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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610030840.1 (22)申请日 2016.01.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105663040 A (43)申请公布日 2016.06.15 (73)专利权人 中国人民解放军第一七五医院 地址 363000 福建省漳州市漳华中路269号 (72)发明人 唐庆林 赖敏灵 郭以和 费燕 陈钟 苏军凯 张鸣青 (74)专利代理机构 厦门市首创君合专利事务所 有限公司 35204 代理人 李雁翔 (51)Int.Cl. A61K 9/107(200。
2、6.01) A61K 31/4375(2006.01) A61K 47/34(2017.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 5/00(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 101103978 A,2008.01.16, CN 102342935 A,2012.02.08, CN 102702190 A,2012.10.03, Monika Megyesi,et alConsiderable fluorescence enhancement upon sup。
3、ramolecular complex formation between berberine and p-sulfonated calixarenes. Chemical physics letters .2006,第424卷 71-76. 康彩艳等.荧光桃红-小檗碱缔合微粒体系 的光谱特性研究及分析应用. 光谱学与光谱分 析 .2004,第24卷(第9期),1089-1092. 审查员 齐丹丹 (54)发明名称 一种小檗碱纳米复合物及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种小檗碱纳米复合物及其 制备方法， 将苯乙烯-马来酸酐交替共聚物溶于 N,N-二甲基甲酰胺和三乙胺中， 加入小檗碱， 。
4、搅 拌过夜； 加入碳酸氢钠的饱和水溶液； 干燥后复 溶于水中， 超声处理， 即得所述之小檗碱纳米复 合物； 本发明通过将小檗碱与聚苯乙烯马来酸酐 形成高分子纳米复合物， 可以增加小檗碱的生物 膜透过能力， 提高小檗碱的生物利用度， 具有广 泛的应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 105663040 B 2018.08.10 CN 105663040 B 1.一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 室温下， 将分子量为1000025000 的苯乙烯-马来酸酐交替共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺和三乙胺中， 再加入小檗碱， 搅拌过 夜； 加入碳酸氢钠的饱和水溶液， 再次搅。
5、拌0.51.5h后； 除去分子量在4000kD以下的物质， 冷冻干燥或真空干燥， 将干燥后的固体溶于水中制成911mg/ml的溶液， 超声处理35 45min， 即得所述之小檗碱纳米复合物； 所述苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、 N,N-二甲基甲酰 胺、 三乙胺、 小檗碱、 碳酸氢钠的饱和水溶液的配方比例为1.82.2g： 911ml： 0.9 1.1ml： 480520mg： 4.85.2ml。 2.根据权利要求1所述的一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 所述苯乙 烯-马来酸酐交替共聚物、 N,N-二甲基甲酰胺、 三乙胺、 小檗碱、 碳酸氢钠的饱和水溶液的配 方比例为2g： 10ml。
6、： 1ml： 500mg： 5ml。 3.根据权利要求1所述的一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 所述苯乙 烯-马来酸酐交替共聚物的分子量为20000。 4.根据权利要求1所述的一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 采用透析袋 除去分子量在3500kD以下的物质。 5.根据权利要求1所述的一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 所述小檗碱 纳米复合物为微束结构。 6.根据权利要求1所述的一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 其特征在于： 所述小檗碱 纳米复合物可进入细胞， 定位于细胞内溶酶体。 7.权利要求1至6中任一项所述的制备方法所制备的小檗碱纳米复合物的制药用途。
