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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810098851.2 (22)申请日 2018.01.31 (71)申请人 温州医科大学附属第二医院、 温州 医科大学附属育英儿童医院 地址 325027 浙江省温州市学院西路109号 (72)发明人 潘陈为 蔡振寨 陈未来 项璐霞 金玲湘 李杰 诸葛璐 周光耀 方佩佩 林秀珍 (74)专利代理机构 北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 代理人 赵红霞 (51)Int.Cl. A61K 35/74(2015.01) A61K 31/739(2006.01) (。
2、54)发明名称 脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模 型及构建方法 (57)摘要 本发明属于医疗药物领域， 公开了一种脂多 糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型及构建 方法， 芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的ALT和AST 生成， 同时， 组织学分析肝组织显示， 芒果苷显著 减轻LPS/GalN诱导的肝损伤。 这些结果表明芒果 苷对LPS/GalN诱导的肝损伤保护作用。 芒果苷显 著抑制LPS/GalN诱导的TNF-， IL-1， iNOS， MCP-1和RANTES的产生。 本发明表明芒果苷通过 抑制氧化应激， 细胞凋亡和炎症反应来保护LPS/ GalN诱导的肝损伤。 芒果苷通过激活N。
3、rf2/HO-1 信号通路并抑制NLRP3炎性体激活来保护免受 LPS/GalN诱导的肝损伤。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 108392497 A 2018.08.14 CN 108392497 A 1.一种脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型， 其特征在于， 所述脂多糖D氨基 半乳糖诱导肝损伤保护动物模型为雄性BALB/c小鼠20-25g； 小鼠被置于一个温度和湿度控 制的一个房间里， 用无菌水和食物喂养； 通过腹腔注射LPS(50 g/kg)与D-GalN(800mg/kg) 联合建立急性肝损伤模型； 将两只小鼠随机分为6组： 对照组， 芒果苷(20mg/kg)组， L。
4、PS/ GalN组和芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组； 小鼠的对照组给予等量生理盐水； LPS/ GalN组小鼠给予50 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN； 芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组的 小鼠在LPS/GalN攻击后1小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)； LPS/GalN攻击后8h， 收集血液 和肝组织进行后续分析。 2.一种如权利要求1所述脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型的构建方法， 其 特征在于， 所述脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型的构建方法包括以下步骤： 步骤一， 将小鼠随机分为6组： 对照组。
5、， 芒果苷(20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷(5,10 和20mg/kg)+LPS/GalN组； 小鼠的对照组给予等量生理盐水； LPS/GalN组小鼠给予50 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN； 芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻击后1 小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)； LPS/GalN攻击后8h， 收集血液和肝组织进行后续分析； 步骤二， 从雄性C57BL/6小鼠中分离原代肝细胞； 将细胞悬浮在含有10胎牛血清， 100 单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中， 并在37下用5CO2。
6、培养； 细胞用不同浓度的 芒果苷处理1小时， 用LPS刺激24小时； 步骤三， 肝组织用4多聚甲醛固定并包埋在石蜡中， 将组织切成每片5 m的厚度， 切片 用苏木精-伊红染色， 以评估肝组织病理学变化； 步骤四， 血清ALT和AST， 血液样本收集和保存在4下2h， 样品4下以3000rpm离心10 分钟后收集血清， 根据制造商的说明书， 使用检测试剂盒检测血清中ALT和AST水平； 步骤五， MDA和ROS含量测定， 检测到相对肝脏ROS水平， 根据制造商的说明书， 使用MDA 检测试剂盒通过硫代巴比妥酸反应物质法检测肝脏MDA的含量。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 108392。
