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1、10申请公布号CN104140980A43申请公布日20141112CN104140980A21申请号201410035933422申请日20140125C12N15/864200601A61K48/00200601A61K39/12200601A61P31/20200601A61P35/0020060171申请人北京工业大学地址100124北京市朝阳区平乐园100号72发明人周玉柏曾毅刘海庭方军沈思嗣李劲涛李泽琳74专利代理机构北京思海天达知识产权代理有限公司11203代理人刘萍54发明名称HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法57摘要HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法属于生物医。
2、药技术领域。本发明提供一种优化型的编码HPV18型HPV18主要衣壳蛋白L1的基因序列，以及含有其的2/1型重组腺相关病毒疫苗并提供了制备上述重组腺相关病毒的方法。本发明提供的重组HPV18L1的2/1型重组腺相关病毒疫苗可用于制备治疗和预防食管癌及宫颈癌的药物。51INTCL权利要求书1页说明书8页序列表1页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书8页序列表1页附图2页10申请公布号CN104140980ACN104140980A1/1页21HPV18的2/1型重组腺相关病毒，其特征在于，所述病毒含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2一种制备权利要求1所。
3、述2/1型重组腺相关病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤（1）将SEQIDNO1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒穿梭质粒中，得到重组腺相关病毒穿梭质粒；（2）用步骤（1）制备的重组腺相关穿梭质粒和PHELPER质粒、P5E18RXC1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病毒。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒穿梭质粒是质粒PAAVMCS。4根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒包装细胞是293FT细胞。5根据权利要求2所述的方法，其特征在于，三质粒采用QUICKSHUTTLE转染试剂按照摩尔比1。
4、11的比值进行三质粒共转染。6根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述疫苗的成分为权利要求1所述的2/1型重组腺相关病毒。7根据权利要求1所述基因在制备用于防治HPV引起的子宫颈癌的药物或疫苗组合物中的用途。8根据权利要求1所述基因在制备用于防治HPV引起的食管癌的药物或疫苗组合物中的用途。9根据权利要求2所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗宫颈癌药物或疫苗组合物中的用途。10根据权利要求2所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途。权利要求书CN104140980A1/8页3HPV18的重组腺相关病毒疫苗及其制备方法技术领域0001本发。
5、明属于生物医药技术领域。本发明涉及一种含密码子优化型HPV18L1基因的2/1型重组腺相关病毒疫苗及其制备方法。背景技术0002人乳头瘤病毒（HUMANPAPILLOMAVIRUS,HPV）是一种在自然界广泛存在的嗜上皮性病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属的无包膜闭环双链DNA病毒。20世纪70年代，ZURHAUSEN提出HPV是宫颈癌的病毒学成因，之后国内外学者就两者之间的关系进行了大量研究并提出90以上的宫颈癌是由于HPV感染引起，国际癌症研究协会IARC发表的研究显示超过2/3的子宫颈癌病例与HPV16型51或HPV18型162感染有关。00031982年SYRJANE的研究表明HPV。
6、和食管鳞癌之间存在相关性，之后的不少研究也证实了这一观点（SHENZY，XULY，LIEM，ETALTHEMULTISTAGEPROCESSOFCARCINOGENESISINHUMANESOPHAGEALEPITHELIALCELLSINDUCEDBYHUMANPAPILLOMAVIRUSONCOLREP，2004，1164754）其中曲鹏，李劲涛的研究也表明HPV感染可能是食管鳞癌的病毒学诱因，结果显示标本HPV感染率为826，其中HPV16型感染率348，HPV18型感染率348。（安阳地区不同食管鳞癌标本HPV感染率的比较研究，曲鹏，李劲涛）。0004全球范围内子宫颈癌是第二大常见的妇。