7、。 8.一种小檗碱纳米复合物， 其特征在于： 所述小檗碱纳米复合物为微束结构， 可定位于 细胞内溶酶体， 该小檗碱纳米复合物由苯乙烯-马来酸酐交替共聚物与小檗碱在N,N-二甲 基甲酰胺和三乙胺中反应形成， 且小檗碱包埋于苯乙烯-马来酸酐交替共聚物中。 9.根据权利要求8所述的一种小檗碱纳米复合物的制药用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105663040 B 2 一种小檗碱纳米复合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于医药卫生领域， 涉及小檗碱的新剂型， 具体涉及一种小檗碱纳米复合 物及其制备方法。 背景技术 0002 小檗碱(berberine， BBR， Berb)，。
8、 是多种中草药如黄连、 黄芩等有效成份之一。 临床 上用来治疗急慢性胃肠炎等胃肠疾病， 历史悠久， 疗效确切。 近年来研究表明， 小檗碱具有 抗肿瘤、 抗心律失常、 降血脂、 降血糖、 改善胰岛素抵抗、 预防血管狭窄、 治疗阿尔茨海默病 等作用， 适用范围广， 而且小檗碱是目前中药中为数不多的可以人工合成的小分子化合物。 0003 但是小檗碱目前仍未广泛运用于临床， 目前研究表明， 小檗碱属于季铵型异喹啉 类生物碱， 呈强碱性， 荷正电， 由于其溶解度低， 生物膜透过性差， 口服吸收不佳， 且易被胃 肠道中的蛋白吸附而影响吸收， 造成难于达到发挥药理作用的有效浓度， 生物利用度极低， 严重限制。
9、了小檗碱在临床重大疾病中的运用。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供了一种小檗碱纳米复合物及其 制备方法， 通过将小檗碱与聚苯乙烯马来酸酐形成高分子纳米复合物， 增加小檗碱的生物 膜透过能力， 提高小檗碱的生物利用度， 具有广泛的应用前景。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是： 0006 一种小檗碱纳米复合物的制备方法， 室温下， 将分子量为1000025000的苯乙烯- 马来酸酐交替共聚物溶于N,N-二甲基甲酰胺和三乙胺中， 再加入小檗碱， 搅拌过夜； 加入碳 酸氢钠的饱和水溶液， 再次搅拌0.51.5h后； 除去分子量在4000kD以下的物。
10、质， 冷冻干燥 或真空干燥， 将干燥后的固体溶于水中制成911mg/ml的溶液， 超声处理3545min， 即得 所述之小檗碱纳米复合物； 所述苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、 N,N-二甲基甲酰胺、 三乙胺、 小檗碱、 碳酸氢钠的饱和水溶液的配方比例为1.82.2g： 911ml： 0.91.1ml： 480 520mg： 4.85.2ml。 0007 一实施例中： 所述苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、 N,N-二甲基甲酰胺、 三乙胺、 小檗 碱、 碳酸氢钠的饱和水溶液的配方比例为2g： 10ml： 1ml： 500mg： 5ml。 0008 一实施例中： 所述苯乙烯-马来酸酐交替共聚物的分子量为2。
11、0000。 0009 一实施例中： 采用透析袋除去分子量在3500kD以下的物质。 0010 一实施例中： 所述小檗碱纳米复合物为微束结构。 0011 一实施例中： 所述小檗碱纳米复合物可进入细胞， 定位于细胞内溶酶体。 0012 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是： 0013 上述的小檗碱纳米复合物的制备方法的制药用途。 0014 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是： 0015 一种小檗碱纳米复合物， 所述小檗碱纳米复合物为微束结构， 可定位于细胞内溶 说 明 书 1/4 页 3 CN 105663040 B 3 酶体， 该小檗碱纳米复合物由聚苯乙烯马来酸酐与小檗碱在N,N-。
12、二甲基甲酰胺和三乙胺中 反应形成， 且小檗碱包埋于苯乙烯-马来酸酐交替共聚物中。 0016 本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是： 0017 上述的小檗碱纳米复合物的制药用途。 0018 本技术方案与背景技术相比， 它具有如下优点： 0019 本发明的要点在于各组分的摩尔比及制备方法， 小檗碱属于异喹啉类生物碱， 荷 正电， 聚苯乙烯马来酸酐的亲水部分荷负电， 在结合中正负电荷因静电引力而相互结合； 同 时小檗碱和聚苯乙烯马来酸酐各自的亲水部分被疏水的基团取代， 致使纳米复合的化合物 的水溶性降低而析出沉淀， 从而促使反应向生成复合物的方向进行， 增加了反应转化率， 且 大量沉淀析出， 。
