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1、10申请公布号CN104127485A43申请公布日20141105CN104127485A21申请号201410333111422申请日20140714A61K36/53200601A61P9/1020060171申请人河南中医学院地址450008河南省郑州市金水区金水路1号72发明人苗明三曹珊白明方晓艳74专利代理机构郑州天阳专利事务所普通合伙41113代理人聂孟民54发明名称一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用57摘要本发明涉及冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，有效解决冬凌草提取物的制备，及该提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用问题，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎。
2、为粗粉，用石油醚回流萃取2次，萃取液挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，加乙醇浸泡05H，回流提取2次，醇提液减压浓缩至无醇味，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂，流动上样，静置12H待充分吸附后，依次用蒸馏水、乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，本发明提取物经反复试验，证明冬凌草提取物具有提高脑缺血耐受能力，有效用于制备抗脑缺血药物，有显著的经济和社会效益。51INTCL权利要求书1页说明书14页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书14页附图6页10申请公布号CN104127485ACN1041274。
3、85A1/1页21一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎为粗粉，每次加10倍重量的石油醚回流萃取2次，每次萃取1H，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加10倍重量的质量浓度50乙醇浸泡05H，回流提取2次，每次1H，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为1822，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂；原生药与AB8树脂的重量比为18，流动上样，静置12H待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干。
4、得粉末，即得本发明冬凌草提取物，提取率68，其中冬凌草总黄酮含量为5560。权利要求书CN104127485A1/14页3一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用技术领域0001本发明涉及医药，特别是一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用。背景技术0002脑缺血耐受实际上是外界刺激激活机体内的内源性保护机制，从而赋予机体对下一次严重损伤的抵抗能力，尽管物理性预处理手段被证实可诱导脑缺血耐受，但对机体是一种损伤，有的化学药物虽然能够提高耐受但其对耐受形成的机制还不完全清楚，化学药物长期服用的服用后的副作用，对脑缺血疾病的治疗有一定的限制。中药作用温和持久，具有综合治疗的作用，可。
5、延缓并发症的发生，其多成分、多靶点的特点在防治脑血管疾病方面有极大的优势，通过“治未病”的方式，诱导缺血耐受时机体的多种内源性保护机制，减轻缺血性脑损伤，成为安全有效的预处理手段。2010版药典记载冬凌草为唇形科植物碎米桠RABDOSIARUBESCENSSHEMSLHARA的干燥地上部分，味苦、苷，微寒，归肺、胃、肝经，具有清热解毒，活血止痛之功，用于咽喉肿痛，癥瘕痞块，虫蛇咬伤。主要化学成分有单萜、二萜、三萜等萜类化合物，还含有挥发油、甾体、黄酮、生物碱、氨基酸、有机酸、单糖类成分等。现代研究表明冬凌草具有很好的抗肿瘤，抗菌抗炎，增强免疫，抗氧化，降压，抗突变等作用。临床实验表明，其对一些。
6、癌症有很好的治疗作用如食管癌、贲门癌、结肠癌、肝癌等，另外，冬凌草对一些炎症也有很好的疗效如治疗化脓性扁桃体炎，急慢性咽喉炎及慢性气管炎等，冬凌草成分中的冬凌草甲素是一种低毒性、抗肿瘤活性好，被称为“紫杉醇第二”。但目前，还没有发现其对脑缺血耐受的任何报道。发明内容0003针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，可有效解决冬凌草提取物的制备，及该提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用问题。0004本发明解决的技术方案是，冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是将冬凌草粉碎为粗粉，每次加10倍重量的石油醚回流。
