技术领域
本发明涉及二氢丹参酮I在抗肿瘤方面的应用，属于天然药物领域，特别涉及二氢丹参酮I在制备治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤的发病率及其死亡率呈逐年上升趋势，多药耐药(Multidrug resistance，MDR)是肿瘤化疗失败的重要原因之一，表现为肿瘤细胞对结构各异、机制不同的多种药物均产生交叉耐药的特点。美国癌症协会估计，90％以上肿瘤患者的死亡在不同程度上受到耐药影响。因此克服肿瘤的多药耐药性是临床亟待解决的问题。
多药耐药的机制研究主要涉及肿瘤细胞膜上P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的过表达，P-糖蛋白过表达能引起细胞对抗肿瘤药物的外排，使进入细胞中的药物减少，肿瘤细胞产生多药耐药，因此研究多把P-糖蛋白作为逆转多药耐药的靶点。但这类蛋白不仅在耐药细胞中过量表达，在人体的代谢脏器、屏障系统等也发挥着正常的生理功能，因此P-糖蛋白抑制剂难以达到临床应用的要求。
同时，目前临床上使用的化疗药物毒性大、副作用强，患者难以承受也是目前肿瘤治疗的一个主要问题。
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)属唇形科植物，始载于《神农本草经》，是临床中最常用的活血化瘀的中药。相关文献报道丹参具有增加冠脉血流量、扩张冠状动脉、防止心肌缺血等心血管作用，以及用于治疗胃癌、肝癌、宫颈癌等多种疾病。丹参酮类成分具有抗动脉粥样硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物活性和应用价值，尤其在抗肿瘤活性方面尤为突出。
二氢丹参酮I通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和分化从而发挥抗肿瘤作用以及显著的抗菌活性等，是丹参中抗肿瘤成分。但目前尚未找到关于二氢丹参酮I治疗肿瘤多药耐药性的报道和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前肿瘤治疗中所存在的上述缺陷，提供二氢丹参酮I在制备治疗肿瘤多药耐药性药物中的应用，二氢丹参酮I对耐药肿瘤细胞具有显著的抑制作用，其机制为对多药耐药肿瘤细胞的杀伤不受P-糖蛋白的影响，而且对多药耐药性肿瘤细胞的杀伤作用明显优于目前常用的有代表性的抗肿瘤药物。
另一方面，本发明还提供一种用于制备治疗多药耐药性肿瘤药物的二氢丹参酮I的制备方法。
再一方面，本发明还提供一种含有用于治疗多药耐药性肿瘤的二氢丹参酮I的药物组合物。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供二氢丹参酮I在制备治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤包括P-糖蛋白过度表达的各种实体肿瘤及P-糖蛋白过度表达的血液系统肿瘤。
进一步地，所述多药耐药性肿瘤包括多药耐药性肺癌、多药耐药性胰腺癌、多药耐药性结肠癌、多药耐药性肝癌、多药耐药性前列腺癌、多药耐药性肾癌、多药耐药性胃癌或多药耐药性乳腺癌。
进一步地，所述多药耐药性肿瘤包括对蒽环类化疗药物(阿霉素，柔红霉素，表阿霉素)、以微管为靶向的化疗药物(长春新碱，紫杉醇，依托泊甙，高三尖杉酯碱，丝裂霉素C)、以及以拓扑异构酶为靶向的化疗药物(氟尿嘧啶，甲氨蝶呤)耐药的耐药性肿瘤。
另一方面，本发明提供一种用于制备治疗多药耐药性肿瘤药物的二氢丹参酮I的制备方法，包括下列步骤：
1)取丹参粉碎药材，向其中加入一定倍数的有机溶剂进行回流提取或超声、浸泡得提取液，对提取液进行过滤，合并提取液滤液，回收溶剂后收干，得粗提取物；