13、易于清洗收集， 干燥后即可得到小檗碱纳米复合物。 该小檗碱纳米复合物可 以增加小檗碱的生物膜透过能力， 可提高小檗碱的生物利用度， 扩展了小檗碱的临床应用 范围， 有望用于多种肿瘤、 消化道、 内分泌、 心脑血管系统的急慢性疾病的治疗。 附图说明 0020 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 0021 图1为dRB的分子结构式。 0022 图2为小檗碱的分子结构式。 0023 图3为本发明实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb的合成反应式示意图， 其中 五角星代表dRB， 三角形代表小檗碱。 0024 图4为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb的紫外表征结果示意图， 横坐。
14、标为 波长， 纵坐标为吸收度。 0025 图5为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb在pH值为7时的平均粒径示意图。 0026 图6为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb在pH值为7时的Zeta电势示意图。 0027 图7为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb在pH值为4时的平均粒径示意图。 0028 图8为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb在pH值为4时的Zeta电势示意图。 0029 图9为对比例1的dRBP在pH值为7时的平均粒径示意图。 0030 图10为对比例1的dRBP在pH值为7时的Zeta电势示意图。 0031 图11为对比例1的dRBP在pH。
15、值为4时的平均粒径示意图。 0032 图12为对比例1的dRBP在pH值为4时的Zeta电势示意图。 0033 图13为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb对B16F10细胞作用的荧光照片， 图中第一行为dRBP-Berb组， 第二行为对照组； 第一列为dRB显色照片， 第二列为 Lysotracker green显色照片， 第三列为第一列与第二列的合成照， 第四列为细胞的白光照 片。 其中， 第一行左一图为dRBP-Berb组的dRB显色照片， 细胞内散在分布有红色荧光点， 为 罗丹明dRB显色， 说明小檗碱纳米复合物dRBP-Berb已进入B16F10细胞； 第一行左二为dRB P。
16、-Berb组的Lysotracker green显色照片， Lysotracker green为溶酶体特异性染料， 细胞 内绿色荧光即表示溶酶体； 第一行右二为第一行左一与第一行左二的合成图， 第一行左一 的红色荧光与第一行左二的绿色荧光有部分叠加， 显示出黄色荧光， 表明小檗碱纳米复合 物dRBP-Berb可进入B16F10细胞， 且可定位于溶酶体。 第二行左一为对照组的dRB显色照 片， 未发现红色荧光点的存在。 说 明 书 2/4 页 4 CN 105663040 B 4 0034 图14为实验例2的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb对U87细胞作用的荧光照片， 图中 第一行为dRBP-。
17、Berb组， 第二行为对照组； 第一列为dRB显色照片， 第二列为Lysotracker green显色照片， 第三列为第一列与第二列的合成照， 第四列为细胞的白光照片。 其中， 第一 行左一图为dRBP-Berb组的dRB显色照片， 细胞内散在分布有红色荧光点， 为罗丹明dRB显 色， 说明小檗碱纳米复合物dRBP-Berb已进入U87细胞； 第一行左二为dRBP-Berb组的 Lysotracker green显色照片， Lysotracker green为溶酶体特异性染料， 细胞内绿色荧光 即表示溶酶体； 第一行右二为第一行左一与第一行左二的合成图， 第一行左一的红色荧光 与第一行左二的。
18、绿色荧光有部分叠加， 显示出黄色荧光， 表明小檗碱纳米复合物dRBP- Berb可进入U87细胞， 且可定位于溶酶体。 第二行左一为对照组的dRB显色照片， 未发现红色 荧光点的存在。 具体实施方式 0035 下面通过实施例具体说明本发明的内容： 0036 实施例1 0037 一种小檗碱纳米复合物， 其制备方法如下： 0038 室温下， 将2g分子量为20000的苯乙烯-马来酸酐交替共聚物溶于10ml的N,N-二甲 基甲酰胺和1ml三乙胺中， 再加入500mg小檗碱的盐酸盐或硫酸盐， 搅拌过夜； 加入5ml碳酸 氢钠的饱和水溶液以去除酸酐， 再次搅拌1h； 采用截留分子量为3500kD的透析袋。