7、科恶性肿瘤，每年约有50万新增子宫颈癌病例，28万的死亡病例，我国每年新增宫颈癌病例约135万，占全球发病数量的L3，约8万人死亡。0005食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。0006根据HPV与良性和恶性肿瘤的相关度，将HPV病毒分为低危型和高危型两种。其中低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59等。HPV基因组L区的L1作。
8、为HPV的主要衣壳蛋白能够单独或与次要衣壳蛋白L2共同在体外自行组装成VLPS。已经上市并广为接种的两种针对HPV预防性疫苗，MERCK公司的HPV6、11、16、18四价VLPGARDASIL疫苗和GSK公司研制的HPV16、18双价VLPCERVARIX疫苗，都是由HPVL1蛋白组装成的VLPS。其作用机理是以VLP三作为靶抗原诱导机体产生特异性中和抗体达到预防相应型别HPV的感染。0007AAV属细小病毒科,为一缺陷病毒,是正链或负链单链DNA病毒,外包二十面体衣壳蛋白,病毒颗粒的直径在2026NM之间。AAV的复制依赖于辅助病毒HELPERVIRUS，如腺病毒或疱疹病毒。野生型AAV2。
9、WTAAV2基因组为线性单链DNA，大小约47KB。两末端各含一个倒置末端重复序列INVERTEDTERMINALREPEAT，ITR，中间含有REP和CAP基因。XIAO等（1998）将腺病毒上起辅助功能的基因全部构建到一个新的质粒上，由质粒代替腺病毒向RAAV2提供辅助功能，从而构建了重组II型AAV载体（RAAV2），它具有长时程有效表说明书CN104140980A2/8页4达外源基因、无致病性、免疫原性弱和基因定点整合等多项优点。重组2/1型AAVRAAV2/1是近年来出现的新型载体,采用AAV2的ITR,而仅将AAV2的外壳蛋白基因置换成AAV1的外壳蛋白基因，它在保持II型AAV载。
10、体高效表达外源基因、高安全性等优点的同时提供了更好的肌纤维细胞嗜性，是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。0008HPV18L1基因相对E6，E7癌基因而言更安全，且L1编码的蛋白能诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，而2/1型重组腺相关病毒（RAAV2/1）也具有长时程有效表达外源基因、无致病性等有点，因此可以开发制备防治食管癌和宫颈癌的基于HPV18L1的重组腺相关病毒疫苗。发明内容0009本发明提供了一种密码子优化型的编码HPV18主要衣壳蛋白L1的基因序列以及一种含有上述优化型基因的2/1型重组腺相关病毒（RAAV2/1）。0010一种制备所述2/1型重组腺相关病毒（RAAV2/1。
11、）的方法，其特征在于，包括如下步骤0011（1）将SEQIDNO1所示的核苷酸序列克隆到重组腺相关病毒穿梭质粒中，得到重组腺相关病毒穿梭质粒；0012（2）用步骤（1）制备的重组腺相关穿梭质粒和PHELPER质粒、P5E18RXC1质粒共转染腺相关病毒包装细胞，得到含有SEQIDNO1所示的核苷酸序列的2/1型重组腺相关病毒（RAAV2/1）。0013进一步，所述重组腺相关病毒穿梭质粒是质粒PAAVMCS。0014进一步，所述重组腺相关病毒包装细胞是293FT细胞。0015进一步，三质粒采用QUICKSHUTTLE转染试剂按照摩尔比111的比值进行三质粒共转染。0016进一步，所述疫苗的成分为。
12、所述的2/1型重组腺相关病毒。0017进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的子宫颈癌的药物或疫苗组合物中的用途。0018进一步包括，所述基因在制备用于防治HPV引起的食管癌的药物或疫苗组合物中的用途。0019进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗宫颈癌药物或疫苗组合物中的用途。0020进一步包括，所述的重组腺相关病毒疫苗在制备用于预防和/或治疗食管癌方面的药物或疫苗组合物中的用途。0021本发明更进一步提供一种HPV18的2/1型重组腺相关病毒疫苗，其有效成分为上述2/1型重组腺相关病毒。0022本发明提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒可用于制备治疗和预防子。