2)将粗提取物通过反相层析填料进行梯度洗脱，得有效部位；
3)将有效部位通过正相层析填料梯进行度洗脱，得二氢丹参酮I。
进一步地，步骤1)中，有机溶剂的用量为生药量5-10倍，其中优选8倍；所述有机溶剂包括乙醚、石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯中的至少一种；其中优选乙醚、石油醚；最优选石油醚；
进一步地，步骤2)中，反相层析填料为C18填料，流动相为20％-60％乙腈水溶液以10倍柱体积梯度洗脱；
进一步地，步骤3)中，正相层析填料为正相硅胶填料，流动相为体积比是(10:90)-(60:40)的石油醚：乙酸乙酯以10倍柱体积梯度洗脱。
另一方面，本发明提供一种用于治疗多药耐药性肿瘤的药物组合物，其包括上述制备方法制得的药学有效剂量的二氢丹参酮I。
进一步地，所述药物组合物为化疗药物，所述二氢丹参酮I作为该化疗药物中的唯一有效组分。
进一步地，所述的药物组合物制成的剂型为液体制剂、固体制剂，包括注射剂、冻干剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂、口崩制剂、缓释制剂、控释制剂或各种微粒给药系统。
进一步地，二氢丹参酮I对人体的给药剂量范围为0.025mg/kg-2.5mg/kg；其中优选的给药剂量范围为0.125mg/kg-1mg/kg；可根据病情轻重、给药剂型以及患者年龄等因素调整改变。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明公开了一种化合物新制药用途，特别涉及二氢丹参酮I的新制药用途：在制备治疗多药耐药性肿瘤药物中的应用；
2、本发明获得的二氢丹参酮I可与药用辅料制成各种医学上的可接受的制剂形式，用于上述肿瘤多药耐药性的治疗，例如，注射剂、冻干剂、片剂、胶囊剂、口服液体制剂、颗粒剂等；
3、对本发明药物制剂的药效学部分进行初步研究，结果表明：在细胞实验中，二氢丹参酮I能够显著抑制多种耐药性肿瘤细胞的生长，抑制效果明显优于紫杉醇等现临床使用药物；在体内试验中，二氢丹参酮I能够显著抑制移植耐药性肿瘤细胞在裸鼠体内的生长；小鼠急性毒性实验结果显示，小鼠给药后，无明显不良反应，未发生死亡；观察期终止时，处死全部存活小鼠并进行解剖，腹腔内各脏器未见明显异常变化。上述实验证明，二氢丹参酮I能够显著抑制多药耐药性肿瘤生长，且毒性较小，具有很好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例2中二氢丹参酮I核磁氢谱图。
图2为实施例2中二氢丹参酮I核磁碳谱图。
图3A为实施例2中二氢丹参酮I HMBC核磁图。
图3B为实施例2中二氢丹参酮I HMBC核磁图。
图4为实施例2中二氢丹参酮I红外图谱。
图5为实施例2中二氢丹参酮I紫外图谱。
图6为实施例5中二氢丹参酮I作用MCF-7/MDR及其亲本细胞MCF-7后实验组与空白组的细胞形态学观察图。图7A为实施例6中Annexin V-FITC/PI双染色法检测MCF-7/MDR细胞凋亡图；
图中：Q1-坏死细胞；Q2-晚期凋亡细胞；Q3-正常细胞；Q4-早期凋亡细胞。
图7B为实施例6中Annexin V-FITC/PI双染色法检测MCF-7/MDR细胞凋亡分析图。
图8为实施例7中Western Blot检测MCF-7/MDR及其亲本细胞MCF-7的P-糖蛋白表达情况。
图9为实施例9中小鼠解剖瘤块。
图10为实施例9中小鼠石蜡切片结果。
现结合附图与具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
近年来，本实验室通过对丹参抗肿瘤成分的研究发现，二氢丹参酮I对多药耐药性肿瘤具有很好的抑制作用，且毒副作用小，具有很好的临床应用前景。
