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1、10申请公布号CN104131013A43申请公布日20141105CN104131013A21申请号201410364872622申请日20140728C12N15/29200601C12N15/82200601C07K14/415200601A01H5/0020060171申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号72发明人林拥军周勇74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人张红兵54发明名称一个调控水稻叶片衰老的基因OSSWEET5及应用57摘要本发明属于植物基因工程领域，具体涉及到一个调控水稻叶片衰老的基因OSSWEET5及应用。该基因的核酸序列如SEQI。
2、DNO1的11363位所示，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO2所示。构建了由CAMV35S启动子驱动该基因表达的双元表达载体，利用农杆菌介导法转化水稻宿主，得到超量表达的转基因水稻植株。检测结果表明，转基因水稻植株叶片衰老进程明显加速，说明该基因在水稻中具有调控叶片衰老的功能。本发明得到的超量表达转基因植株改变了叶片衰老进程，为基因工程和分子育种提供了新的资源。51INTCL权利要求书1页说明书11页序列表5页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书11页序列表5页附图3页10申请公布号CN104131013ACN104131013A1/1页21一个来源于。
3、水稻的OSSWEET5基因在调控叶片衰老进程中的应用，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2一个来源于水稻的OSSWEET5基因的编码蛋白在调控叶片衰老进程中的应用，其特征在于，所述的基因编码蛋白质的序列如序列表SEQIDNO2所示。3一个超量表达载体P1300SOSSWEET5，其特征在于，该载体含有如权利要求1所述的基因。4如权利要求1所述的基因OSSWEET5的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述基因OSSWEET5的表达载体转入水稻，以超量表达该基因从而加速叶片衰老进程。5一种改变目的植物叶片衰老进程的方法，其特征在于，通过提高权利要求1所述基因OSSWE。
4、ET5的表达量来加速叶片衰老进程。6如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目的植物为单子叶植物或双子叶植物。7如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的单子叶植物为水稻、玉米、小麦和草坪草。8如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的双子叶植物为拟南芥、杨树、大豆和棉花。权利要求书CN104131013A1/11页3一个调控水稻叶片衰老的基因OSSWEET5及应用技术领域0001本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻叶片衰老相关基因OSSWEET5及应用。背景技术0002高等植物的叶片是进行光合作用合成光合产物主要是糖类的主要器官。光合产物在源叶片中合成后，首先从叶肉细胞运至。
5、韧皮部，然后经韧皮部的装载、运行、卸载后，输送到库器官，以供库器官的生长发育。如果增大农作物源的装载能力或库的卸载能力，将会有更多的光合产物输入库器官，这将对提高农作物的产量有很大的帮助。而叶片衰老会导致光合作用的下降，减少碳同化，从而影响农作物的产量。因此，有计划的控制叶片衰老的发生，使光合产物朝人们所希望的方向转运，对于控制农作物的产量具有重要的意义。0003单糖是大多数异养生物中碳源和能源的主要来源，也是植物生长发育的基本能量和营养物质BTTNER等，MONOSACCHARIDETRANSPORTERSINPLANTSSTRUCTURE,FUNCTIONANDPHYSIOLOGYBIOC。
6、HIMICABIOPHYSICAACTA,2000,1465263274。由于单糖在运输的过程中很容易被水解，而且常会引起细胞渗透压的变化，因而通常转变为蔗糖或其衍生物的形式进行长距离运输；当其到达库器官后，又被重新水解成单糖，由单糖转运蛋白转运到库器官，从而被吸收和利用王俊刚等，植物单糖转运蛋白，植物生理学通讯，2007，43611951200；郭婷等，甘蔗单糖转运蛋白基因SHPST2A克隆及亚细胞定位，热带作物学报，2013，343429432。因此，单糖在植物体内的运输与分配显得非常重要。单糖转运蛋白影响着单糖的转运、积累和分配，从而对植物的生长发育有着重要的影响。0004MTN3/SA。