13、宫颈癌和食管癌的药物。0023本发明实现的技术效果如下0024本发明提供的HPV18的2/1型重组腺相关病毒，用于制备HPV18的2/1型重组腺相关病毒疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，细胞免疫效果也显著加强。说明书CN104140980A3/8页5附图说明0025图1AAVMCSHPV18L1重组质粒HINDIII，EORL双酶切电泳00261DNAMARKER1200000272MCSHPV8L1质粒100283MCSHPV8L1质粒200294MCSHPV8L1质粒300305MCSHPV8L1质粒400316MCSHPV8L1质粒50032图2腺相关病毒颗粒的电镜图0033图3RAAV。
14、2/1HPV18L1疫苗诱导的体液免疫0034图4RAAV2/1HPV18L1疫苗在BALB/C小鼠中诱导的细胞免疫具体实施方式0035材料和方法0036大肠杆菌DH5购自天根生化科技北京有限公司，DNAATAILINGKIT、PMD18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。HEK293FT细胞由北京工业大学生命学院病毒药理室王小利老师提供。含密码子优化型HPV18L1基因的质粒PMKRQ由周玉柏老师提供。限制性内切酶BGLII和SALI购自NEWENGLANDBIOLOGY公司，T4DNA连接酶、DNAMARKER购自宝生物工程（大连）有限公司。普通DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、P。
15、FUDNA聚合酶、DNTP均购自天根生化科技北京有限公司。质粒提取试剂盒（MIDI）、去内毒素质粒提取试剂盒（MAXI、MEGA）购自QIAGEN公司。预染蛋白MARKER购自FERMENTAS公司。脂质体转染试剂LIPOFECTAMINE2000购自INVITROGEN公司。DMEM培养基、OPTIMEMI培养基、胎牛血清（FETALBOVINESERUM，FBS）、青链霉素双抗购自GIBCO公司。小鼠抗HPV18L1单抗购自ABCAM公司，小鼠抗ACTIN单抗购自北京中杉金桥生物技术公司。羊抗小鼠IGG抗体（ANTIMOUSEIGGHLGOATANTIBODYIRDYE700DX）购自RO。
16、CKLAND公司。其它分析纯试剂由本实验室提供。脂质体转染试剂LIPOFECTAMINE2000购自INVITROGEN公司。QUICKSHUTTLE转染试剂购自北京康碧泉生物科技有限公司。DMEM培养基、RPMI1640培养基、QUICKSPOT小鼠IFNELISPOT预包被试剂盒、EZSEPTMMOUSE1X易得小鼠淋巴细胞分离液购自深圳达科为生物技术有限公司。其它分析纯试剂由本实验室提供。实验中设计的多肽由北京中科亚光生物科技有限公司合成。实验所需引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如下0037MCSF5ATAAGAATTCATGGCTCTGTGGCGGCCCAG30038MCSR5。
17、ATATAAGCTTTCACTTGCGGGCTCTCACGC30039本发明所涉及的分子生物学和免疫学等相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性和定量分析等在科学文献中都已有充分描述（如参见J萨姆布鲁克EF弗里奇T曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南（第二版）。0040实施例1重组PAAVHPV18L1质粒的构建004111PCR扩增HPV18L1基因片段以含密码子优化的HPV18L1基因的PMKRQ为模板，说明书CN104140980A4/8页6MCSF为上游引物，MCSR为下游引物PCR扩增HPV18L1基因片段。PCR完成后取1L反应溶液进行DNA凝胶（1）电泳检测。检测得到较好结果后回收PCR产物。。
18、004212小提并双酶切重组载体和HPV18L1质粒挑取冻存的PAAVMCS菌，接种到4MLAMP抗性的LB培养基中，37剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒，然后使用限制性内切酶ECORLI和HINDIII对PAAVMCS质粒和HPV18L1基因片段进行双酶切。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。取1L回收的DNA进行1琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。004313HPV18L1片段和PAAVMCS质粒的连接转化0044连接体系为适量的12中酶切回收的HPV18L1片段和PVR质粒，10T4LIGASEBUFFER25L，T4连接酶1L，补水至20L。16连接过夜。将全部的连接产物（2。
