卷柏提取物的新用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101306023 B (45)授权公告日 2011.04.13 CN 101306023 B *CN101306023B* (21)申请号 200710054790.1 (22)申请日 2007.07.17 A61K 36/11(2006.01) A61P 17/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 河南中医学院 地址 450008 河南省郑州市金水路 1 号 (72)发明人 郑晓珂 冯卫生 (74)专利代理机构 郑州中原专利事务所有限公 司 41109 代理人 张绍琳 郑晓珂 . 卷柏化学成分及其植物雌激素样 作用机理研。

2、究 . 北京中医药大学博士学位论 文 .2006, (54) 发明名称 卷柏提取物的新用途 (57) 摘要 本发明提供了卷柏提取物用于抗辐照损伤的 新用途 ；而且提供了卷柏总提取物及卷柏水部 位抗辐照损伤的用途。 实验证明 ：卷柏提取物 能够抑制辐射对生物造成的损害，延长生物的存 活时间 ；卷柏的水部位能显著抑制辐射造成生 物的胸腺、脾脏细胞的凋亡 ；修正紊乱的细胞 周期，提高机体免疫功能 ；并对造血组织有明 显的放射防护效应。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 胡嘉蕴 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 4 页 。

3、CN 101306023 B1/1 页 2 1. 卷柏总提取物的新用途，其特征是 ：所述的卷柏总提取物，是将称取的新鲜卷柏 用自来水冲洗干净后放入容器，在容器内加入所称取新鲜卷柏重量 10 倍的水煎煮 1.5 小 时后过滤，过滤液待用，在滤渣内再加入所称取新鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过 滤，把 2 次滤液合并，在温度为 40-50，压力为 0.09-0.1MPa 的条件下浓缩得比率为 215-220 克 /1 千克新鲜卷柏的卷柏总提取物浸膏 ；所述的卷柏总提取物用于抗辐照损 伤。 2. 卷柏水部位的新用途，其特征是 ：所述的卷柏水部位是将称取的新鲜卷柏用自来 水冲洗干净，加入所称取。

4、新鲜卷柏重量 10 倍的水煎煮 1.5 小时后过滤，过滤液待用，在 滤渣内再加入所称取新鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过滤，把 2 次滤液合并，在温 度为 40-50，压力为 0.09-0.1MPa 的条件下浓缩得浸膏，再将浸膏用水溶解，依次用乙 醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将所剩部位在温度为 40-45，压力为 0.1MPa 的压力条件 下再采用常规的真空干燥方法干燥，得比率为 150 克 /1 千克新鲜卷柏的水部位干燥物 ； 所述的卷柏水部位用于抗辐照损伤。 权 利 要 求 书 CN 101306023 B1/12 页 3 卷柏提取物的新用途 技术领域 0001 本发明涉及卷柏提取物。

5、的新用途，尤其涉及卷柏提取物在抗辐照损伤中的用 途。 背景技术 0002 放射诊疗技术在医学领域的应用越来越普遍，现已成为治疗肿瘤的重要手段。 但对恶性肿瘤患者来说，大剂量放射治疗在杀伤癌细胞的同时也导致人体白细胞显著降 低、免疫功能减退、脱发等严重不良反应，甚至有时其损伤程度已超过了治疗作用，使 部分患者被迫终止放疗，这些已成为临床治疗恶性肿瘤的一大难题。 与此同时，随着科 学技术的高速发展，越来越多的电离辐射融入到人们的日常生活中，给机体带来了多方 面的损伤，如引起突变、诱发肿瘤，造成衰老和缩短寿命等，致使对辐射损伤的机制和 防护药物的研究成为人们关注的焦点。 0003 近几年的研究证明 。

6、：雌激素具有抗辐射损伤作用，它可提高受照射动物的存活 率，改善放射病临床症状，减轻辐射对造血的损伤作用。 但是，从天然植物中寻找研究 开发具有抗辐射损伤作用的成分和药物将更具发展前景。 0004 卷柏作为传统中药，在我国大部分地区均有产出。 利用其具有活血化瘀、通经 止血的作用，常用于治疗闭经、痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤哮喘、腹痛等病症 ；通过研 究，本发明人曾在专利申请号为 “200610017494.x” 的申请中披露了卷柏在增加雌激素 的用途。 发明内容 0005 本发明的目的，在于提供卷柏提取物的一种新用途，即卷柏总提取物在抗辐射 中的用途，和卷柏的水部位在提高机体免疫功能及抗辐射中的用。