7、LIVA/SWEET家族蛋白普遍含有2个MTN3/SALIVA跨膜结构域的，其成员广泛存在于动植物和微生物中。最近有研究者分析了各个物种中的MTN3/SALIVA/SWEET家族，鉴定了一些可以转运单糖的MTN3/SALIVA/SWEET蛋白YUAN等，RICEMTN3/SALIVA/SWEETFAMILYGENESANDTHEIRHOMOLOGSINCELLULARORGANISMSMOLPLANT,2013,6665674；YUAN等，RICEMTN3/SALIVA/SWEETGENEFAMILYEVOLUTION,EXPRESSIONPROFLING,ANDSUGARTRANSPORTJ。
8、INTEGRPLANTBIOL,2014,56559570。研究表明一些MTN3/SALIVA/SWEET蛋白可以作为单糖转运蛋白来影响植物的生长发育。ATSWEET16定位于液泡，可以转运葡萄糖、果糖和蔗糖，超表达ATSWEET16的转基因植株中单糖和蔗糖含量都发生明显改变，同时萌发率和耐寒性都显著增强KLEMENS等，OVEREXPRESSIONOFTHEVACUOLARSUGARCARRIERATSWEET16MODIFIESGERMINATION,GROWTH,ANDSTRESSTOLERANCEINARABIDOPSISPLANTPHYSIOL,2013,16313381352。AT。
9、SWEET17是拟南芥中的一个液泡果糖转运蛋白，能将果糖从液泡内转运到细胞质中，它的突变体植株生长迟缓，叶片糖含量发生明显变化，而且种子产量受到了影响，说明ATSWEET17可以调控拟南芥叶片中果糖的含量，在植物碳水化合物的分配过程中起着重要的作用CHARDON等，LEAFFRUCTOSECONTENTISCONTROLLEDBYTHEVACUOLARTRANSPORTERSWEET17INARABIDOPSISCURRBIOL,2013,23697702。说明书CN104131013A2/11页40005水稻是人类主要的粮食作物之一，采用分子遗传调控的手段来控制叶片的衰老，使光合产物朝人们所。
10、希望的方向转运，这对于控制农作物的产量具有重要的意义。发明内容0006本发明的目的在于提供一个水稻叶片衰老相关基因在调控水稻叶片衰老进程中的应用。0007在申请人之前的研究中，一个MTN3/SALIVA/SWEET基因OSSWEET5编码一个可以转运半乳糖，而不能转运蔗糖的蛋白，同时OSSWEET5的超量表达转基因植株不仅叶片衰老进程加速，而且叶片中单糖和蔗糖含量都发生了明显改变ZHOU等，OVEREXPRESSIONOFOSSWEET5INRICECAUSESGROWTHRETARDATIONANDPRECOCIOUSSENESCENCEPLOSONE,2014,9E94210。本发明就是利。
11、用有关分子生物学方法，构建了由CAMV35S启动子驱动OSSWEET5表达的双元表达载体，并用农杆菌介导法转化水稻，并将之用于水稻的基因工程改良，从而调控水稻叶片糖类的分配和衰老进程。0008上述调控叶片衰老的基因来源于水稻，它是下列核苷酸之一00091SEQIDNO1的11363位所示的核苷酸序列；00102SEQIDNO2所示的蛋白质序列。00113此外，本发明还涉及水稻叶片衰老相关基因OSSWEET5的表达载体构建，该载体包含有超量表达的如序列表SEQIDNO1的11363位所述核苷酸序列的基因。0012本发明克隆的水稻叶片衰老相关基因OSSWEET5具有以下开发前景00131为了便于对。
12、转基因的细胞或植物进行筛选，可以对所使用的载体进行改造，例如加入植物可选择性标记例如BAR基因、GUS基因、GFP基因和LUX基因等，这些基因都是报道的常见标记基因；00142为了改变目的基因OSSWEET5的表达量，可在其转录起始核苷酸前使用不同的启动子，如增强型启动子、诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育时期特异性启动子等。00153带有本发明的OSSWEET5基因的表达载体除了可以通过农杆菌TI质粒介导法来转化外，还可以通过RI质粒、植物病毒载体、显微注射等方法来转化不同的植物细胞或组织，并将其育成植株，以获得加速叶片衰老的转基因植物。00164本发明还涉及所述水稻叶片衰老。
13、相关基因OSSWEET5表达载体的水稻转基因植株。00175本发明的基因在调控植物叶片衰老进程方面有重要应用，其中，被转化的宿主可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦和草坪草等；也可以是双子叶植物，如拟南芥、杨树、大豆和棉花等，但不局限于以上所述物种。0018本发明的具体技术方案如下00191以全长CDNA克隆J023023E05为模板，经PCR扩增OSSWEET5的全长CDNA，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示；00202将步骤1中得到的DNA片段连接到载体PCAMBIA1300S上，得到P1300SOSSWEET5，然后将其导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105由CAMBIA惠赠，利用农杆菌。