19、0L）加入至50LDH5感受态细胞中，冰中放置30分钟。42加热90秒后，再在冰中放置23分钟。然后加入400LLB培养基，37振荡培养45分钟。取100L已转化的感受态细胞，用弯头玻棒轻轻涂到含有KANA的LB琼脂平板培养基上。平板上液体被吸收后置于37恒温箱培养1216H。004514小提并鉴定重组质粒挑取平板上的单菌落接种到4ML氨苄抗性的LB培养基中，37剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒，然后使用限制性内切酶ECORLI和HINDIII对提取的质粒进行酶切鉴定，结果如图1所示，在相应的条带上有PAAVMCS和HPV18L1片段。初步鉴定正确后送北京华大基因测序。测序结果。
20、正确的重组质粒命名为PAAVHPV18L1。0046实验例2重组腺相关病毒RAAV2/1HPV18L1的制备，纯化，病毒滴度分析和电镜观察0047（1）重组腺相关病毒穿梭质粒PAAVHPV18L1和辅助质粒的制备0048使用QIAGENPLASMIDGIGAKITS质粒大量提取试剂盒分别提取重组腺相关病毒辅助质粒PHELPER、P5E18RXC1及重组腺相关病毒穿梭质粒PAAVHPV18L1。具体实验操作步骤见QIAGENPLASMIDGIGAKITS使用手册。0049（2）重组腺相关病毒的包装0050转染传代293细胞于70个75CM2培养瓶中，根据QUICKSHUTTLE试剂盒操作说明进行。
21、转染48GPHELPER、16GP5E18RXC1及重组腺相关病毒穿梭质粒16GPAAVHPV18L1的量混匀质粒加到500L的NACL生理盐水中。取160L的转染试剂加到500L的NACL生理盐水中。二者混匀之后加入到含有15ML细胞培养基的每瓶细胞中立传立转，交叉混匀（DNA和转染试剂12的比例），置375CO2继续培养。按此比例转染效果较好，包装出的腺相关病毒较多。转染后72小时，用细胞刮将细胞刮下，800RPM离心5MIN，弃上清，用2ML无菌PBS重悬细胞沉淀；80和37反复冻融3次，3000RPM取上清，即为重组腺相关病毒粗制品，命名为RAAV2/1HPV18L1,80保存备用。0。
22、051（3）重组腺相关病毒的纯化0052使用BIOMIGAVIRATRAPTMAAV2PURICATIONMAXIPREPKIT腺相关病毒纯化试剂盒对重组腺病毒进行纯化。准备腺相关病毒感染的细胞裂解液（68T75培养瓶/每根柱）1对于转染的细胞贴壁，用移液管吸去培养基，使用细胞刮收集，每瓶细胞用35毫升PBS。将细胞收集到50ML离心管中。2在350G，10分钟，沉淀细胞。细胞沉淀在80说明书CN104140980A5/8页7下保存，或者立即进行下面的步骤。3离心管中加入10ML（BINDINGBUFFER）结合缓冲液重悬细胞沉淀。确保在重悬后没有细胞团块。这对病毒颗粒的释放至关重要。4重悬后。
23、，加入100L为100核酸酶反应缓冲液（NUCLEASEREACTIONBUFFER）和15L核酸酶（NUCLEASE）在37温和震荡孵育3060MIN。5将离心管600G离心15MIN，收集含RAAV2/1HPV18L1上清液后用045M的滤膜过滤上清液。6采用硅胶柱纯化的方法，平衡硅胶柱，将硅胶柱放置在50ML的离心管中，在400G离心1分钟，使填料平整无气泡。将分离柱平置，拧开底部，让液体流出。先用4MLDDH2O然后8毫升结合缓冲液（BINDINGBUFFER）平衡柱。7将上清液加入纯化柱中，使上清液逐渐穿过纯化柱。收集滤出液，并重新加入该纯化柱中，使纯化柱中的病毒粒子能充分上样。洗掉。
24、纯化柱中的非特异性结合并洗脱RAAV2/1HPV18L1。8用10ML结合缓冲液洗柱，重复一次。上清液可以由自然流下或以400G离心5分钟。9用46ML洗脱缓冲洗脱RAAV2/1HPV18L1。收集洗脱液，1ML每管。收集的洗脱液使用脱盐柱在5000RPM离心10MIN。纯化的病毒通过022M的滤膜过滤。0053（4）重组腺相关病毒滴度的测定0054使用CELLBIOLABS,INCQUICKTITERTMAAV2QUANTITATIONKIT腺相关病毒滴度测定试剂盒对重组腺相关病毒进行滴度测定。通过测定腺相关病毒中DNA分子含量的原理，通过荧光染料发光值确定腺病毒含量。按照12比例建立标准样。
25、品曲线浓度从10微克/毫升，5微克/毫升，25微克/毫升，125微克/毫升，0微克/毫升，每个稀释度转移10L至微孔板。加入90ULGR染料到含有10L标准样品的96孔板。使用480/520NM波长设置荧光酶标仪读板，混合135UL纯化RAAV2/1HPV18L1样品和15UL1QUICKTITER试剂盒中的10C液，75孵育1小时短暂离心收集管壁的液滴，室温孵育20分钟。通过混合135L相同的纯化RAAV2/1HPV18L1和15UL10XC液准备未加热的对照样品。将10L未加热组和实验组样品的混合物到96孔板中，各孔分别加入90L的新鲜配制1GR染料，用荧光酶标仪480/520NM波段读板。