7、途。 0006 本发明目的是采用以下技术方案实现的 ：卷柏提取物的新用途是 ：卷柏总提 取物的新用途，所述的卷柏总提取物，是将称取的新鲜卷柏用自来水冲洗干净后放入容 器，在容器内加入所称取新鲜卷柏重量 10 倍的水煎煮 1.5 小时后过滤，过滤液待用，在 滤渣内再加入所称取新鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过滤，把 2 次滤液合并，在温度 为40-50，压力为0.09-0.1MPa的条件下浓缩得比率为215-220克/1千克新鲜卷柏的卷 柏总提取物浸膏 ；所述的卷柏总提取物用于抗辐照损伤。 0007 卷柏提取物的新用途是 ：卷柏水部位的新用途，所述的卷柏水部位是将称取的 新鲜卷柏用自来水。

8、冲洗干净，加入所称取新鲜卷柏重量 10 倍的水煎煮 1.5 小时后过滤， 过滤液待用，在滤渣内再加入所称取新鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过滤，把 2 次 滤液合并，在温度为 40-50，压力为 0.09-0.1MPa 的条件下浓缩得浸膏，再将浸膏用 水溶解，依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将所剩部位在温度为 40-45，压力为 0.1MPa 的压力条件下再采用常规的真空干燥方法干燥，得比率为 150 克 /1 千克新鲜卷柏 的水部位干燥物 ；所述的卷柏水部位用于抗辐照损伤。 说 明 书 CN 101306023 B2/12 页 4 0008 不少体外、体内试验和流行病学调查研究均表。

9、明辐射对机体免疫功能、造血系 统的各个方面都可造成影响，并且可明显的缩短生物的存活时间。 实验证明 ：卷柏提取 物能够抑制辐射对生物造成的损害，延长生物的存活时间 ；卷柏的水部位能显著抑制辐 射造成生物的胸腺、脾脏细胞的凋亡，从而减轻放射损伤生物胸腺、脾脏的萎缩，提高 其胸腺、脾脏指数 ；还能修正紊乱的细胞周期，使细胞周期处于一种正常连贯的状态， 通过调节免疫细胞的周期进程，提高机体免疫功能而发挥其抗辐射作用 ；它还对造血组 织有明显的放射防护效应 ；在对生物采用辐射的实验中，用卷柏总提取物灌胃的小鼠存 活率明显提高。 附图说明 0009 图 1 为 60C o 射线对受照射雄性小鼠胸腺、脾脏。

10、脏器指数的影响 ； 0010 图 2 为 60C o 射线对受照射雌性小鼠胸腺、脾脏脏器指数的影响 ； 0011 图 3 为各组雄性小鼠胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率 ； 0012 图 4 为各组雌性小鼠胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率 ； 0013 图 5 为 60C o 射线对受照射雄性小鼠胸腺、脾脏和骨髓 G0/G1 期细胞的影响 ； 0014 图 6 为 60C o 射线对受照射雄性小鼠胸腺、脾脏和骨髓 S 期细胞的影响 ； 0015 图 7 为 60C o 射线对受照射雌性小鼠胸腺、脾脏和骨髓 G0/G1 期细胞的影响 ； 0016 图 8 为 60C o 射线对受照射雌性小鼠胸腺、脾脏和骨髓。

11、 S 期细胞的影响 ； 0017 图 9 为各组小鼠细胞早期凋亡率 ； 0018 图 10 为各组小鼠细胞晚期凋亡率。 0019 图中的卷柏组为卷柏水部位组。 具体实施方式 0020 实施例 1 ：称取新鲜卷柏，自来水冲洗干净后放入容器，在容器内加入所称取 新鲜卷柏重量 10 倍的水煎煮 1.5 小时后过滤，过滤液待用，在滤渣内再加入所称取新 鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过滤，把 2 次滤液合并，在温度为 40-50，压力为 0.09-0.1MPa 的条件下浓缩得卷柏总提取物浸膏，最后得到卷柏总提取物浸膏的比率为 215-220 克 /1 千克新鲜卷柏。 将所制得的卷柏提取物应用于生。

12、物抗辐射实验中。 0021 卷柏总提取物应用于生物抗辐射实验中效果及实验情况如下 ： 0022 昆明种 (KM) 雄性小鼠 40 只，购自河南省动物实验中心。 适应性喂养 2 天 后，按体重随机分为 4 组，每组 10 只，雌激素组用含量为 0.2mg/ml 尼尔雌醇混悬液给 小鼠灌胃，卷柏组用含量为 35.51mg/ml 卷柏总提取物的溶液给小鼠灌胃，给药量均按 0.2ml/10g 体重计算，正常组与模型组给予等体积蒸馏水 ；除正常组外，其他组均于灌胃 第 8 天 ( 雌激素组于接受照射前 1 天给药 ) 接受 8.0Gy60Co 射线全身照射 1 次，吸收剂 量率为0.612Gy/min。。