14、介导的遗传转化方法将所述的载体P1300SOSSWEET5导入水稻品种中花11，获得转基说明书CN104131013A3/11页5因植株；00213利用NORTHERNBLOT的方法检测转基因水稻植株及野生型未转基因植株中OSSWEET5基因的表达量。00224测定转基因植株叶片的叶绿素含量，观察其表型并拍照，分析转基因植株和野生型植株叶片衰老情况的差异。00235测定苗期野生型和转基因植株叶片中各种糖的含量，比较转基因和野生型植株叶片中糖含量的差别。0024本发明的优点在于00251本发明鉴定了一个叶片衰老相关基因OSSWEET5，可为后续的研究者提供参考。00262本发明中鉴定叶片衰老相关。
15、基因的方法，可为后续的研究者提供参考。00273本发明得到了一个编码糖转运蛋白的基因，它的表达量可以控制叶片中糖的分配，为今后碳水化合物的分配研究奠定基础。00284本发明得到的超量表达转基因植株叶片中各种糖的含量发生了明显变化，为分子育种提供了新的资源。00295本发明得到的超量表达转基因植株改变了水稻叶片衰老进程，为基因工程和分子育种提供了新的资源。附图说明0030序列表SEQIDNO1是本发明克隆的基因OSSWEET5的全长CDNA序列。长度为1363BP；其CDS区域从337BP1050BP，长度为714BP。0031序列表SEQIDNO2是本发明克隆的OSSWEET5蛋白序列，编码2。
16、37个氨基酸。0032图1是原始PCAMBIA1300S的载体图。0033图2是改造后的重组载体P1300SOSSWEET5的构建简图。0034图3是水稻野生型非转基因和T2代转基因的OSSWEET5超量表达转基因植株在萌发后15D的图片。图中标记BAR值代表10CM。图3中从左至右依次WT野生型非转基因植株；OX1转基因植株；OX2转基因植株；OX3转基因植株；OX4转基因植株。0035图4是用NORTHERNBLOT的方法分析超量表达水稻转基因植株中OSSWEET5的表达量。图中标记WT表示野生型非转基因植株；OX1OX4表示转基因植株。RNA样品来自于T2代单拷贝家系和野生型植株苗期的第。
17、二片叶。0036图5是OSSWEET5超量表达水稻转基因植株和野生型中叶片叶绿素含量的测定。样品来自于图3中转基因植株的第二片叶。试验设置3个重复。“”表示T测验的P值小于001，差异极显著。0037图6是OSSWEET5超量表达水稻转基因植株和野生型水稻植株中叶片糖含量的测定结果。试验设置3个重复。“”表示T测验的P值小于005，差异显著；“”表示T测验的P值小于001，差异极显著。具体实施方式说明书CN104131013A4/11页60038实施例1候选片段的获得0039OSSWEET5基因来源于LIU等人的构建的SSH文库参见LIU等，IDENTICATIONOFEARLYSENESCE。
18、NCEASSOCIATEDGENESINRICEFLAGLEAVESPLANTMOLBIOL,2008,673755，其LOC号为LOC_OS05G51090。申请人利用其LOC号在TIGRHTTP/RICEPLANTBIOLOGYMSUEDU中搜索，得到OSSWEET5的CDS序列，随后在KOMEHTTP/CDNA01DNAAFFRCGOJP/CDNA/中进行比对，得到OSSWEET5的全长CDNA，克隆号码为J023023E05，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。0040以全长CDNA克隆J023023E05为模板，经PCR扩增OSSWEET5的全长CDNA。扩增该片段的引物的DNA序列。
19、为F5GGTACCGGTGCTCTGCCTCTCCATTA3；R5TCTAGACCCGTCACAGTTACATGCAC3。回收PCR产物后，将其连入PGEMT载体购自PROMEGA公司；将连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测为常规方法，得到OSSWEET5基因的阳性TA克隆。对阳性TA克隆进行测序，结果表明，该阳性TA克隆含有如SEQIDNO1所示的核苷酸序列。0041实施例2OSSWEET5基因超量表达载体的构建0042为了能更好地阐明该基因的功能，申请人将该基因OSSWEET5在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证其功能。0043具体操作如下00441将实。