7、萃取2次，每次萃取1H，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加10倍重量的质量浓度50乙醇浸泡05H，回流提取2次，每次1H，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为1822，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂；原生药与AB8树脂的重量比为18，流动上样，静置12H待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，提取率68，其中冬凌草总黄酮含量为5560注因冬凌草质量和提取中所用的溶剂质量有所不同，因此，会影响。
8、提取物中总黄酮的含量，但经反复多次试验，总黄酮含量基本在5560，平均为58。说明书CN104127485A2/14页40005本发明提取物经反复试验，证明冬凌草提取物具有提高脑缺血耐受能力，有效用于制备抗脑缺血药物，从而实现冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，开拓了冬凌草的新用途和药用价值，有显著的经济和社会效益，是冬凌草药物应用上的创新。附图说明0006图1为本发明对脑缺血耐受模型大鼠死亡率的影响图。0007图2为本发明对脑缺血耐受模型大鼠神经功能缺失评分的影响图。0008图3为本发明对脑缺血耐受模型大鼠血清中NSE水平的影响图。0009图4为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑梗死率的。
9、影响图。0010图5为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中TNF、IL1、IL8含量的影响图。0011图6为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中BAX含量的影响图。0012图7为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中BCL2含量及BCL2/BAX比率的影响图。0013图8为本发明对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中CASPASE3含量的影响图。0014图9为本发明对大鼠脑组织海马CA1和CA3区GDNF阳性细胞表达率的影响图。0015图10为本发明对大鼠脑组织海马CA1和CA3区BDNF阳性细胞表达率的影响图。0016图11为本发明对大鼠脑组织海马CA1和CA3区NFBP65阳性细胞表达率的影响图。具体实施方。
10、式0017以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。0018本发明在具体实施中，可由以下实施例给出。0019实施例10020冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草1KG粉碎为粗粉，每次加10KG石油醚回流萃取2次，每次1H，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加10KG质量浓度50乙醇浸泡05H，回流提取2次，每次1H，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为19，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂；原生药与AB8树脂的重量比为18，流动上样，静置12H待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再。
11、用3倍柱体积的质量浓度为10的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为7，其中冬凌草总黄酮含量为58。0021实施例20022冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草15KG粉碎为粗粉，每次加15KG石油醚回流萃取2次，每次1H，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加15KG质量浓度50乙醇浸泡05H，回流提取2次，每次1H，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为22，用蒸馏水分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂；原生药与AB8树脂的重量比为18，流动。