二氢丹参酮I是丹参的一种脂溶性有效单体成分，英文名称：Dihydrotanshinone I，分子量278.30，分子式：C18H14O3，其化学结构如下所示：
多药耐药细胞来源于药敏细胞，两者的区别在于前者高表达P-糖蛋白，因此前者对多种肿瘤化疗药物有多药耐药性，而后者无多药耐药性。
二氢丹参酮I对耐药肿瘤细胞具有的显著抑制作用，其机制为对多药耐药肿瘤细胞的杀伤不受P-糖蛋白的影响，进而胞内药物浓度能够维持在正常水平，从而克服肿瘤多药耐药性。而且二氢丹参酮I对多药耐药性肿瘤细胞的杀伤作用明显优于目前常用的有代表性的抗肿瘤药物。
二氢丹参酮I杀死P-糖蛋白高表达的多药耐药性肿瘤细胞机理是诱使细胞凋亡，与其亲本药敏细胞一致；且二氢丹参酮I具有较低毒性。
用于制备治疗多药耐药性肿瘤药物的二氢丹参酮I的制备方法，采用先反相分离目标有效部位、后正相纯化有效部位得目标产物的方法，具有以下优势：
(1)先采用反相分离目标有效部位，是由于该目标产物在丹参中含量极低，属于强极性部位，先使用反相层析填料分离，可首先将提取物中大量的非目标成分，如丹参酮IIA、隐丹参酮除去，使目标产物不在分离纯化过程中分散至其它成分内，减少目标成分的损耗；
(2)后采用正相填料纯化有效部位得目标产物，是因为在有效部位中，其它成分与目标产物极性很相似，难以分离，正相层析填料与反相层析填料分离机理不同，正相和反相层析的组合使用，可以大大提高分离的效率。
以下将通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1：二氢丹参酮I的制备过程
(1)丹参生药粉碎后，取20公斤粉碎药材加入10倍量的石油醚浸泡提取，过滤后收集滤液旋蒸回收，回收溶剂，得粗提物I 200g；
(2)将粗提取物I与C18反相层析填料拌样后，流动相用20％-60％乙腈水溶液以10倍柱体积梯度洗脱，收集目标部位，得粗提物II 26g；
(3)将粗提物II利用正相层析硅胶柱，流动相用石油醚：乙酸乙酯＝(1:9)-(3:2)以10倍柱体积梯度洗脱，得二氢丹参酮I 10g。
实施例2：制备得到的二氢丹参酮I的结构表征
2.1二氢丹参酮I熔点检测。
取实施例1所得样品适量，置于熔点测定用毛细管中，轻击管壁，垂直放在表面皿上，将毛细管自上口放入使自由落下，反复数次，使粉末紧密集结在毛细管的熔封端。装入样品的高度为3mm。
另将温度计放入盛装传温液的容器中，使温度计汞球部的底端与容器的底部距离2.5cm以上；加入传温液以使传温液受热后的液面在温度计的分浸线处。将传温液加热，待温度上升至比规定的熔点低限约低10℃时，将装有样品的毛细管浸入传温液，贴附在温度计上，位置须使毛细管的内容物部分是在温度计贡球中部；继续加热，调节升温速率为每分钟上升1.0-1.5℃，加热时须不断搅拌使传温液温度保持均匀，记录供试品在初熔至全熔时的温度，重复测定3次，取其平均值。结果如表1所示：
表1二氢丹参酮I熔点检测结果
测定次数 第一次 第二次 第三次 平均值 温度℃ 224.5 225 225 224.83±0.29
2.2二氢丹参酮I核磁氢谱图如图1所示，δ1.286(d,3H)，δ2.679(s,3H)，δ3.507-3.566(br.m,1H)，δ4.470(t,1H)，δ5.011(t,1H)，7.490-7.783(br,3H)，8.438(d,1H),9.128(d,1H)。
2.3二氢丹参酮I核磁碳谱图如图2所示。
2.4二氢丹参酮IHMBC核磁图如图3A、图3B所示。
2.5二氢丹参酮I红外图谱如图4所示。
2.6二氢丹参酮I紫外图谱如图5所示。
实施例3：二氢丹参酮I与紫杉醇等药物的抗多药耐药细胞的增殖抑制效果比较
实验方法：以多药耐药性细胞MCF-7/MDR及其亲本细胞MCF-7为对象，考察二氢丹参酮I与紫杉醇等药物对该细胞增殖抑制的影响。