20、施例1中含有OSSWEET5基因的阳性TA克隆用KPN和XBA双酶切后，与经KPN和XBA双酶切的载体PCAMBIA1300S由澳大利亚CAMBIA惠赠骨架片段连接。PCAMBIA1300S载体改造自PCAMBIA1300HTTP/WWWCNKINET/，叶水烽，水稻CDPKS基因的表达谱分析和黑藻HVPPC2转基因水稻的培育和功能分析。博士学位论文。武汉华中农业大学图书馆，2009，其载体图如图1所示。00452将步骤1中的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞。00463通过抗性筛选和酶切检测证实，以重组载体P1300SOSSWEET5为载体PCAMBIA1300S的KPN和XBA位点间插入。
21、了如SEQIDNO1所示的核苷酸序列，重组超量表达载体P1300SOSSWEET5的TDNA区结构示意图如图2所示。0047实施例3重组超量表达载体P1300SOSSWEET5的转化0048将实施例2构建好的P1300SOSSWEET5重组载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105，构成转化菌株。农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28294300。具体步骤如下00491试剂和溶液缩写0050本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如。
22、下6BA6BENZYLAMINOPURINE，6苄基腺嘌呤；CNCARBENICILLIN，羧苄青霉素；KTKINETIN，激动素；NAANAPTHALENEACETICACID，萘乙酸；IAAINDOLE3ACETICACID，吲哚乙酸；2,4D2,4DICHLOROPHENOXYACETICACID，2,4二氯苯氧乙酸；ASACETOSRINGONE，乙酰丁香酮；CHCASEINENZYMATICHYDROLYSATE，水解酪蛋白；HNHYGROMYCINB，潮霉素；DMSODIMETHYLSULFOXIDE，二甲基亚砜；N6MAXN6大量元素说明书CN104131013A5/11页7成分。
23、溶液；N6MIXN6微量元素成分溶液；MSMAXMS大量元素成分溶液；MSMIXMS微量元素成分溶液。00512主要溶液配方00521N6培养基大量元素母液按照10浓缩液配制00530054将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ML。00552N6培养基微量元素母液按照100浓缩液配制00560057将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ML。00583铁盐FE2EDTA贮存液按照100浓缩液配制0059将373G乙二铵四乙酸二钠NA2EDTA2H2O和278GFESO47H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ML，至70温浴2H，4保存备用。00604维生素贮存液。
24、按照100浓缩液配制00610062加蒸馏水定容至1000ML，4保存备用。00635MS培养基大量元素母液按照10浓缩液配制00640065说明书CN104131013A6/11页80066将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ML。00676MS培养基微量元素母液按照100浓缩液配制00680069将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ML。007072,4D贮存液1MG/ML的配制0071称取2,4D100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN，然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，于室温下保存。007286BA贮存液1MG/ML的配制0073称取6BA10。
25、0MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN，然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，室温保存。00749萘乙酸NAA贮存液1MG/ML的配制0075称取NAA100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN，然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，4保存备用。007610吲哚乙酸IAA贮存液1MG/ML的配制0077称取IAA100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN，然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，4保存备用。007811葡萄糖贮存液05G/ML的配制0079称取葡萄糖125G，然后用蒸馏水溶解定容至250ML，灭菌后4保存备用。008012AS贮存液的配制008。