12、上样，静置12H待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度说明书CN104127485A3/14页5为10的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为8，其中冬凌草总黄酮含量为60。0023实施例30024冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，该冬凌草提取物是，将冬凌草05KG粉碎为粗粉，每次加5KG石油醚回流萃取2次，每次1H，合并两次萃取液，挥去石油醚至冬凌草粗粉干燥，每次加5KG质量浓度50乙醇浸泡05H，回流提取2次，每次1H，合并两次醇提液，减压浓缩至无醇味，提取率为18，用蒸馏水。
13、分散为相当于含生药浓度04G/ML，作为上样药溶液，过AB8树脂；原生药与AB8树脂的重量比为18，流动上样，静置12H待充分吸附后，先用2倍柱体积蒸馏水洗，弃去水液，再用3倍柱体积的质量浓度为10的乙醇除杂，最后用5倍柱体积的质量浓度为80的乙醇洗脱，收集洗脱液，挥干得粉末，即得本发明冬凌草提取物，得率为6，其中冬凌草总黄酮含量为55。0025上述冬凌草提取物经反复科学试验，证明冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮可改善大、小鼠神经功能缺失评分，减少梗死面积，减轻缺血损伤，改善大脑皮质及海马区的病变；减轻因酸度过高对脑组织的损伤，降低因能量代谢障碍对脑组织的损伤；清除自由基，抑制脂质过氧化，从而减轻。
14、了脑缺血再灌注损伤程度；抑制缺血后炎症反应，及改善炎症引起的一系列级联反应介质和细胞因子，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。0026研究还表明，缺血预处理时间及强度是产生脑缺血耐受的两个主要因素。脑缺血强度太弱、时间太短不足以产生耐受，强度太强、时间过长则会导致脑组织不可逆的缺血损伤。要进行脑缺血耐受机制的研究，最重要的是建立一个良好的动物模型，找出最佳的缺血预处理时间剂量、诱导时间窗，才能进一步进行其机制的研究。脑组织神经细胞是缺血动物易受损伤的部位之一，通过观察不同缺血预处理诱导脑缺血耐受产生的不同时间窗对小鼠组织形态学的影响，发现小鼠夹闭双侧颈总动脉阻断血流10MIN做缺血预处理，以120。
15、H为诱导时间窗，再次夹闭双侧颈总动脉30MIN，脑组织水肿程度减轻，病理改变轻，呈现保护效应。通过对大鼠脑缺血耐受模型2VOMCAO预处理时间剂量、诱导时间窗实验研究，发现大鼠采用短暂阻断双侧颈总动脉10MIN，以72H为诱导时间窗，再采用短暂性大脑中动脉阻塞MCAO模型，作为再次缺血损伤模型阻断中动脉血流2H，再灌注22H后，脑组织水肿程度减轻，梗死区范围缩小，保护效应强。0027本申请通过复制上述小鼠脑缺血耐受模型、大鼠脑缺血耐受模型为研究对象，观察冬凌草提取物对脑缺血耐受模型动物的作用，深入探讨其内源性保护作用及相关细胞因子和神经营养因子的变化。为临床应用冬凌草干预和治疗缺血性脑中风提供。
16、实验依据，有关试验资料如下00281实验材料002911实验药物0030本发明冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮。0031尼莫地平片，主要成分尼莫地平。适用于各种原因蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛和急性脑血管病恢复期的血液循环改善。批号130660，厂家亚宝药业集团股份有限公司。0032脑络通胶囊，主要成分丹参、川芎、黄芪、甲基橙皮苷、盐酸托哌酮、维生素B6。功能主治通经活络，补血活气，具有扩张血管，增加脑血流量作用，用于脑动脉硬化，脑血栓，说明书CN104127485A4/14页6中风后遗症等各种脑血管疾病，气虚血瘀证引起的头痛，眩晕，半身不遂，肢体发麻，神疲乏力等症。批号130901，厂家吉林金宝。
17、药业股份有限公司。003312实验试剂0034注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司，批号C1206807；0035氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司，批号130629；0036水合氯醛，天津市光复精细化工研究所，批号20120827；0037甲醛分析纯，烟台市双双化工有限公司，批号20130702；0038羧甲基纤维素钠，天津市恒兴化学试剂制造有限公司，批号20120418；003975医用酒精，新乡市三伟消毒制剂有限公司，批号20131020；0040红四氮唑上海山浦化工有限公司，批号20120508；0041磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司，批号20130402；0042磷酸二氢。