13、之后每天观察和记录各组动物死亡数，计算照射后30d存活率和死 亡动物平均存活时间。 结果如下 ： 0023 组别 药物浓度 (mg/m1) 死亡动物平均存活天数 (d) 存活率 ( ) 说 明 书 CN 101306023 B3/12 页 5 正常组 100 模型组 10.572.89 30 雌激素组 0.2 19.005.94 60 卷柏组 35.51 12.721.60 60 0024 注 ：与模型组比较，表示 P 0.01 ； 0025 由实验结果得知，提前灌胃卷柏总提取物的溶液，可提高辐照小鼠的存活率与 平均存活时间，且其提高辐照小鼠存活率的能力与雌激素组相当。 0026 实施例 2 。

14、：称取新鲜卷柏，自来水冲洗干净，加入所称取新鲜卷柏重量 10 倍的 水煎煮 1.5 小时后过滤，过滤液待用，在滤渣内再加入所称取新鲜卷柏重量 8 倍的水煎煮 1 小时，过滤，把 2 次滤液合并，在温度为 40-50，压力为 0.09-0.1MPa 的条件下浓缩 得浸膏。 再将浸膏用适量水溶解，依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将所剩部位在 温度为 40-45，压力为 0.1MPa 的压力条件下再采用常规的真空干燥方法干燥，得水部 位干燥物备用。 最后得到卷柏水部位干燥物的比率为 150 克 /1 千克新鲜卷柏。 将所制 得的卷柏提取物 - 水部位应用于生物抗辐射损伤研究。 0027 卷柏提取物。

15、 - 水部位应用于生物抗辐射之中效果及实验情况如下。 0028 实验所用材料及实验方法 ： 0029 1 实验材料 0030 1.1 动物 0031 昆明种 (KM) 小鼠 132 只，体重 (202)g，雌性 36 只，雄性 96 只，购自河南 省动物实验中心。 0032 1.2 药物与试剂 0033 卷柏水部位采用上述制备方法所制取的 ；RNase A、碘化丙啶(PI)购自Sigma公 司。 Annexin V-FITC 试剂盒购自 BD 公司 ；尼尔雌醇片，上海华联制药有限公司生产 ； 乙醇为国产分析纯。 0034 1.3 主要仪器 0035 FACS Calibur(B D USA)，。

16、高速冷冻离心机 (KDC-160H)， OLYMPUS 倒置显微 镜 (CKX41)， Theratron 780-C( 加拿大 )60Co 射线照射仪， WH-2 微型旋涡混合仪， HZS-H 水浴振荡器。 0036 2 实验方法 0037 2.1 照射剂量的选择 0038 经查阅文献，发现在做细胞凋亡率试验中，照射剂量有 5.0Gy 的报道。 为了进 一步确认该实验的最佳照射剂量，围绕文献报道选用4.0Gy、5.0Gy、6.0Gy三个照射剂量 进行预试验。 预试结果显示 4.0Gy、5.0Gy、6.0Gy 三个照射剂量对小鼠凋亡率的影响， 在任两个剂量之间比较都没有显著性差异，但从凋亡率来。

17、看，受6.0Gy照射的各组小鼠之 间差异较显著，故结合文献选用 6.0Gy 为正式试验的照射剂量。 0039 2.2 动物分组、照射及给药 说 明 书 CN 101306023 B4/12 页 6 0040 2.2.1 动物分组 0041 将 72 只 KM 种小鼠根据体重随机分为正常组、模型组、雌激素组、卷柏水部位 给药组。 每组 18 只，雌雄各半。 0042 2.2.2 照射 0043 除正常组外，其他各组小鼠均受 60C o 射线全身照射一次，照射剂量为 6.0Gy， 剂量率为 0.796Gy/min。 0044 2.2.3 给药 0045 各给药组小鼠分别于照射前 72、48、24h。

18、 和照射后即刻灌服药物 4 次。 模型组 和正常组灌服等体积蒸馏水。 雌激素组用含量为0.1mg/ml尼尔雌醇的溶液给小鼠灌胃， 卷柏水部位组用含量为 24.5mg/ml 卷柏水部位的溶液给小鼠灌胃，给药量均按 0.2ml/10g 体重计算。 0046 2.3 存活率实验 0047 2.3.1 动物分组 0048 另取 60 只雄性 KM 种小鼠，根据体重随机分为正常组、模型组、雌激素组、卷 柏水部位组，每组 10 只。 0049 2.3.2 给药与照射 0050 雌激素组用含量为 0.2mg/ml 尼尔雌醇混悬液给小鼠灌胃，卷柏组用含量为 35.51mg/ml 卷柏总提取物的溶液给小鼠灌胃，。