19、除去分子 量在3500kD以下的物质后， 冷冻干燥或真空干燥， 将干燥后的固体溶于水中制成10mg/ml的 溶液， 超声处理40min以促进自主整装形成颗粒， 即得所述之小檗碱纳米复合物， 为微束结 构。 0039 实施例2 0040 本实施例之中的小檗碱纳米复合物与实施例1不同之处在于， 加入了罗丹明dRB作 为标记物， 便于后续检测， 但罗丹明dRB的加入对小檗碱纳米复合物的形成及结构无影响， 具体制备方法如下： 0041 室温下， 将2g分子量为20000的苯乙烯-马来酸酐交替共聚物溶于10ml的N,N-二甲 基甲酰胺和1ml三乙胺中， 并向其中逐滴滴入1ml浓度为500mg/ml的dR。
20、B的N,N-二甲基甲酰 胺溶液， 搅拌2h； 加入500mg小檗碱的盐酸盐， 搅拌过夜； 加入5ml碳酸氢钠的饱和水溶液以 去除酸酐， 再次搅拌1h； 采用截留分子量为3500kD的透析袋除去分子量在3500kD以下的物 质后， 冷冻干燥或真空干燥， 将干燥后的固体溶于水中制成10mg/ml的溶液， 超声处理40min 以促进自主整装形成颗粒， 即得所述之小檗碱纳米复合物， 为微束结构， 记为dRBP-Berb。 0042 对比例1 0043 制备方法同实施例2， 但不加小檗碱， 得到的产物记为dRBP。 0044 实验例1紫外表征 0045 分别用PBS配制浓度为100 g/mL的小檗碱盐酸。
21、盐、 实施例2中得到的dRBP-Berb、 对比例1中得到的dRBP的溶液； 酶标仪分别检测上述三种溶液在350nm600nm之间的紫外 吸收。 425nm处为小檗碱的特征吸收峰， 575nm处为dRB的特征吸收峰。 0046 结果如图4所示， 小檗碱溶液在 425nm处有最大吸收峰， 对比例1的dRBP溶液在 575nm处有最大吸收峰； 而实施例2的dRBP-Berb溶液在 425nm处及 575nm处均有 说 明 书 3/4 页 5 CN 105663040 B 5 吸收峰， 说明实施例2的dRBP-Berb中既含有小檗碱也含有dRB， 即实施例2的dRBP-Berb制 备成功。 0047。
22、 实验例2微束dRBP-Berb在不同pH值条件下的水合半径 0048 向pH为4或7的磷酸缓冲液(100mM,1ml)中分别加入10 l实施例2制备的dRBP- Berb和对比例1的dRBP(10mg ml-1,in PBS)， 测量二者不同pH下的平均粒径及Zeta电势。 0049 结果如图5至图12所示， 0050 实施例2制备的dRBP-Berb： pH值为7时， 平均粒径Z-V185nm； Zeta电势Z-P- 20.8mV； pH值为4时， 平均粒径Z-V1323nm； Zeta电势Z-P-19.9mV； 0051 对比例1制备的dRBP： pH值为7时， 平均粒径Z-V266nm。
23、； Zeta电势Z-P-25.1mV； pH值为4时， 平均粒径Z-V517nm； Zeta电势Z-P-24.9mV； 0052 实验例3小檗碱纳米复合物微束dRBP-Berb的生物膜透过能力 0053 采用U87细胞和B16F10细胞； 细胞先用含有dRBP-Berb(10 g/ml)的DMEM培养 30min后用PBS清洗。 再加入Lysotracker green(1M)染色20min， 用PBS洗掉残余的 Lysotracker green， 用激光共聚焦荧光显微镜进行观察分析。 结果如图13至图14所示， 说 明了本发明的小檗碱纳米复合物dRBP-Berb可进入细胞内部， 且可定位于。
24、溶酶体。 0054 以上所述， 仅为本发明较佳实施例而已， 故不能依此限定本发明实施的范围， 即依 本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰， 皆应仍属本发明涵盖的范围内。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105663040 B 6 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/5 页 7 CN 105663040 B 7 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/5 页 8 CN 105663040 B 8 图7 图8 图9 说 明 书 附 图 3/5 页 9 CN 105663040 B 9 图10 图11 图12 说 明 书 附 图 4/5 页 10 CN 105663040 B 10 图13 图14 说 明 书 附 图 5/5 页 11 CN 105663040 B 11 。