26、。根据标准曲线及说明书中的公式TITERGC/MLDILUTIONFACTORAAV22DNANG36108GC/NG15L/135L/0010ML计算RAAV2/1HPV18L1滴度约为881011VG/ML0055（5）重组腺相关病毒RAAV2/1HPV18L1电镜观察0056取10UL纯化的RAAV2/1HPV18L1病毒悬液用2磷钨酸复染3MIN，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。结果如图2所示，电镜下可见直径约20NM的病毒颗粒的存在。0057实验例3重组腺相关病毒RAAV2/1HPV18L1免疫效果的初步研究005831免疫小鼠的准备及免疫计划0059从商业途径获得的20只46周龄。
27、的SPF级的健康雌BALB/CH2KD小鼠随机分为2组，每组5只，在第一周大腿肌肉注射免疫，免疫后一周检测免疫反应。具体免疫内容和剂量见表1。0060表1小鼠免疫分组和剂量说明书CN104140980A6/8页80061006232免疫小鼠中HPV18L1体液免疫反应的检测0063免疫后一周采集小鼠的静脉血，分离血清。按文献报道的方法（BUCK,CB,DVPASTRANA,DRLOWY,ET,ALJVIROL2004,78751757）制备HPV16、18假病毒颗粒。1测定假病毒滴度1细胞的技术及上样。取一瓶生长良好细胞融合率达80左右的293FT细胞，弃去原液，PBS冲洗2遍。1ML005胰。
28、酶消化液到培养瓶细胞面的对侧，翻转培养瓶平放以确保胰酶完全覆盖细胞层，消化23分钟。加入中和DMEM培养液5ML终止消化，用吸管反复吹打培养细胞面十次，将瓶壁的细胞冲下来，再用吸管反复吹打培养液十五次，使细胞分散均匀。将培养液转移至15ML离心管，200G离心。弃上清，5MLDMEM重悬。细胞计数，约为2107。细胞稀释至密度为2105CELLS/ML。用排枪将细胞加入96孔培养板中（100UL/孔）。（注意每次加样前轻轻混匀细胞），将培养板放入细胞培养箱，37过夜。取一块96孔细胞培养板用中和DMEM稀释假病毒（100UL/孔）。2假病毒滴定。阳性对照加入肝素钠（100MG/ML肝素钠2UL。
29、/孔）。将上述步骤中的假病毒及肝素钠加入含有293FT细胞的96孔培养板中，将培养板放入细胞培养箱中，37培养72H。（注意不要摇动，轻轻放入培养箱中）。将005CHAPS加入96孔酶标板中（20UL/孔），均匀覆盖孔底。加入培养72H后的上清液（40UL/孔），65，30MIN灭活碱性磷酸酯酶。加入COLORINGSUBSTRATE（200UL/孔），室温放置23小时。（注意此步骤要严格避光）。用酶标仪测定A405NM。根据测定结果选择合适的假病毒浓度用于下游的血清抗体中和试验。00642测定中和抗体滴度。稀释293FT细胞到3105/ML，按100UL/孔铺于96孔细胞培养板中，37培养3。
30、H，按120稀释血清，按一定比例稀释SEAPPSV16，18，将20UL稀释血清加入到80UL稀释PSV中，冰浴1H，将混合液加入293FT细胞中，继续培养72H，未加入血清的孔作为阴性对照，每个标本及阴性对照为双复孔，在酶标板的孔中先加入005CHAPSINPBS，20UL/孔。加入细胞上清液40UL/孔，65，30MIN灭火内源性碱性磷酸酶，加入200ULPNP反应底物20ML二乙醇胺MGZN溶液，一片PNP，室温避光24小时，BIORAD550型酶标仪测定405NM波长下的OD值。以A405NM值低于阴性对照50判为阳性。RAAV2/1HPV18L1产生的抗体效价达到2560，表明重组腺。
31、相关病毒疫苗RAAV2/1HPV18L1能在BALB/C小鼠体内诱导较高的体液免疫应答（参见图2）。006533免疫小鼠中HPV18L1细胞免疫反应的检测0066加强免疫一周后，使用颈椎脱臼法处死小鼠并取脾脏，用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，采用酶联免疫斑点ELISPOT方法检测分泌IFN（干扰素）的T淋巴细胞。取50L2105/ML的小鼠脾淋巴细胞和等量的8G/ML多肽使用因特网HTTP/WWWBIMASCITNIHGOV/MOLBIO/HLA_BIND/上的BIMAS肽结合软件鉴定预测的T细胞识别肽H2KD限制并经常规合成技术合成加入已包被抗小鼠IFN抗体并封闭过的ELISPOT板中，。