19、给药量均按 0.2ml/10g 体重计算，正常组 与模型组给予等体积蒸馏水 ；除正常组外，其他组均于灌胃第8天(雌激素组于接受照射 前1天给药)进行 60C o射线全身照射一次，照射剂量为8.0Gy，剂量率为0.796Gy/min。 照射后观察各组小鼠的活动状况，并计算其 30 天存活率，死亡动物平均存活天数。 0051 2.4 受照射小鼠胸腺、脾脏指数的测定 0052 受照小鼠分别于照射后6h、12h和24h断头处死小鼠，立即取出胸腺、脾脏，称 重，计算胸腺、脾脏指数 ( 胸腺 ( 脾脏 ) 湿重 ( 体重 )-1 100 )。 结果与正常组相 比，计算 P 值，考察有无统计学意义。 005。

20、3 2.5 胸腺、脾脏及骨髓单细胞悬液的制备 0054 受照小鼠分别于照射后 6h、12h 和 24h 断头处死小鼠，立即取出胸腺、脾脏和 股骨。 用生理盐水漂洗胸腺和脾脏表面血污，然后用眼科镊在小平皿内研磨分别制成胸 腺、脾脏单细胞悬液 ；并用 1ml 注射器吸取 1mlPBS 将股骨骨髓腔内细胞冲出，反复抽 吸，制成单细胞悬液。 0055 2.6 胸腺、脾脏及骨髓细胞凋亡检测 0056 2.6.1 单染 0057 将制备的单细胞悬液 3000r/min 离心 2min，弃上清，弹匀细胞后加入体积分数 为 70的冷乙醇，涡漩仪混匀后在温度为 4条件下放置。 0058 将固定的单细胞涡旋混匀后。

21、离心去除固定液，弹匀细胞加入 PBS 洗涤。 取 总数为 1.5106的单细胞悬液，离心弃去上清，弹匀细胞后加入 RNaseA37水浴作用 40min，再加入PI染色，避光在温度为4条件下放置1h，染色后加入300ulPBS，涡旋混 匀，300目尼龙网过滤，上机检测细胞凋亡率。 计数10000个细胞，进行细胞凋亡和细胞 周期分析。 以亚 G1 峰细胞为凋亡细胞，计算凋亡率。 说 明 书 CN 101306023 B5/12 页 7 0059 2.6.2 双染 0060 从制备的单细胞悬液中取出部分，用 PBS 洗涤，细胞计数。 取总数为 1106 的单细胞悬液用冷 PBS 洗一次，3000r/。

22、min 离心 2min，弃上清，弹匀细胞，加入 100ul bingding-Buffer涡旋混匀，然后分别加入5ul Annexin-V及5ul PI，涡旋混匀后室温避光染 色 30min。 染色后 300ul bingding-Buffer，涡旋混匀，300 目尼龙网过滤，上机检测。 0061 3. 数据表示及统计学方法 0062 存活率、凋亡率及细胞周期数值用百分率表示，其余数据用表示。 组间 存活率的比较用小样本四格表资料的 Fisher 精确检验法，胸腺脾脏指数与组间凋亡率的 比较用单项方差分析 (One-WayANOVA)。 数据处理用 SPSS 13.0 统计软件。 0063 实。

23、验结果 0064 一、卷柏对受照小鼠存活率的影响 0065 小鼠经 60C o 射线照射后，卷柏水部位对照射小鼠的生存率的影响，按照 2.3.2 项下方法进行检测。 0066 结果显示 ：模型组与正常组相比 30 天存活率明显降低 (p 0.01)。 卷柏组 的 30 天存活率及死亡动物平均存活天数均高于模型组，并与其相比，差异均极显著 (p 0.01) ；卷柏组的 30 天存活率稍高于雌激素组，死亡动物平均存活天数稍低于雌激素 组，但两者相比，差异不显著 (p 0.05)。 0067 表 1 受照射后各组小鼠 30 天存活率 0068 0069 注 ：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 。

24、P 0.01. 与模型组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0070 二、卷柏对受照射小鼠胸腺、脾脏指数的影响 0071 检测各组小鼠受照射后 6h、12h、24h 其胸腺、脾脏指数，按照 2.4 项下方法进 行检测。 0072 结果显示 ：小鼠经6.0Gy60Co射线照射后，胸腺、脾脏指数均低于正常组。 模 型组小鼠各时间的胸腺及脾脏指数与正常组相比，除雄性小鼠 6h 的脾脏指数为显著性差 异 (P 0.05) 外，其它的均为极显著性差异 (P 0.01)。 0073 雌激素组小鼠的胸腺指数均高于照射组，除 24h 雌性小鼠与照射组差异不显著 (p 0.05) 外，其他各组与照射。