7、497 A 2 脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型及构建方法 技术领域 0001 本发明属于医疗药物领域， 尤其涉及一种脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动 物模型及构建方法。 背景技术 0002 急性肝损伤是由出血性坏死和肝细胞凋亡引起的危及生命的综合征， 这是一种与 高死亡率相关的破坏性综合征。 据报道， 革兰氏阴性菌的膜成分LPS在引发内毒素的过程中 起着关键作用。 GalN能够在几小时内放大LPS诱导的肝损伤作用。 LPS和GalN诱导的小鼠急 性肝损伤与临床急性肝损伤相似， 已被用作有希望的实验模型。 LPS和GalN可诱导产生各种 炎症细胞因子， 如IL-1 和TNF- ， 这。
8、些炎症细胞因子可导致肝细胞凋亡和肝损伤。 除肝移植 以外， 目前还没有有效的预防和治疗方法。 因此， 迫切需要开发急性肝损伤的新疗法。 芒果 苷是一种取自芒果叶的葡萄糖呫吨酮， 具有抗炎和抗氧化作用。 亦有研究表明， 其能够抑制 活化的大鼠小胶质细胞产生炎症介质， 并抑制巨噬细胞中LPS诱导产生一氧化氮。 有研究表 明， 芒果苷减弱了2,3,4-三硝基苯磺酸(TNBS)在小鼠中诱发的结肠炎和小鼠中LPS诱导的 脑损伤。 此外， 芒果苷可以减轻小鼠败血症引起的急性肾损伤。 然而， 芒果苷对LPS/GalN诱 导的急性肝损伤的作用尚不清楚。 本发明的目的是探讨芒果苷对LPS/GalN诱导的肝损伤的。
9、 保护作用和机制。 0003 综上所述， 现有技术存在的问题是： 芒果苷具有抗炎作用， 然而其对肝损伤的保护 效果和机制仍不清楚。 发明内容 0004 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保 护动物模型及构建方法。 0005 本发明是这样实现的， 一种脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型， 所述本 发明实施例提供的脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型为雄性BALB/c小鼠20- 25g； 小鼠被置于一个温度和湿度控制的一个房间里， 用无菌水和食物喂养； 通过腹腔注射 LPS(50 g/kg)与D-GalN(800mg/kg)联合建立急性肝损伤模型； 将。
10、两只小鼠随机分为6组： 对 照组， 芒果苷(20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组； 小鼠的对 照组给予等量生理盐水； LPS/GalN组小鼠给予50 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN； 芒果苷(5, 10和20mg/kg)+LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻击后1小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)； LPS/GalN攻击后8h， 收集血液和肝组织进行后续分析。 0006 本发明的另一目的在于提供一种所述脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模 型的构建方法， 所述脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物。
11、模型的构建方法包括以下步 骤： 0007 步骤一， 将小鼠随机分为6组： 对照组， 芒果苷(20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷 (5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组； 小鼠的对照组给予等量生理盐水； LPS/GalN组小鼠给予50 说 明 书 1/6 页 3 CN 108392497 A 3 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN； 芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻 击后1小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)； LPS/GalN攻击后8h， 收集血液和肝组织进行后续 分析； 0008 步骤二， 从雄性。
12、C57BL/6小鼠中分离原代肝细胞； 将细胞悬浮在含有10胎牛血 清， 100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中， 并在37下用5CO2培养； 细胞用不同 浓度的芒果苷处理1小时， 用LPS刺激24小时； 0009 步骤三， 肝组织用4多聚甲醛固定并包埋在石蜡中， 将组织切成每片5 m的厚度， 切片用苏木精-伊红染色， 以评估肝组织病理学变化； 0010 步骤四， 血清ALT和AST， 血液样本收集和保存在4下2h， 样品4下以3000rpm离 心10分钟后收集血清， 根据制造商的说明书， 使用检测试剂盒检测血清中ALT和AST水平； 0011 步骤五， MDA和ROS含量测。