取长势形态良好的处于生长期的两种细胞，以105/孔的细胞数种于96孔板中，每孔100μL。放入培养箱中孵育18-24小时贴壁后，MCF-7细胞组分别加入各药液样品，终浓度分别为4.5、2.25、1.13、0.56、0.28μmol/L；MCF-7/MDR组加入药液样品终浓度如表2所示，每浓度平行3个平行孔，放入培养箱中孵育48小时后去掉培养基，用PBS洗一次，再加入100μL含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基孵育3-4小时；小心地去掉上清，加入100μL DMSO，充分溶解后用酶标仪进行检测，检测波长570nm，参考波长630nm。
存活率(fu)＝1-(OD570-OD630)药物组/(OD570-OD630)对照组
抑制率(fa)＝1-存活率(fu)
给药剂量与细胞存活率关系式为Y＝a+bX
其中Y为存活率，X为给药剂量。通过实验可以测得药物给药时不同给药剂量对应的细胞存活率。将给药剂量和细胞存活率数据代入上述方程，对该组数据进行线性拟合，计算出对应的a值、b值，即得到对应于该药物的剂量与存活率关系的方程Y＝a+bX。
从而求出给药细胞的IC50值。
耐药倍数：RF＝IC50耐药细胞/IC50敏感细胞
实验结果：如表3所示，二氢丹参酮I的RF值0.72±0.4，显著低于阿霉素21.86±0.81、紫杉醇51.36±1.84、顺铂63.08±0.97等多种现有的临床药物。
实验说明：二氢丹参酮I对多药耐药细胞具有显著的增殖抑制效果；二氢丹参酮I对多药耐药细胞的增殖抑制效果优于现临床使用抑制肿瘤的药物。
表2 MCF-7/MDR组各给药样品给药浓度
表3二氢丹参酮I与多种临床抗肿瘤药物对耐药细胞与亲本细胞IC50值对比
实施例4：二氢丹参酮I对六种多药耐药性细胞及其亲本细胞的增长抑制作用
实验方法：以多药耐药性细胞MCF-7/MDR、A549/Taxol、SW1990/GEM、HCT-8/5Fu、SGC7901/DDP、BEL-7402/ADM及其亲本细胞MCF-7、A549、SW1990、HCT-8、SGC7901、BEL-7402为对象，考察二氢丹参酮I对该细胞增殖的影响。
取长势形态良好的处于生长期的两种细胞，以105/孔的细胞数种于96孔板中，每孔100μL。放入培养箱中孵育18-24小时贴壁后，分别加入终浓度为4.5、2.25、1.13、0.56、0.28μmol/L的二氢丹参酮I溶液，每浓度平行3个平行孔，放入培养箱中孵育48小时后去掉培养基，用PBS洗一次，再加入100μL含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基孵育3-4小时；小心地去掉上清，加入100μL DMSO，充分溶解后用酶标仪进行检测，检测波长570nm，参考波长630nm。
存活率(fu)＝1-(OD570-OD630)药物组/(OD570-OD630)对照组
抑制率(fa)＝1-存活率(fu)
给药剂量与细胞存活率关系式为Y＝a+bX
其中Y为存活率，X为给药剂量。通过实验可以测得药物给药时不同给药剂量对应的细胞存活率。将给药剂量和细胞存活率数据代入上述方程，对该组数据进行线性拟合，计算出对应的a值、b值，即得到对应于该药物的剂量与存活率关系的方程Y＝a+bX。
从而求出给给药细胞的IC50值。
实验结果：如表4所示，结果表明二氢丹参酮I作用于MCF-7/MDR及其亲本细胞MCF-7细胞48h的半数抑制浓度IC50分别是0.68±0.08μmol/L和0.95±0.04μmol/L，说明二氢丹参酮I对两类细胞均具有相似的增殖抑制效果；在其他五种耐药细胞株与亲本细胞株中均体现出，二氢丹参酮I对两类细胞也具有相似的增殖抑制效果。证明多药耐药性细胞对二氢丹参酮I不具有耐受性。