26、1称取AS0392G，加入DMSO10ML溶解，分装至15ML离心管内，4保存备用。0082131N氢氧化钾贮存液0083称取氢氧化钾56G，用蒸馏水溶解定容至100ML，室温保存备用。00843用于水稻遗传转化的培养基配方00851诱导培养基0086说明书CN104131013A7/11页90087加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到59，煮沸并定容至1000ML，分装到50ML三角瓶25ML/瓶，封口后按常规方法灭菌例如121下灭菌25MIN，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同。00882继代培养基00890090加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到59，煮沸。
27、并定容至1000ML，分装到50ML三角瓶25ML/瓶，封口，按上述方法灭菌。00913预培养基00920093说明书CN104131013A8/11页100094加蒸馏水至250ML，1N氢氧化钾调节PH值到56，封口，按上述方法灭菌。0095使用前加热溶解培养基并加入5ML葡萄糖贮存液和250LAS贮存液，分装倒入培养皿中25ML/皿。00964共培养基00970098加蒸馏水至250ML，1N氢氧化钾调节PH值到56，封口，按上述方法灭菌。0099使用前加热溶解培养基并加入5ML葡萄糖贮存液和250LAS贮存液，分装倒入培养皿中25ML/每皿。01005悬浮培养基01010102加蒸馏水。
28、至100ML，调PH值到54，分装到两个100ML的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。说明书CN104131013A109/11页110103使用前加入1ML无菌葡萄糖贮存液和100LAS贮存液。01046选择培养基01050106加蒸馏水至250ML，调节PH值到60，封口，按上述方法灭菌。0107使用前溶解培养基，加入250LHN50MG/ML和400LCN250MG/ML分装倒入培养皿中25ML/皿。注第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400MG/L，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250MG/L。01087分化培养基01090110加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到60。。
29、煮沸并用蒸馏水定容至1000ML，分装到50ML三角瓶50ML/瓶，封口，按上述方法灭菌。01118生根培养基0112说明书CN104131013A1110/11页120113加蒸馏水至900ML，用1N氢氧化钾调节PH值到58。煮沸并用蒸馏水定容至1000ML，分装到生根管中25ML/管左右，封口，按上述方法灭菌。01144农杆菌介导的遗传转化步骤01151愈伤诱导0116将成熟的中花11水稻种子来自中国农科院科学院作物科学研究所去壳，然后依次用70浓度的的乙醇溶液处理1MIN，015氯化汞HGCL2溶液处理15MIN，灭菌水清洗45次后将种子转移到诱导培养基上。将接种后的培养基于暗培养4周。
30、，培养温度26左右。01172愈伤继代0118挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上暗培养2周，培养温度26左右。01193预培养0120挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上暗培养2周，培养温度26左右。01214农杆菌培养0122首先在带有对应抗性选择的LA培养基LA培养基的配制参照J萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等译，科学出版社，2002，北京上预培养农杆菌EHA105该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株2D，培养温度28；随后，将农杆菌转移至悬浮培养基中，28摇床上培养23H。01235农杆菌侵染0124首先调节农杆菌悬浮液至OD600值。