13、定， 检测到相对肝脏ROS水平， 根据制造商的说明书， 使用 MDA检测试剂盒通过硫代巴比妥酸反应物质法检测肝脏MDA的含量。 0012 本发明结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的ALT和AST生成， 同时， 组织学分 析肝组织显示， 芒果苷显著减轻LPS/GalN诱导的肝损伤。 这些结果表明芒果苷对LPS/GalN 诱导的肝损伤的保护作用。 据报道， 氧化应激和炎症细胞因子是导致肝损伤的主要因素。 LPS具有诱导炎症反应的能力， 导致炎症介质如NO， TNF- 和IL-1 的产生。 这些炎症介质诱 导炎症性级联并导致肝损伤。 MCP-1和RANTES是在调节嗜中性粒细胞浸润中发挥关键。
14、作用 的重要趋化因子。 在本发明中， 结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的TNF-， IL-1， iNOS， MCP-1和RANTES的产生。 本发明表明芒果苷通过抑制氧化应激， 细胞凋亡和炎症反应 来保护LPS/GalN诱导的肝损伤。 芒果苷通过激活Nrf2/HO-1信号通路并抑制NLRP3炎性体激 活来保护免受LPS/GalN诱导的肝损伤。 附图说明 0013 图1是本发明实施提供的脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型的构建方 法流程图。 具体实施方式 0014 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此。
15、处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0015 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。 0016 本发明实施例提供的脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型为雄性BALB/c 小鼠(20-25g)； 小鼠被置于一个温度和湿度控制的一个房间里， 用无菌水和食物喂养； 通过 腹腔注射LPS(50 g/kg)与D-GalN(800mg/kg)联合建立急性肝损伤模型。 将两只小鼠随机分 为6组： 对照组， 芒果苷(20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组。 小鼠的对照组给予等量生理盐水。 LPS/Ga。
16、lN组小鼠给予50 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN。 芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻击后1小时， 给予芒果苷(5,10和 20mg/kg)。 LPS/GalN攻击后8h， 收集血液和肝组织进行后续分析。 0017 如图1所示， 本发明实施例提供的脂多糖D氨基半乳糖诱导肝损伤保护动物模型的 说 明 书 2/6 页 4 CN 108392497 A 4 构建方法包括以下步骤： 0018 S101： 将小鼠随机分为6组： 对照组， 芒果苷(20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷(5, 10和20mg/kg)+LPS/Gal。
17、N组。 小鼠的对照组给予等量生理盐水。 LPS/GalN组小鼠给予50 g/ kg LPS和800mg/kg D-GalN。 芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻击 后1小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)。 LPS/GalN攻击后8h， 收集血液和肝组织进行后续分 析； 0019 S102： 从雄性C57BL/6小鼠中分离原代肝细胞(Seglen， 1976)。 将细胞悬浮在含有 10胎牛血清(FBS)， 100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中， 并在37下用5CO2 培养。 细胞用不同浓度的芒果苷处理1小时， 然后用。
18、LPS刺激24小时； 0020 S103： 肝组织用4多聚甲醛固定并包埋在石蜡中， 然后将组织切成每片5 m的厚 度， 切片用苏木精-伊红(H&E)染色， 以评估肝组织病理学变化。 0021 S104： 血清ALT和AST， 血液样本收集和保存在4下2h， 样品4下以3000rpm离心 10分钟后收集血清， 根据制造商的说明书， 使用检测试剂盒检测血清中ALT和AST水平； 0022 S105： MDA和ROS含量测定， 检测到相对肝脏ROS水平， 根据制造商的说明书， 使用 MDA检测试剂盒通过硫代巴比妥酸反应物质法(TBARS)检测肝脏MDA的含量。 0023 下面结合实验对本发明的应用原。