表4二氢丹参酮I多种多药耐药性细胞及其亲本细胞的IC50值
耐药细胞株 IC50(μmol/L) 亲本细胞株 IC50(μmol/L) MCF-7/MDR 0.68±0.08 MCF-7 0.95±0.04 A549/Taxol 0.88±0.03 A549 0.84±0.05 SW1990/GEM 0.94±0.01 SW1990 1.14±0.01 HCT-8/5-Fu 0.74±0.07 HCT-8 0.84±0.04 SGC7901/DDP 1.04±0.08 SGC7901 1.03±0.08 BEL-7402/ADM 0.75±0.03 BEL-7402 0.86±0.07
实施例5：细胞形态学观察
实验方法：本实验使用染料Hochest 33258，考察二氢丹参酮I对MCF-7/MDR与MCF-7细胞的形态学的影响。
检测原理：Hochest 33258是DNA的结合剂，但它可以透过活细胞的细胞膜，正常细胞会呈现均一的淡蓝色，而凋亡细胞则因染色聚集而呈现亮蓝色。
具体操作如下：
以5×104/孔的细胞数将细胞种于24孔板中，18-24h后实验组加入终浓度为2μmol/L的二氢丹参酮I，空白组加入不含药物的完全培养基；培养48h后，加入5μL Hochest 33258(使其终浓度为10μg/mL)，晃匀后室温避光染色10min，而后进行荧光显微观察。
实验结果：如图6所示，二氢丹参酮I无论对MCF-7/MDR还是亲本细胞MCF-7，与空白组相比，实验组中，均可见由细胞凋亡产生的亮蓝色荧光点。说明二氢丹参酮I对MCF-7/MDR及其亲本细胞MCF-7杀伤作用均为诱导其凋亡。
实施例6：Annexin V-FITC/PI双染色法检测MCF-7/MDR细胞凋亡
实验方法：本实验使用Annexin V-FITC/PI双染色法，进一步验证二氢丹参酮I诱导了MCF-7/MDR细胞的凋亡。
检测原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧，从而与磷脂结合蛋白AnnexinV相结合，此时，细胞膜保持完整，使得PI不能进入细胞；但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。
具体操作如下：
(1)以5×105/孔的细胞数将MCF-7/MDR细胞种于6cm的平皿中，18-24h后给药组加入终浓度为2μmol/L的二氢丹参酮I；
(2)药物作用48h后，胰酶消化后，1000rpm离心5min收集细胞；
(3)用在冰上预冷的PBS洗涤细胞两次；
(4)加入100μL含有2μL Annexin-V的Binding Buffer，轻柔的吹散细胞，放置于冰上孵育10min；
(5)300目的尼龙网过滤后，加入100μL含有2μL PI的生理盐水避光孵育2-3min，流式细胞仪检测分析。
实验结果：如图7A、B显示，在细胞经样品给药浓度为2μmol/L时，给药组二氢丹参酮I使细胞在Q2与Q4的凋亡数量分别达到12.5与15.7，明显高于空白组的2.4与6.9，说明二氢丹参酮I可诱导MCF-7/MDR细胞多数呈凋亡状态。
实施例7：Western blot检测MCF-7/MDR及MCF-7两种细胞的P-糖蛋白表达情况
实验方法：
取生长良好的处于指数生长期的MCF-7/MDR及MCF-7两种细胞，贴壁生长24h后，胰酶消化，1500rpm离心5min收集细胞，提取蛋白。
蛋白提取具体操作如下：
(1)PBS洗涤细胞两次，最后一次将PBS吸除干净，加入适量的细胞裂解液(1mL Lysis Buffer中加入10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF)；
(2)涡旋震荡30s，冰上冷却5min，重复3-5次；