25、组相同时间相比有显著差异 (p 0.05)。 0074 雌激素组小鼠脾脏指数与模型组相比，均无显著性差异(p0.05)，但趋势不一 样 ：雄性小鼠的 12h、24h 脾脏指数高于模型组，其他各组则低于模型组。 0075 卷柏组小鼠的各时间胸腺指数均高于照射组，但无统计学意义(p0.05)，其各 时间的脾脏指数低于照射组，也无统计学意义 (p 0.05)。 与雌激素组各时间胸腺、脾 说 明 书 CN 101306023 B6/12 页 8 脏指数相比，作用近似，无显著差异(p0.05)，但趋势不同 ：雌性小鼠6h、24h的脾脏 指数高于雌激素组，其它各组均低于雌激素组。 结果见表 2，图 1，图。

26、 2 0076 表 2 60Co 射线对受照射小鼠胸腺、脾脏指数的影响 0077 0078 注 ：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01 ；与模型组比较，表 示 P 0.05，表示 P 0.01。 0079 与雌激素组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0080 三 . 卷柏水部位对受照射小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞凋亡的影响 0081 采用流式细胞术，通过单染及双染方法，检测各组小鼠受照射 6h、12h、24h 胸 腺、脾脏、骨髓细胞凋亡率。 0082 (1)PI 单染观察卷柏对受照射小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞凋亡的影响 0083 按照 2.6.1 项下方法进行检测。 0。

27、084 结果显示 ：小鼠经 6.0Gy60Co 射线照射后，其各时间的胸腺、脾脏和骨髓细胞 凋亡率均高于正常组 ；胸腺细胞的凋亡率均高于脾脏、骨髓细胞凋亡率。 0085 模型组小鼠各时间的胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率均高于正常组，与正常组相 比差异极显著 (P 0.01)。 0086 雌激素组小鼠的胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率均低于模型组相应时间细胞凋亡 率，且其各时间的胸腺、6h 的脾脏、雄性小鼠 6h 及雌性小鼠 12h 的骨髓细胞凋亡率与 模型组相比，有极显著性差异 (P 0.01)，其它的与模型组相比，无显著性差异 (P 0.05)。 0087 卷柏水部位组雄性小鼠各时间的胸腺、脾脏及骨髓。

28、细胞凋亡率均低于模型组 相同时间凋亡率，其 12h、24h 的胸腺、6h 的脾脏与模型组相比，有极显著性差异 (P 0.01)，其6h的胸腺细胞凋亡率与模型组相比，差异显著(P0.05)，其它的差异均不 显著(P0.05) ；胸腺、脾脏及骨髓细胞凋亡率大多数高于雌激素组相同时间凋亡率(其 12h 的胸腺细胞和 24h 的脾脏细胞凋亡率低于雌激素组 )，但与其相比，除 24h 的胸腺， 6h 的脾脏及骨髓与其差异显著 (P 0.01， P 0.01， P 0.05) 外，其它的差异均不显 著 (P 0.05)。 0088 卷柏水部位组雌性小鼠细胞凋亡率均低于模型组相同时间凋亡率，其 12h、24。

29、h 的胸腺，6h 的脾脏，12h 的骨髓细胞凋亡率与模型组相比，差异极显著 (P 0.01) ；其 它的与模型组相比，无显著性差异 (P 0.05)。 其 12h、24h 的胸腺和 24h 的脾脏，6h 的骨髓细胞凋亡率均低于雌激素组相同时间的凋亡率，其它的高于雌激素组凋亡率，但 说 明 书 CN 101306023 B7/12 页 9 与雌激素组相同时间的细胞凋亡率相比，除 6h 的脾脏细胞凋亡率与其有显著性差异 (P 0.01) 外，其它的均无显著性差异 (P 0.05)，结果见表 3，表 4，图 3，图 4。 0089 表 3 雄性小鼠胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率 0090 0091 注 。

30、：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01. 与模型组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0092 与雌激素组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01 0093 表 4 雌性小鼠胸腺、脾脏和骨髓细胞凋亡率 0094 0095 注 ：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01 ；与模型组比较，表 示 P 0.05，表示 P 0.01 ； 0096 与雌激素组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0097 (2) 卷柏水部位对受照射小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞周期的影响 0098 小鼠经 60C o 射线照射后，从 G0/G1 期、 G2/M 期和 S 。

31、期探讨了卷柏水部位对 受照小鼠小胸腺、脾脏、骨髓细胞周期的影响。 按照 2.6.1 项下方法进行检测。 0099 G0/G1 期 ： 0100 结果显示，模型组小鼠的 6h、24h 胸腺 G0/G1 期细胞百分率高于正常组，与正 常组相比差异极显著 (P 0.01) ；但其 12h 胸腺 G0/G1 期细胞百分率低于正常组，且雄 性模型组小鼠与正常组相比，差异极显著 (P 0.01)，而雌性小鼠与正常组相比，无显 著性差异 (P 0.05)。 模型组小鼠脾脏、骨髓的各时间 G0/G1 期细胞百分率均高于正常 组，且与正常组相比，差异极显著 (P 0.01)。 说 明 书 CN 10130602。