19、理作进一步的描述。 0024 一、 实验步骤： 0025 动物和实验设计 0026 雄性BALB/c小鼠(20-25g)获自温州医科大学动物实验中心(中国温州)。 这些小鼠 被置于一个温度和湿度控制的一个房间里， 用无菌水和食物喂养。 所有实验均按照美国国 家卫生研究院建立的 “实验动物护理和使用指南” 进行。 通过腹腔注射LPS(50 g/kg)与D- GalN(800mg/kg)联合建立急性肝损伤模型。 将两只小鼠随机分为6组： 对照组， 芒果苷 (20mg/kg)组， LPS/GalN组和芒果苷(5,10和20mg/kg)+LPS/GalN组。 小鼠的对照组给予等量 生理盐水。 LPS/。
20、GalN组小鼠给予50 g/kg LPS和800mg/kg D-GalN。 芒果苷(5,10和20mg/kg) +LPS/GalN组的小鼠在LPS/GalN攻击后1小时， 给予芒果苷(5,10和20mg/kg)。 LPS/GalN攻击 后8h， 收集血液和肝组织进行后续分析。 0027 细胞培养和治疗 0028 如上所述， 从雄性C57BL/6小鼠中分离原代肝细胞。 将细胞悬浮在含有10胎牛血 清(FBS)， 100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中， 并在37下用5CO2培养。 细胞 用不同浓度的芒果苷处理1小时， 然后用LPS刺激24小时。 0029 组织学分析 0030。
21、 肝组织用4多聚甲醛固定并包埋在石蜡中， 然后将组织切成每片5 m的厚度， 切 片用苏木精-伊红(H&E)染色， 以评估肝组织病理学变化。 0031 血清ALT和AST 0032 血液样本收集和保存在4下2h， 样品4下以3000rpm离心10分钟后收集血清， 根 据制造商的说明书， 使用检测试剂盒(南京建城生物工程研究所)检测血清中ALT和AST水 平。 0033 MDA和ROS含量测定 0034 如上所述， 检测到相对肝脏ROS水平， 根据制造商的说明书， 使用MDA检测试剂盒 说 明 书 3/6 页 5 CN 108392497 A 5 (Beyotime， China)通过硫代巴比妥酸。
22、反应物质法(TBARS)检测肝脏MDA的含量。 0035 ELISA 0036 根据制造商的说明书， 使用ELISA试剂盒(eBioscience， San Diego， CA， USA)测试 血清、 肝组织和培养上清液中TNF- 和IL-1 的水平。 根据制造商的说明书， 使用ELISA试剂 盒(eBioscience， San Diego， CA， USA)测试肝组织中MCP-1和RANTES的水平。 0037 蛋白质印迹分析 0038 根据制造商的方案， 使用蛋白质提取试剂盒(Thermo)提取肝组织的细胞核和细胞 质蛋白， 通过12SDS-PAGE分离等量的蛋白质并转移到PVDF膜上。。
23、 用5脱脂奶粉封闭后， 在4下用一抗检测膜过夜。 然后用辣根过氧化物酶缀合的二级抗体在37下检测膜1小 时。 洗涤3次后， 用ECL Western印迹试剂检测膜。 0039 统计分析 0040 数据显示为平均值S.E.M.的三个独立实验， 根据Tukey-kramer检验， 通过单因 素方差分析多个治疗组之间的差异。 结果在P0.05或P98)购自郑州狮子生物科技有限公司。 从 eBioscience(San Diego， CA， USA)获得TNF- ， IL-1 ， MCP-1和RANTES ELISA试剂盒。 ALT和 AST测定试剂盒由南京建城生物工程研究所提供。 针对NF- B， 。
24、I B， NLRP3， ASC， IL-1， TXNIP， caspase-1， HO-1， Nrf2， iNOS和 -肌动蛋白的抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc(Santa Cruz， CA， USA)。 所有其他试剂均为分析度。 0042 二、 实验结果： 0043 1、 芒果苷对LPS/GalN诱导的肝组织病理学变化的影响 0044 通过H&E染色检测芒果苷对LPS/GalN诱导肝组织病理学变化的影响。 如图1所示， 对照组和芒果苷组的肝组织均显示为肝脏正常结构。 LPS/D-GalN组的肝组织病理改变明 显， 包括大量出血， 坏死和嗜中性粒细胞浸润。 但。
25、芒果苷的治疗显著降低了LPS/D-GalN诱导 的病理变化， 特别是在20mg/kg的剂量下。 芒果苷治疗改善肝组织， 表现为炎症细胞浸润明 显减少， 肝小叶结构恢复。 0045 2、 芒果苷对LPS/GalN诱导的血清ALT和AST水平的影响 0046 为了研究芒果苷对LPS/GalN诱导的肝损伤的影响， 本发明检测了血清ALT和AST水 平。 对照组相比， 芒果苷不影响血清ALT和AST水平， LPS/D-GalN显著上调血清ALT和AST水 平。 然而， 芒果苷的治疗以剂量依赖的方式抑制LPS/GalN诱导的ALT和AST水平。 0047 3、 芒果苷对LPS/GalN诱导的MDA和RO。
26、S含量的影响 0048 在本发明中检测到芒果苷对LPS/GalN诱导的肝脏MDA和ROS含量的影响。 与对照组 相比， LPS/D-GalN治疗组的肝脏MDA和ROS水平显著升高， 而芒果苷剂量依赖性地抑制LPS/ GalN诱导的肝脏MDA和ROS水平。 0049 4、 芒果苷对LPS/GalN诱导血清和肝脏产生TNF- ,IL-1,MCP-1,and RANTES的影 响， 通过ELISA检测血清和肝脏炎症细胞因子TNF- 和IL-1 的产生。 与对照组相比， 芒果苷 不影响血清和肝脏TNF- ， IL-1 ， MCP-1和RANTES的水平， LPS/GalN治疗组血清和肝脏TNF- ， 。