(3)14000rpm，4℃离心15min；取上清至新的已灭菌的1.5mL的离心管中，即得蛋白样品，进行后续实验。
然后用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白含量，具体操作如下：
(1)将稀释后的BCA和蛋白样品加入96孔板中，每孔25μL；
(2)加入200μL反应液(BCA Reagent A与Reagent B以50:1的比例混合)；
(3)37℃恒温培养箱中孵育30min，酶标仪检测，检测波长为562nm。
(4)测定OD值后，根据BCA的浓度与OD值拟合得到蛋白OD值与浓度的直线方程，而后代入样品的OD值，从而算出蛋白样品的浓度。
补加裂解液，使得所有蛋白样品的浓度一致，加入适量的5×Loading buffer，煮沸5min，使蛋白变性。
以1.5mL的离心管储存备用，按照每管80-100μg的蛋白量进行分装，存于-20℃，最久可存储半个月。
蛋白等体积上样后电泳，具体操作如下：
(1)选择分离胶浓度，配置分离胶，配好后加入固定好的制胶板中，晃平，加入适量的单蒸水将分离胶压平，室温放置30-40min；
(2)待分离胶凝好后，将上层的水倒掉，加入已配好的浓缩胶，插入1.0mm的梳子，再补加浓缩胶以防漏胶，室温放置20-30min；
(3)将凝好的胶放入蛋白电泳槽中，加满已预冷好的电泳缓冲液，轻轻地将梳子拔掉后，用1mL的注射器针头将歪斜的胶孔扶正；
(4)上样，每孔80-100μg蛋白样，电泳，70V跑30min，而后120V跑1-1.5h。
电泳完毕后，按照目的蛋白的大小，以预染Marker为基准，将Mr目标带±10kDa处的胶切下。然后将胶浸泡在已预冷的转膜缓冲液中，准备转膜。
转膜具体操作如下：
(1)根据目标分子的大小(Mr>22kDa，则选用0.45μm孔径的PVDF膜；Mr<22kDa，则选用0.22μm孔径的PVDF膜)，裁剪相应的PVDF膜(比胶各宽1mm)并标记，甲醇中浸泡5min，转膜缓冲液中浸泡5min；
(2)剪下2组滤纸条(比膜各宽1mm)，每组3层，浸于转膜缓冲液中；
(3)由黑色至白色依次为滤纸三层、膜、胶、滤纸三层；每叠一层，则用玻璃棒辗两三个回合以赶走气泡，并用滤纸将其边缘吸干；全部搭完后，再用干净滤纸将其边缘吸干，并保证该下三层滤纸与上三成滤纸不要重叠，以防短路；
(4)转膜，小于70kDa的用半干转，转膜时间按照蛋白分子量设置(1kDa，1min)；大于70kDa的进行湿转，转膜时间为2.5h。
封闭液中封闭1-2h，一抗4℃冰箱孵育过夜。TBST洗三次，每次10min。二抗室温孵育1h，TBST洗四次，每次15min。ECL化学发光剂孵育5min，压片，显影5min，定影5min，用软件Gel-pro 32进行灰度分析。
实验结果：如图8所示，MCF-7/MDR与MCF-7细胞相比，MCF-7/MDR细胞P-糖蛋白糖蛋白的表达明显高于MCF-7细胞，而在体外细胞实验与体内裸鼠移植肿瘤实验中，二氢丹参酮I对MCF-7/MDR与MCF-7细胞均有明显的抑制效果。由此可见，二氢丹参酮I对肿瘤细胞的杀伤和抑制药效不受肿瘤多药耐药的影响，尤其不受肿瘤细胞P-糖蛋白的影响。即使是肿瘤细胞高表达P-糖蛋白，使多种抗肿瘤药物的药效大大降低，仍不影响二氢丹参酮I的抗肿瘤药效。
实施例8：用于治疗多药耐药性肿瘤的二氢丹参酮I药物组合物的制备过程
取实施例1制得二氢丹参酮I样品9mg，加入200μL无水乙醇溶解后，加200μL蓖麻油超声混匀后，加1600μL生理盐水溶解，制成A样品，浓度为4.5mg/mL。
使用时，取A样品100μL加900μL生理盐水稀释后，静脉注射使用。
该浓度以小鼠体重为18g，剂量为0.1mL时，给药量是2.5mg/kg。
实施例9：二氢丹参酮I药物组合物对移植MCF-7/MDR及MCF-7两种肿瘤细胞的裸鼠的肿瘤抑制作用