32、3 B8/12 页 10 0101 雌激素组小鼠胸腺、脾脏、骨髓的各时间 G0/G1 期细胞百分率均低于模型组， 但与模型组相比，差异不显著 (P 0.05) ；只有脾脏的 6hG0/G1 期细胞百分率与模型组 相比，差异显著 (P 0.05)。 0102 卷柏水部位组小鼠胸腺、脾脏、骨髓的各时间 G0/G1 期细胞百分率均低于模型 组，与模型组相比，除6h的脾脏G0/G1期细胞与其有极显著性差异(P0.01)外，其它 的均无显著性差异 (P 0.05) ；卷柏水部位组小鼠胸腺、脾脏、骨髓的各时间 G0/G1 期 细胞百分率低于雌激素组，但与雌激素组相比，除 24h 的胸腺 G0/G1 期细胞。

33、与其有显著 性差异 (P 0.05) 外，其它的均无显著性差异 (P 0.05)。 0103 G2/M 期 ： 0104 模型组小鼠的胸腺、脾脏、骨髓的各时间 G2/M 期细胞百分率有低于正常组的 趋势，且其 12h 的胸腺、24h 的骨髓 G2/M 期细胞百分率均近似为零，但其 6h 脾脏和骨 髓的 G2/M 期细胞百分率则高于正常组 ；从统计学上来说，其雄性小鼠的 6h、12h 脾脏 G2/M 期细胞百分率与正常组相比，差异极显著 (P 0.01)，其它的差异均不显著 (P 0.05)。 0105 雌激素组雄性及雌性小鼠的胸腺、脾脏、骨髓的各时间 G2/M 期细胞百分率与 模型组相比，结果。

34、不是太一致。 0106 雄性小鼠 ：6h脾脏及骨髓的G2/M期细胞百分率低于模型组 ；雌性小鼠 ：6h脾 脏、24h 胸腺及脾脏 G2/M 期细胞百分率均低于模型组，其它的均高于模型组。 0107 不过从总体来看，雌激素组与模型组相比，差异均不显著 (P 0.05)。 0108 卷柏水部位组小鼠胸腺、脾脏、骨髓的 G2/M 期细胞百分率与模型组相比，结 果同雌激素组与模型组相比的结果一致。 其胸腺、脾脏、骨髓的 G2/M 期细胞百分率与 雌激素组比，结果不是太一致，不过从总体上来看，其与雌激素组相比，无显著性差异 (P 0.05)。 0109 S 期 ： 0110 模型组胸腺、脾脏和骨髓的各时。

35、间点 S 期细胞百分率均低于正常组 ( 其 6h、12h 的胸腺 S 期细胞百分率高于正常组 )，且与正常组相比，差异均极显著 (P 0.01)( 其 6h 的胸腺 S 期细胞百分率与正常组相比，无显著性差异 (P 0.05)。 0111 雌激素组胸腺、脾脏、骨髓的各时间 S 期细胞百分率与模型组相比，结果不一 致。 其 12h 胸腺及脾脏的 S 期细胞百分率均低于模型组，其它的高于模型组。 不过从总 体上来看，其与模型组相比，差异不显著 (P 0.05)。 0112 卷柏水部位组胸腺、脾脏、骨髓的 S 期细胞百分率与模型组相比的结果类似于 雌激素同模型组相比的结果。 其胸腺、脾脏、骨髓的 S。

36、 期细胞百分率均低于雌激素组， 但与雌激素组相比，差异不显著 (P 0.05)。 0113 总之，模型组小鼠细胞周期处在一种紊乱状态，其胸腺、骨髓 12h、24h 的 G2/ M 期几乎为零，而照射前给予卷柏水部位可明显降低其胸腺、脾脏、骨髓 G0/G1 期细胞 百分率，升高其 G2/M 期、 S 期细胞百分率，提示卷柏水部位似乎能修正紊乱的细胞周 期，使细胞周期处于一种正常连贯的状态 ；结果见表 5，表 6，表 7，图 5，图 6，图 7， 图 8。 0114 表 560Co 射线对受照射小鼠胸腺周期的影响 说 明 书 CN 101306023 B9/12 页 11 0115 0116 注 。