27、IL-1 ， MCP-1， RANTES水平明显升高， 但同时， 芒果苷治疗剂量依赖性抑制LPS/GalN诱导 的TNF- ， IL-1 ， MCP-1和RANTES产生。 说 明 书 4/6 页 6 CN 108392497 A 6 0050 5、 芒果苷对LPS/GalN诱导的肝脏iNOS表达的影响 0051 通过Western印迹分析检测肝脏iNOS的表达。 与对照组比较， LPS/GalN组肝脏iNOS 表达明显升高， 而芒果苷的治疗以剂量依赖的方式抑制LPS/GalN诱导的iNOS表达。 0052 6、 芒果苷抑制原代肝细胞中LPS诱导的TNF- 和IL-1 产生 0053 通过EL。
28、ISA检测培养上清液中炎症细胞因子TNF- 和IL-1 的产生。 LPS显著上调 TNF- 和IL-1 水平， 而芒果苷以剂量依赖的方式抑制LPS诱导的TNF- 和IL-1 产生。 0054 7、 芒果苷对Nrf2和HO-1表达的影响 0055 为了研究芒果苷的抗氧化机制， 本发明测定芒果苷对Nrf2和HO-1表达的影响。 LPS/GalN上调Nrf2和HO-1的表达， 并且这些Nrf2和HO-1表达的增加是通过被芒果苷增加产 生的。 0056 8、 芒果苷对NLRP3， ASC和caspase-1表达的影响 0057 据报道NLRP3炎症细胞在IL-1 的成熟中起关键作用。 在本发明中， 芒。
29、果苷对 NLRP3， ASC和caspase-1表达的影响通过Westernblotting检测。 LPS/GalN显著上调NLRP3， ASC和caspase-1(p10)的表达， 而芒果苷的治疗以剂量依赖的方式抑制LPS/GalN诱导的 NLRP3， ASC和caspase-1(p10)表达。 0058 LPS/GalN诱导的急性肝损伤模型被广泛用于阐明肝保护试剂的功效。 据报道芒果 苷具有抗炎和抗氧化作用。 在本发明中， 芒果苷对小鼠LPS/GalN诱导的肝损伤的保护作用， 结果表明芒果苷通过激活Nrf2途径并抑制NLRP3炎症细胞活化来减弱LPS/GalN诱导的肝损 伤。 0059 本。
30、发明结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的ALT和AST生成， 同时， 组织学分 析肝组织显示， 芒果苷显著减轻LPS/GalN诱导的肝损伤。 这些结果表明芒果苷对LPS/GalN 诱导的肝损伤的保护作用。 据报道， 氧化应激和炎症细胞因子是导致肝损伤的主要因素。 LPS具有诱导炎症反应的能力， 导致炎症介质如NO， TNF- 和IL-1 的产生。 这些炎症介质诱 导炎症性级联并导致肝损伤。 MCP-1和RANTES是在调节嗜中性粒细胞浸润中发挥关键作用 的重要趋化因子。 本发明的研究结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的TNF- ， IL-1 ， iNOS， MCP-1和RANT。
31、ES的产生。 0060 由于ROS引起的氧化应激与肝损伤的发病机制有关， MDA是脂质过氧化反应最常用 的指标之一， 用于评估本发明中的氧化应激。 我们的结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱 导的ROS和MDA产生， 可以减弱LPS/GalN诱导的氧化应激。 NLRP3炎症小体参与肝损伤的发病 机制， 一旦激活， NLRP3招募适配器ASC， 又招募procaspase-1。 Procaspase-1导致炎症细胞 因子IL-1 的成熟。 为了研究芒果苷的抗炎机制， 检测了芒果苷对LPS/GalN诱导的NLRP3炎 症表达的影响， 结果表明芒果苷显著抑制LPS/GalN诱导的NLRP3， A。
32、SC， caspase-1的表达。 转 录因子Nrf2在氧化应激酶基因如HO-1， 谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白的协调诱导中起 重要作用。 Nrf2的激活被认为是细胞保护剂的重要分子靶点。 研究表明， 氧化损伤在肝损伤 的发病机制中起重要作用， 可能代表治疗目标。 为了研究芒果苷的抗氧化机制， 检测了芒果 苷对Nrf2和HO-1表达的影响， 结果表明芒果苷增强了LPS/GalN诱导的Nrf2和HO-1表达。 因 此， 芒果苷的抗氧化机制是通过激活Nrf2/HO-1信号通路。 总之， 本发明表明芒果苷通过抑 制氧化应激， 细胞凋亡和炎症反应来保护LPS/GalN诱导的肝损伤。 芒果苷通过激活Nrf2/ HO-1信号通路并抑制NLRP3炎性体激活来保护免受LPS/GalN诱导的肝损伤。 说 明 书 5/6 页 7 CN 108392497 A 7 0061 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 6/6 页 8 CN 108392497 A 8 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 9 CN 108392497 A 9 。