32、每只小鼠做3复孔，另外，每只小鼠的阴性对照孔只加等量的细胞不加多肽，说明书CN104140980A7/8页9阳性对照孔加入细胞和终浓度为20G/ML的植物凝集素PHA。具体方法如下00671分离细胞。处死小鼠，浸入75的乙醇中浸泡12分钟，镊子摘下小鼠脾脏，培养皿中放入45ML淋巴细胞分离液使用前摇匀淋巴细胞分离液，研磨时只能点压，不能画圈研磨。轻轻研磨每一只脾脏时间最好控制5分钟之内，做完一只后都要拧上活塞，以防止液体挥发导致密度不均，不易成层。研磨液立即转移到离心管中，页面上覆盖上大约200500L的易养培养基（在加细胞培养基时候注意沿管壁加入）每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入。
33、离心管中，注意盖严管盖。在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。800G离心30分钟，应当控制降速的节奏。吸出淋巴细胞层至15ML管（吸取分离的淋巴细胞层时注意尽量多吸上层的细胞），缓慢加入10ML1640培养基，盖上盖后，颠倒610次，250G离心10分钟。弃上清，加入1MLLYMPHOSPOTTM无血清培养基重悬，细胞计数。00682细胞上样及孵育。1计数及计算将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静止3MIN，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后。
34、按公式计算细胞数/ML四大格细胞总数/4104（注意镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）。大概的细胞数量约为110107个。稀释时可先将细胞稀释到107/ML,再取300UL此时的细胞量为3106稀释到1ML加入700UL1640培养基即可，因此上样量为3106/ML。2预包被板的活化200L/WELLEZCULTURETM无血清培养基，室温静置510MIN后将其扣出。3加入细胞悬液,将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100L/WELL3105CELLS/WELL。阳性对照为10万。加入刺激物CONA或PHA10L/WEL。
35、L。加入按照网站预测合成的多肽刺激物（用LYMPHOSPOTTM无血清培养基配成终浓度为8UG/ML，10L/WELL）到实验孔。加完刺激物后不要再拍击ELISPOT板。4孵育所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37，5CO2培养箱培养1620HR。当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37培养1824H。碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。00693细胞培养后的显色操作（不再需要无菌操作）0070倾倒孔内的细胞及培养基。每孔加入200L冰冷的去离子水，410MIN（低渗法裂解细胞）。也可以将加了去离子水的。
36、板子放入20冰箱5MIN，再转入4冰箱5MIN，用以替代冰浴。为防结冰，板子放入20冰箱的时间不要超过5MIN。每孔用200LWASHINGBUFFER洗涤10次。最后一次，在吸水纸上扣干。按照试剂盒说明的浓度，每孔加入100L稀释好的生物素标记检测抗体，37孵育1H。每孔用200LPBST洗涤5次。最后一次，在吸水纸上扣干。按照试剂盒说明的浓度，每孔加100L稀释好的酶标亲和素，371小时。每孔用200LPBST洗涤5次。最后一次，在吸水纸上扣干。按照试剂盒的说明，解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100L的显色液，室温静置1545MIN（在2025，显色25MIN较合适），注意避光。37避。
37、光静置1215MIN，待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置1030MIN，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。将ELISPOT板置于BIOSYSBIOREADER4000PRO自动读板仪内，调说明书CN104140980A8/8页10节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。0071结果显示第2组小鼠脾淋巴细胞在相应的HPV18L1合成多肽的刺激下分泌IFN的细胞数量明显地高于第一组对照组，1106的脾淋巴细胞中的斑点数达到750结果参见图3，表明重组RAAV2/1HPV18L1疫苗能在BALB/CH2KD小鼠体内诱导较高的细胞免疫应答。说明书CN104140980A101/1页110001序列表CN104140980A111/2页12图1图2说明书附图CN104140980A122/2页13图3图4说明书附图CN104140980A13。