18、钠，天津市化学试剂三厂，批号20051028；0043RATNSE检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0044RATTNFELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0045RATIL8ELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0046RATIL1ELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0047RATBAXELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0048RATBCL2ELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；0049RATCASP3ELISA检测试剂盒，厂家RD，批号20131202B；005013实验仪器005。
19、1MCAO线栓，北京沙东生物技术有限公司，产品号2838A4；0052SHHW21600S型电热恒温三用水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司生产；0053FA2204B电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产；0054KDC160HR高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；0055BIORAD680酶标仪，680MICROPLATEREADER，BIORADLABORATORIES；0056可调式移液器，赛默飞世尔上海仪器有限公司；0057专业图像分析系统，NISELEMENTSAR41001。005814实验动物0059WISTAR大鼠，雄性，SPF级，体重260280G，山东鲁抗医药股份。
20、有限公司，合格证号0017228。实验室合格证号SYXK豫2010001。00602实验方法006121分组与给药取体重280300G左右的雄性大鼠128只，随即均匀分为8组即假手术组，缺血再灌注损伤组，BIT模型组，尼莫地平组，脑络通胶囊组，大、中、小剂量冬凌草提取物组，每组16只。尼莫地平组阳性对照药为尼莫地平片，给药剂量为20MG/KG，临用前用05CMC配成药物浓度2MG/ML，1ML/100G，临床用量的10倍；脑络通胶囊组阳性对照药为脑络通胶囊，给药剂量为500MG/KG，临用前用05CMC配成药物浓度50MG/ML，1ML/100G，临床用量的10倍；大、中、小剂量冬凌草提取物组。
21、200MG/KG、100MG/KG、50MG/KG，临用前用05CMC配成药物浓度20MG/ML、10MG/ML、5MG/ML，1ML/100G；假手术组、缺血再灌注损伤组、BIT模型组灌服同体积05CMC。说明书CN104127485A5/14页7006222造模方法0063221第一次缺血损伤方法脑缺血预处理模型0064所有大鼠经10水合氯醛03ML/100G腹腔麻醉，仰卧固定手术台上，酒精颈部消毒，然后用手术刀作颈部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，除假手术组、缺血再灌注损伤组外，其余各组大鼠用无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉，分别阻断血流10MIN，然后恢复灌流，假手术组、缺血再灌注损伤组只。
22、暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流。动物苏醒后，分别给予相应药物，每天1次，连续给药3天，缺血预处理72H后，即第4次给药后1H进行MCAO术。0065222再次缺血损伤方法大脑中动脉阻塞缺血再灌注损伤模型0066大鼠水合氯醛麻醉，仰卧固定，分离左侧颈总动脉CCA、颈内动脉ICA及颈外动脉ECA，除假手术组大鼠外，其余各组大鼠结扎ECA与CCA，以动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，从切口处插入线栓，插入深度20MM左右，结扎入口处，线栓外留12MM，缝合皮肤。2H后轻轻提拉所留线头至略有阻力，实现再灌注。假手术组大鼠只暴露动脉，但不阻断血流。手术过程中保持室温2325。
23、。006723神经症状评分0068按照ZEALONGA5级评分法，于术后24H即再灌注22H进行评定，0分及昏迷不醒者或死亡者剔除。评分标准为无明显神经症状，计0分；不能完全伸展左侧前爪，计1分；向左侧旋转，计2分；行走时向左侧倾倒，计3分；不能自行行走，计4分；死亡，计5分。006924血清制备0070再灌注22H后，眼球取血，分离血清，20冰箱保存，用于NSE的测定。007125脑组织取材及处理0072取血后迅速断头完整取脑，立即放入20低温冰箱中，冷却15MIN后，去掉嗅球、小脑和低位脑干后的剩余部分沿冠状面切成3部分，第一刀在视交叉冠状面前1MM处即第一部分为脑前极至视交叉冠状面前1M。
