丸能促进早期冻存后自体异位移植卵巢卵泡的发育。
3.4补肾对移植卵巢卵泡分化相关基因表达影响的机理
在原始卵泡生长发育至排卵的过程中，促性腺激素FSH、LH和旁分泌因子等共同调节参与其中。FSH影响早中期窦前卵泡的发育，而晚期窦前卵泡和早期窦状卵泡的正常生长成熟依赖于FSH的支持，从窦状卵泡发育到排卵则需要LH。FSH和LH分别通过结合并活化FSHR和LHR发挥作用。
FSHR只在卵巢卵泡颗粒细胞表达，介导FSH刺激卵泡成熟和颗粒细胞LHR的表达，持续至卵泡晚期。FSHR对窦状卵泡的形成和卵巢正常功能非常重要，FSHR缺乏使卵巢卵泡生长停滞于窦前阶段而使其不育。
LHR是颗粒细胞分化的标记，卵巢卵泡细胞中，膜细胞在卵泡生长期就获得LHR，而壁颗粒细胞在临近排卵前LH峰时获得LHR，FSH调控主卵泡上调LHR表达。在啮齿类动物，排卵前卵泡壁颗粒细胞表达LHR，但在卵丘细胞表达非常低，生长良好的GV期卵母细胞通过旁分泌对FSH诱导的颗粒细胞LHRmRNA表达的抑制作用比窦前卵泡卵母细胞和窦状卵泡卵母细胞大。排卵前颗粒细胞获得LHR是分化的明确标记，对LH峰的出现和启动排卵是至关重要的，LHR基因敲除小鼠卵巢卵泡发育不超过窦腔阶段，FSH不能诱导其卵泡发育和排卵，所以，除了排卵，LHR表达也是窦状卵泡发育到成熟排卵前卵泡所必需。
本实验研究中，与模型组比较，7d组中，五子衍宗丸组FSHR mRNA和LHR mRNA表达上调，左归丸组和右归丸组FSHR mRNA和LHR mRNA表达下调；21d组和35d组中，五子衍宗丸组、左归丸组和右归丸组FSHR mRNA和LHR mRNA表达均上调。表明补肾抑制移植卵巢卵泡凋亡，改善冻存卵巢自体异位移植后的卵泡存活状态，在21d和35d组，移植卵巢已存活，移植卵巢卵泡生长发育良好。7d组中，五子衍宗丸组FSHR mRNA和LHR mRNA表达上调，左归丸组和右归丸组FSHR mRNA和LHR mRNA表达下调，21d组和35d组中，五子衍宗丸组比左、右归丸组有较多窦前卵泡和窦状卵泡，体外实验，五子衍宗丸组比左、右归丸组回收到更多的卵母细胞，且五子衍宗丸组在胚胎体外培养实验中观察到2-细胞胚胎和桑葚胚，表明与左、右归丸比较，五子衍宗丸保护冻存后自体异位移植小鼠卵巢的卵泡生殖 发育能力，促进移植卵巢卵母细胞正常发育成熟。
4小结
本研究采用Q-PCR方法对冻存后自体异位移植卵巢和正常卵巢卵泡生长、卵泡分化、血管生长和细胞凋亡相关基因GDF-9、AMH、FSHR、LHR、VEGF、Ang-2、Fas、Fasl、Bax和Bcl-2mRNA的表达进行了分析，结果如下：
1)移植卵巢和正常卵巢均可检测到目的基因mRNA的表达。
2)小鼠卵巢经过冻存和自体异位移植后，其原始卵泡损失较多。
3)五子衍宗丸通过细胞凋亡Bcl-2/Bax通路和血管新生(VEGF通路和Ang通路)调节通路，改善早期小鼠自体异位移植卵巢卵泡细胞的生存状态和发育能力。
4)提前饲服五子衍宗丸煎剂可有效保护早期小鼠自体异位移植卵巢卵泡生殖发育能力。
5)小鼠冻存卵巢自体异位移植21天和35天时，五子衍宗丸、右归丸保护自体异位移植卵巢卵泡细胞的生存状态和发育能力。
6)五子衍宗丸和右归丸在保护经冻存后自体异位移植卵巢原始卵泡储备力方面，可能比左归丸更有优势。