31、为0810，随后将预培养的愈伤转移至农杆菌悬浮液中浸泡30MIN，将愈伤转移至灭菌好的滤纸上吸干，然后放置在共培养基上培养3D，培养温度1920。01256愈伤洗涤和选择培养0126灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400MG/LCN的灭菌水中30MIN；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择培养23次，每次2周。01277分化0128将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养57D；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照15002000LX培养3040D，培养温度26。01298生根0130剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中在光照15002000LX培养说。
32、明书CN104131013A1211/11页1323周，培养温度26。01319移栽0132洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室。0133实施例4NORTHERNBLOT分析转基因植株中OSSWEET5的表达量0134本实施例中NORTHERNBLOT分析参照文献报道的方法进行LIU等，IDENTICATIONOFEARLYSENESCENCEASSOCIATEDGENESINRICEFLAGLEAVESPLANTMOLBIOL,2008,673755。取水稻野生型非转基因和T2代转基因的OSSWEET5超量表达转基因植株编号为OX1OX4的叶片，利用TRIZOL试剂购自INVI。
33、TROGEN公司抽提总RNA提取方法参考TRIZOL试剂的操作手册。取15G总RNA在1琼脂糖变性凝胶中电泳分离，然后将RNA片段转移到HYBONDN尼龙膜上转膜过夜，紫外交联固定二次每次30S，预杂交过夜，再与32P标记的OSSWEET5基因探针杂交，杂交后先用2SSC/01SDS洗膜液在室温下漂洗片刻后，再在65下用2SSC/01SDS洗膜液洗5MIN，尼龙膜用滤纸晾干后在磷屏购自FUJILM公司中放射自显影310H，然后用FLA5000SYSTEM日本富士公司产品扫描。检测结果如图4所示，转化植株中OSSWEET5的表达量都有不同程度的上升。0135探针以全长CDNA克隆J023023E。
34、05为模板，经PCR扩增为常规方法后回收PCR产物得到。PCR扩增引物的DNA序列为正向引物F为5CGTGACGATCGTGAAGAAGA3；反向引物R为5GGATGTCAAAGCGGATGAAC3。0136实施例5叶绿素含量的测定0137叶绿素含量的测定采用丙酮分光光度计法。取约004G水稻野生型非转基因和T2代转基因的OSSWEET5超量表达转基因植株编号为OX1OX4在萌发后15天的第二片叶的样品于叶绿素抽提液抽提液为丙酮乙醇水体积比45451中，4抽提过夜，待叶片全部变白后用分光光度计在663NM和645NM处测定样品的吸光值，叶绿素含量按文献报道的方法进行计算MAO等，TWOCOMP。
35、LEMENTARYRECESSIVEGENESINDUPLICATEDSEGMENTSCONTROLETIOLATIONINRICETHEORAPPLGENET,2011,122373383，用MG/G叶鲜重来表示。结果显示OSSWEET5超量表达转基因植株叶绿素含量明显低于野生型图5。0138实施例6糖含量的测定0139用气相色谱质谱联用仪GCMS按文献报道的方法来测定各种糖的含量ROJASESCUDERO等，OPTIMIZATIONOFCARBOHYDRATESILYLATIONFORGASCHROMATOGRAPHYJCHROMATOGRA,2004,1027117120；KENYON等。
36、，MAINTENANCECARBONCYCLEINCRASSULACEANACIDMETABOLISMPLANTLEAVESSOURCEANDCOMPARTMENTATIONOFCARBONFORNOCTURNALMALATESYNTHESISPLANTPHYSIOL,1985,77183189。样品为水稻野生型非转基因和T2代转基因的OSSWEET5超量表达转基因植株编号为OX2在萌发后15D的第二片叶。结果显示与野生型相比，OX2叶片中半乳糖、葡萄糖和果糖的含量明显上升，而蔗糖的含量则明显下降图6。这些结果表明本发明的转基因植株叶片中糖含量发生了明显的变化。说明书CN104131013A131/5页1400010002序列表CN104131013A142/5页150003序列表CN104131013A153/5页160004序列表CN104131013A164/5页170005序列表CN104131013A175/5页18序列表CN104131013A181/3页19图1图2说明书附图CN104131013A192/3页20图3图4说明书附图CN104131013A203/3页21图5图6说明书附图CN104131013A21。