24、M处，第二刀在视交叉冠状面后1MM处即第二部分为视交叉冠状面前后1MM处，第二部分约为2MM的薄片；第三部分为视交叉冠状面后1MM处至尾端的脑组织。007326脑梗死面积测定0074取第2片脑切片迅速放入以PH72磷酸缓冲液配置的1TTC磷酸盐溶液中，随后放入恒温箱中，37避光孵育15MIN，其间轻轻翻动，以利充分染色。取出脑片至于10甲醛液中避光保存24H，蓝色背景下拍照，正常脑组织为玫瑰红色，梗死部位为白色。用扫描仪扫描图像，输入图像分析系统，计算梗死区域的面积，求出梗死区域面积占总面积的百分比。007527脑组织匀浆制备0076第一部分脑组织，矢状切取左侧脑组织插线栓侧脑组织，称重，用生。
25、理盐水制备10脑匀浆，脑匀浆经3000R/MIN离心10MIN，取上清液，分装，至20冰箱保存，用于脑匀浆中TNF、IL8、IL1、BCL2、BAX、CASP3的含量测定。007728HE染色及免疫组织化学染色0078第三部分脑组织，常规石蜡包埋，按步骤进行常规HE染色，采用SP免疫组织化学染色法进行BDNF、GDNF及NFBP65染色。0079281图像处理说明书CN104127485A6/14页80080参照KATO分级方法，光学显微镜下对缺血侧皮质区组织学改变进行分级，标准如下级，皮层神经元细胞水肿，变形，无神经元死亡；级，少数神经元细胞死亡，梗死面积小于缺血侧皮质总面积的1/3；级，成。
26、片神经元死亡，梗死面积大于左侧皮层总面积的1/3小于总面积的2/3；级，大片神经元死亡，梗死面积大于左侧皮层总面积的2/3。0081282免疫组化图像分析0082在OLYMPUS光学显微镜下观察免疫组化染色切片，OLYMPUS数字显微照相机采集图像，在各组动物缺血侧左侧皮层、海马区各选取两个视野，计BDNF，GDNF及NFBP65阳性表达细胞数目，计算阳性细胞表达率。008329血清中NSE，脑匀浆中TNF、IL8、IL1、BAX、CASP3、BCL2含量的测定0084检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验ELISA。往预先包被神NSE或TNF、BAX、CASP3、BCL2抗体的包。
27、被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过孵育并彻底洗涤。用底物TMP显色，TMP在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NSE或TNF、IL8、IL1、BAX、CASP3、BCL2呈正相关。用酶标仪在450NM波长下测定OD值，计算样品浓度。0085操作步骤从室温平衡20MIN后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4保存。设置标准品孔和样本孔，标准品孔加各种不同浓度的标准品50L。样本孔先加待测样本10L，再加样本稀释液40L；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶HPR标记的检测抗体100L，。
28、用封板膜封住反应孔，37水浴锅或恒温箱温育60MIN。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1MIN，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次也可用洗板机洗板。每孔加入底物A、B各50L，37避光孵育15MIN。每孔加入终止液50L，15MIN内，在450NM波长处测定各孔的OD值。0086绘制标准曲线在EXCEL工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归，按曲线方程计算各样本浓度值。00873统计学处理方法0088运用SPSS170FORWINDOWS进行数据资料的统计分析，计量资料采用平均数标准差表示，组间比较采用单因素方差分析ONEWAYANOVA分。
29、析，方差检验齐者用最小显著差数LSD法，方差不齐者用GAMESHOWELL法检验，等级资料采用RIDIT检验，以P005。与假手术组比较，缺血再灌注损伤组脑匀浆中IL8含量显著升高P005。010644冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中BCL2、BAX含量的影响结果见表4、图6、图70107表4对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中BAX、BCL2含量的影响0108说明书CN104127485A109/14页110109注与缺血再灌注损伤组比较，P005。011144冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑匀浆中CASPASE3含量的影响结果见表5、图80112表5对脑缺。