实验方法：取生长良好的处于指数生长期的MCF-7/MDR及MCF-7两种细胞，以PBS洗涤2次，收集细胞，计数，用PBS配制成(6-7)*106cells/mL的细胞悬液，以0.1mL/只裸鼠注射于右腋下成瘤，游标卡尺测量到瘤块成型约0.3*0.3cm2大小时开始给药。
药物样品由实施例8制备。
设空白组、阳性对照组紫杉醇(2.5mg/kg)、样品组(2.5mg/kg)，两天给药一次。连续给药14天后，取瘤称重，测量大小，石蜡切片观察。
实验结果：
由图9裸鼠解剖瘤块可见，与空白组、阳性对照组紫杉醇的裸鼠对比，二氢丹参酮I给药组对MCF-7/MDR及MCF-7两种肿瘤均有很好的抑制作用。
由图10石蜡切片结果所示，二氢丹参酮I给药组裸鼠肿瘤石蜡切片中观察到血管周围肿瘤细胞均有明显的凋亡现象。
由表5、表6可以得知：与空白组的裸鼠对比，二氢丹参酮I给药组对移植MCF-7/MDR及MCF-7两种细胞的裸鼠肿瘤均有很好的抑制作用，实验过程中，小鼠无不良反应；紫杉醇阳性对照组虽然在移植亲本细胞MCF-7组裸鼠肿瘤中有抑制作用，但在移植多药耐药性细胞MCF-7/MDR组裸鼠肿瘤中几乎无抑制作用，且在实验观察过程中，紫杉醇阳性对照组的裸鼠出现体重停滞略下降，饮食量下降。
根据人体与小鼠的给药等效剂量换算，本次实验对应的人体给药的有效剂量为0.28mg/kg。实际有效剂量可根据具体情况调整。
表5MCF-7细胞组小鼠解剖数据
组别 实验前体重/g 实验后体重/g 体重差值 瘤重/g 抑瘤率％ 二氢丹参酮I 15.98±0.78 18.74±0.15 2.87±0.64 0.28±0.24 73.07692 紫杉醇 16.07±1.01 17.43±0.25 1.34±0.74 0.34±0.53 67.30769 空白对照 15.93±0.47 18.88±0.97 2.95±0.51 1.04±0.39
表6MCF-7/MDR细胞组小鼠解剖数据
组别 实验前体重/g 实验后体重/g 体重差值 瘤重/g 抑瘤率％ 二氢丹参酮I 15.41±0.54 18.47±0.61 3.00±0.35 0.20±0.41 81.81818 紫杉醇 16.23±0.19 17.77±0.37 1.32±0.87 0.87±0.64 20.90909 空白对照 16.08±0.39 18.59±0.89 2.67±0.64 1.10±0.38
实施例10：二氢丹参酮I小鼠体内急性毒性实验观察
实验方法：根据《化学药物急性毒性试验技术指导原则》，正常健康小鼠在空腹处理后，一次性腹腔注射给药5g/kg，前2小时密切观察，如未发生死亡，每天称量体重记录，培养14天后，脱颈处死小鼠，解剖大体观察其内脏分析。
实验结果：小鼠在给药后，未出现死亡，体重与空白组对照，正常增长，14天后，解剖未观察到内脏异常。说明二氢丹参酮I毒性较小，在临床上具有很好的应用前景
以上实施例3-7、9-10说明：
(1)二氢丹参酮I对多药耐药细胞的药效显著优于紫杉醇、阿霉素、长春新碱等临床抗肿瘤药物；
(2)二氢丹参酮I杀死多药耐药肿瘤细胞及其亲本细胞的药效无明显区别，证明二氢丹参酮I的药效不受肿瘤细胞P-糖蛋白表达的影响；
(3)在小鼠体内实验中，二氢丹参酮I表现出对多药耐药细胞显著的抑制作用，且毒性明显低于现临床抗肿瘤药物。
这些结果说明二氢丹参酮I具有广阔的抗P-糖蛋白高表达的肿瘤多药耐药性的药物制备和临床应用的前景。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变型不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变型属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。