37、：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01 ；与模型组比较，表 示 P 0.05，表示 P 0.01 ；与雌激素组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0117 表 660Co 射线对受照射小鼠脾脏周期的影响 0118 0119 表 760Co 射线对受照射小鼠骨髓周期的影响 0120 0121 (3)Annexin V-FITC/PI 双染观察卷柏对受照射小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞早期 凋亡与晚期凋亡的影响 说 明 书 CN 101306023 B10/12 页 12 0122 小鼠经 60C o 射线照射后，按照 2.6.2 项下方法进行。 0123 其数据由 FACS。

38、Calibur 流式细胞仪和 CELLQuest 软件获取。 在二维的 FCM 分 析图上，细胞分为 4 个亚群 ：左下象限，AnnexinV FITC-/PI- 为活细胞群 (V) ； 0124 右 下 象 限， AnnexinV FITC+/PI- 为 凋 亡 细 胞 (AP) ； 右 上 象 限， AnnexinVFITC+/PI+ 细胞已具有了坏死细胞 (N) ；左上象限， AnnexinV FITC-/PI+ 为培 养操作过程中出现的机械损伤细胞 8。 0125 结果显示，受照射小鼠的早期凋亡率及晚期凋亡率均低于正常组。 0126 早期凋亡率 ： 0127 模型组胸腺、脾脏、骨髓细胞。

39、的各时间凋亡率均高于正常组，且与正常组相 比，均有极显著性差异 (P 0.01)。 0128 雌激素组胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均低于模型组，除骨髓细胞凋 亡率与模型组相比差异极显著 (P 0.01) 外，其他均为显著性差异 (P 0.05)。 0129 卷柏水部位组胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均低于模型组，并与其相 比，有显著性差异 (P 0.05) ；其胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均高于雌激素 组，但与雌激素组相比，差异不显著 (P 0.05)。 0130 晚期凋亡率 ： 0131 模型组胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均高于正常组，且与其相比，均 有极显著性差异 (。

40、P 0.01)。 0132 雌激素组胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均低于模型组，除其骨髓细胞 凋亡率与模型组相比，差异极显著 (P 0.01) 外，其胸腺、脾脏的各时间细胞凋亡率与 模型组相比，均为显著性差异(P0.05)，其细胞凋亡率与正常组相比仍有高的趋势，但 其6h、24h的胸腺，6h、12h的脾脏，12h、24h的骨髓细胞凋亡率与正常组相比，已无显 著性差异 (P 0.05) ；其它的与正常组相比，均有显著性差异 (P 0.05)。 0133 卷柏水部位组胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均低于模型组，且与其相 比差异显著 (P 0.05) ；其胸腺、脾脏、骨髓细胞的各时间凋亡率均。

41、高于雌激素组，但 与雌激素组相比，差异不是太显著 (P 0.05)。 卷柏组 12h 的脾脏，12h、24h 的骨髓细 胞凋亡率高于正常组，但与正常组相比，无显著性差异 (P 0.05)。 其结果见表 8，图 9，图 10。 0134 表 8 小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞早期与晚期凋亡率 0135 说 明 书 CN 101306023 B11/12 页 13 0136 注 ：与正常组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01 ；与模型组比较，表 示 P 0.05，表示 P 0.01。 0137 与雌激素组比较，表示 P 0.05，表示 P 0.01。 0138 用含量为16.4mg/ml及含量为。

42、24.5mg/ml卷柏水部位的溶液给小鼠灌胃给药后， 做抗辐照诱导小鼠损伤的实验。 实验所用材料及实验方法与实施例 1 相同，实验结果也 显示出具有抗辐射作用。 0139 从上述实验结果可以得出，卷柏水部位是具有抗辐射作用的，并对造血组织有 明显的放射防护效应。 0140 因为，快速分裂的胸腺细胞对免疫毒物最为敏感。 因此，本研究为避免小鼠胸 腺生理性萎缩，特选刚断乳的幼年小鼠作为研究对象，从细胞免疫、造血功能角度，探 讨辐射对胸腺、脾脏、骨髓细胞的影响，以及卷柏抗辐照的时间 - 效应关系，为有效利 用卷柏水部位和防治辐射损伤提供科学依据。 0141 存活率是反映抗辐射作用的最基本、最客观的综。

43、合性指标，抗辐射的最终目的 就是为了提高存活率和延长存活时间。 从表 1 可以看出，小鼠经 8.0Gy60Co 射线全身照 射后，卷柏水部位组的 30 天存活率及死亡动物平均存活天数较模型组有了很大的提高， 显示卷柏具有抗辐射作用。 0142 放射线可通过直接和间接作用，损伤细胞 DNA、生物膜以及其它生物大分子， 引起细胞周期紊乱，从而造成细胞坏死和细胞凋亡，而免疫器官(如胸腺和脾脏)和造血 器官 ( 如脾脏和骨髓 ) 对放射线又极为敏感，故辐射很容易加重机体免疫功能低下或紊 乱，使淋巴 T 细胞失去调节机体免疫的作用，使造血干细胞失去造血活性，进而加速这 些细胞的凋亡。 0143 本实验主。