30、血耐受模型大鼠脑匀浆中CASPASE3含量的影响011301140115注与缺血再灌注损伤组比较，P005。011745冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑组织病理形态学变化的影响0118451脑组织外观变化0119假手术组大鼠两侧大脑半球对称，沟、回清楚，未见水肿。缺血再灌注损伤组大鼠大脑冠状切面可见缺血侧左侧大脑中动脉供血中心区有明显的缺血坏死灶，同时可见缺血侧脑室水肿扩大。0120452脑切片HE染色01214521冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对大鼠脑缺血耐受模型脑组织皮质区病理改变的影响0122冬凌草提取物对脑组织皮质区病理观察如下照片见附录1假手术组光镜下大鼠大脑皮质区。
31、组织结构完整，神经元密集、排列规则，胞浆丰富，胞核明显；神经胶质细胞多，胞核清晰，与神经元、毛细血管周围间隙极小，无明显水肿。缺血再灌注损伤组大脑皮质区可见明显的椭圆形筛状软化灶，灶内神经元细胞消失或见少量固缩核残留；过渡区有明显水肿，神经纤维出现不完全溶解。BIT模型组大脑皮质区大部分神经元成片状坏死，可见少量筛状软化灶，灶内神经元细胞消失或见少量固缩核残留；过渡区神经元细胞水肿，神经纤维出现不完全溶解。尼莫地平组和脑络通胶囊组大脑皮质区梗死范围缩小，少数神经元坏死。神经元细胞水肿程度明显减轻。冬凌草提取物用药组大脑皮质区梗死范围明显缩小，神经元细胞水肿程度显著减轻，其中、小剂量冬凌草提取物。
32、组出现极少数样本神经元呈片状坏死。具体病理分级参见下表0123表6大鼠脑缺血耐受模型脑组织皮质区病理改变的影响0124说明书CN104127485A1211/14页130125注与缺血再灌注损伤组比较，P005，P001；与BIT模型组比较，P005，P0010126“”大脑皮质及神经细胞正常；“”大脑皮质神经元水肿、变性，无神经元坏死；大脑皮质水肿，少数神经元坏死，梗死面积占皮质的1/3以内；“”大脑皮质水肿，成片神经元坏死，梗死面积占皮质的1/32/3以内；“”大脑皮质水肿，大片神经元坏死，梗死面积占皮质的2/3以上。0127经RIDIT检验，与假手术组相比，缺血再灌注损伤组有显著的统计意。
33、义P001，说明造模成功。与缺血再灌注损伤组比较，尼莫地平组大鼠脑组织皮质区病理损伤显著改善P001，大、中、小剂量冬凌草提取物组和脑络通胶囊组大鼠脑组织皮质区病理损伤明显改善P005。与BIT模型组比较，尼莫地平组、大剂量冬凌草提取物组大鼠脑组织皮质区病理损伤明显改善P005。01284521冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对大鼠脑缺血耐受模型脑组织海马区病理改变的影响0129冬凌草提取物对脑组织海马区病理观察如下照片见附录1假手术组光镜下大鼠海马区组织结构完整，神经元密集、排列规则；胞浆丰富，核仁明显。缺血再灌注损伤组海马区神经元细胞稀疏，排列不规则，大部分细胞明显水肿，胞浆淡染，胞核皱缩，大。
34、部分呈片状坏死。BIT模型组海马区神经元细胞稀疏，排列不规则，细胞水肿胞浆淡染，胞核皱缩，呈点状坏死。尼莫地平组大部分海马区神经元细胞排列规则，少数细胞出现水肿，少数样本海马区结构清晰基本正常。脑络通胶囊组大部分海马区神经元细胞排列规则，细胞水肿，少数神经元坏死，个别样本海马区结构清晰基本正常。冬凌草提取物用药组大部分海马区神经元细胞排列规则，细胞水肿，少数神经元坏死，个别样本海马区结构清晰基本正常。具体病理分级参见下表0130表7大鼠脑缺血耐受模型脑组织海马区病理改变的影响01310132注与缺血再灌注损伤组比较，P005，P001；与BIT模型组比较，P005，P0010133“”海马区结。
35、构正常，神经细胞结构清晰；“”脑组织海马区水肿，神经元水肿，胞浆淡染；“”脑组织海马区水肿，神经元水肿，胞浆淡染，少数神经元坏死；“”脑组织说明书CN104127485A1312/14页14海马区水肿，成片神经元坏死，梗死面积占海马的1/3以内；“”脑组织海马区水肿，成片神经元坏死，梗死面积占海马的1/3以上。0134经RIDIT检验，与假手术组相比，缺血再灌注损伤组有显著的统计意义P001，说明造模成功。与缺血再灌注损伤组比较，尼莫地平组大鼠脑组织海马区病理损伤显著改善P001，大、中剂量冬凌草提取物组和脑络通胶囊组大鼠脑组织海马区病理损伤明显改善P005。与BIT模型组比较，尼莫地平组大鼠。