44、要利用流式细胞仪来检测细胞凋亡，鉴于单染和双染各自的特点，我 们采用 PI 单染结合 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞法，对全胸腺、脾脏和骨髓的各自 混合细胞进行凋亡检测。 0144 结果显示 ：从 PI 单染结果看，与正常组相比，模型组小鼠胸腺、脾脏细胞都大 量凋亡和坏死，这与其胸腺、脾脏指数的急剧下降相一致。 其中模型组细胞凋亡率与坏 死率最高，明显高于正常组、雌激素组及卷柏组，这也与模型组小鼠胸腺、脾脏指数明 显低于后三组相一致。 辐射所致的免疫功能改变是辐射损伤的的主要表现之一。 胸腺 和脾脏是参与免疫功能调节的机体重要的免疫器官，是高辐射敏感的细胞群。 一般情况 说 。

45、明 书 CN 101306023 B12/12 页 14 下，机体受辐射后期胸腺指数、脾脏指数都会下降，机体免疫功能降低。 卷柏能够显著 抑制辐射造成的实验小鼠胸腺、脾脏细胞的凋亡，从而减轻放射损伤小鼠胸腺、脾脏的 萎缩，提高其胸腺、脾脏指数。 0145 免疫器官对辐射是较为敏感的。 本试验结果也显示，胸腺细胞的凋亡率在各时 间均高于脾脏、骨髓细胞凋亡率，模型组小鼠胸腺细胞凋亡率最高可达到 62.41，说明 辐射对胸腺的影响是比较大的。 胸腺细胞的凋亡率在 12h 最高，而卷柏组雄性和雌性小 鼠 12h 的胸腺细胞凋亡率却低于相同时间的雌激素组胸腺细胞凋亡率，显示卷柏水部位 对胸腺比雌激素更好。

46、的辐射防护作用。 0146 骨髓作为造血的主要器官对辐射也是比较敏感的。 从单染结果来看，与正常组 相比，受照射小鼠骨髓细胞大量凋亡和坏死，其中模型组细胞凋亡率与坏死率最高，明 显高于正常组、雌激素组及卷柏组。 卷柏组小鼠 6h、12h、24h 的骨髓细胞凋亡率均低于 模型组相同时间凋亡率，并与其相比有极显著性差异 (P 0.01) ；而与雌激素组相同时 间凋亡率相比差异不显著，表示卷柏在对骨髓的辐射防护能力上与雌激素近似。 0147 从双染来看，模型组小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率均 明显高于正常组、雌激素组、卷柏水部位组 ；卷柏水部位组小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞 的早期凋亡。

47、率及晚期凋亡率与雌激素组相差不大，并与雌激素组相比，差异不显著，这 与单染的结果是一致的。 从单染和双染总的结果来看，卷柏水部位组小鼠的细胞凋亡率 与雌激素组差异均不是太显著。 由此可以看出，卷柏具有抗辐射作用，并提示，卷柏水 部位的抗辐射能力可能是其提高受辐照小鼠的 30 天存活率，延长其平均存活时间的作用 机理之一。 0148 电离辐射对胸腺、脾脏及骨髓细胞周期的影响是辐射对免疫及造血损伤与修复 研究的重要基础。 细胞周期中有两个基本调控点，即 G1/S 和 G2/M 过度点。 前者决定 细胞能否进入细胞周期，后者决定细胞能否进入 M 期完成有丝分裂。 本实验结果显示， 模型组小鼠的脾脏、。

48、骨髓及6h、24h的胸腺G0/G1期细胞百分率高于正常组，S期细胞百 分率低于正常组，说明射线对 DNA 合成有抑制作用，且主要发生在 G1 期到 S 期。 细胞 出现明显的G0/G1期阻滞，提示6.0Gy 60Co射线全身照射主要对细胞周期的调节作用可 能是抑制细胞从G1期进入S期，从而抑制细胞增殖，凋亡率相应增加。 并有证据表明， G0/G1 期阻滞是细胞凋亡的重要因素之一。 照射引起 G2/M 期细胞减少，多数为零，说 明辐射对细胞进入 M 期完成有丝分裂也有抑制作用，使细胞周期处在一种紊乱状态。 0149 照射前给予卷柏水部位可明显降低其胸腺、脾脏、骨髓 G0/G1 期细胞百分率， 升高其G2/M期、S期细胞百分率，说明卷柏对受辐射小鼠胸腺、脾脏、骨髓细胞周期的 影响，主要。