36、脑组织海马区病理损伤明显改善P005。013546冬凌草提取物对脑缺血耐受模型大鼠脑组织中GDNF表达的影响结果见表8、图90136表8各组大鼠脑组织海马CA1和CA3区GDNF阳性细胞表达率比较01370138注与缺血再灌注损伤组比较，P005，P001；与BIT模型组比较，P005，P0010139免疫组化染色显示，假手术组和缺血各组大鼠海马CA1区和CA3区均有GDNF的表达，阳性细胞产物呈浅棕黄色，位于神经元细胞胞浆中。由上表、图9可知，与缺血再灌注损伤比较，尼莫地平组、脑络通胶囊组海马CA1、CA3区GDNF阳性细胞表达率明显升高P001，P005，大、中、小剂量冬凌草提取物组海马C。
37、A1、CA3区GDNF阳性细胞表达率显著升高P001；与BIT模型组比较，大剂量冬凌草提取物组海马CA1区GDNF阳性细胞表达率明显升高P005，大、中剂量冬凌草提取物组海马CA3区GDNF阳性细胞表达率显著升高P001。014047冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑组织中BDNF表达的影响结果见表9、图100141表9各组大鼠脑组织海马CA1和CA3区BDNF阳性细胞表达率比较0142说明书CN104127485A1413/14页150143注与缺血再灌注损伤组比较，P005，P001；与BIT模型组比较，P005，P0010144免疫组化染色显示，假手术组和缺血各组大鼠海马。
38、CA1区和CA3区均有BDNF的表达，阳性细胞产物呈浅棕黄色，位于神经元细胞胞浆中。由上表、图10可知，与假手术组比较，缺血再灌注损伤组海马CA1、CA3区BDNF阳性细胞表达率明显升高P001，P005；与缺血再灌注损伤比较，尼莫地平组、脑络通胶囊组海马CA1、CA3区BDNF阳性细胞表达率明显升高P001，P005，大、中、小剂量冬凌草提取物组海马CA1、CA3区BDNF阳性细胞表达率明显升高P001，P005；与BIT模型组比较，脑络通脑络胶囊组海马CA1区BDNF阳性细胞表达率显著升高P001，大、中剂量冬凌草提取物组海马CA1区和CA3区BDNF阳性细胞表达率显著升高P001，小剂量。
39、冬凌草提取物组海马CA3区BDNF阳性细胞表达率明显升高P005。014548冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮对脑缺血耐受模型大鼠脑组织中NFBP65表达的影响结果见表10、图110146表10各组大鼠脑组织海马CA1和CA3区NFBP65阳性细胞表达率比较01470148注与缺血再灌注损伤组比较，P005，P001；与BIT模型组比较，P005，P001说明书CN104127485A1514/14页160149免疫组化染色显示，假手术组和缺血各组大鼠海马CA1区和CA3区均有NFBP65的表达，阳性细胞产物呈浅棕黄色，主要位于胞核，另有部分为胞浆表达。由图11、上表可知，与假手术组比较，缺血再灌。
40、注损伤组海马CA1、CA3区NFBP65阳性细胞表达率明显升高P001，P005；与缺血再灌注损伤比较，大、中剂量冬凌草提取物组海马CA1区和CA3区NFBP65阳性细胞表达率明显降低P001，P005，尼莫地平组海马CA1区NFBP65阳性细胞表达率明显降低P005。与BIT模型组比较，尼莫地平组、中剂量冬凌草提取物组海马CA1区NFBP65阳性细胞表达率明显降低P005，大剂量冬凌草提取物组海马CA1区NFBP65阳性细胞表达率显著降低P001。01505结论0151通过观察大鼠脑缺血耐受模型的神经功能缺失，死亡率，梗死面积百分比；检测血清中NSE水平，大鼠脑匀浆中TNFA、IL1、IL8。
41、、BCL2、BAX、CASPASE3含量；观察脑组织皮质区及海马区神经元细胞的病理改变；免疫组化法观察GDNF、BDNF、NFBP65阳性细胞表达率。可知冬凌草提取物可以改善模型大鼠神经功能评分，降低死亡率、减低梗死面积百分比，改善脑组织的病变情况；通过降低血清中NSE水平，提高脑匀浆中内源性抗凋亡因子BCL2蛋白含量及BCL2/BAX的比率，降低BCL2相关蛋白BAX含量，降低NFBP65表达，降低CASPASE3含量，从而抑制细胞凋亡，保护神经元细胞；增加神经营养因子GDNF、BDNF表达，进而增强机体内源性保护作用；降低脑匀浆中IL8含量，产生的适量TNF、IL1则可刺激机体产生内源性的。
42、保护机制，抑制所引起的炎细胞因子的过度释放。0152终上所述，冬凌草提取物包括冬凌草总黄酮可抑制缺血损伤所致炎症因子的过度释放，刺激机体产生内源性保护作用，抑制细胞凋亡，保护神经元细胞，进一步提高了缺血预处理对脑损伤的保护，提高脑缺血耐受，有效用于制备提高脑缺血耐受药物，从而实现冬凌草提取物在制备提高脑缺血耐受药物中的应用，开拓了冬凌草的新用途和药用价值。说明书CN104127485A161/6页17图1图2说明书附图CN104127485A172/6页18图3图4说明书附图CN104127485A183/6页19图5图6说明书附图CN104127485A194/6页20图7图8说明书附图CN104127485A205/6页21图9图10说明书附图CN104127485A216/6页22图11说明书附图CN104127485A22。