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1、10申请公布号CN104137857A43申请公布日20141112CN104137857A21申请号201410354206422申请日20140724A01N65/08200901A01P5/0020060171申请人中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所地址210042江苏省南京市玄武区蒋王庙街4号72发明人姜洪芳张卫明壮子恒54发明名称一种用于松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法57摘要有松材线虫杀灭作用的凤仙花（IMPATIENSBALSAMINAL）制备方法，新鲜凤仙花及经烘晒所得干凤仙花，均包含整株植物及茎、叶、花、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，直接榨汁应用，以及。
2、经过有机溶剂如石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣，直接应用或制成各种制剂。本发明方法简单、易于操作，降低了对松材线虫的防治成本，能够从多方面及时有效地杀灭松材线虫，如降低生存率、由于神经系统受到破坏导致运动行为降低、降低繁殖能力等。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图2页10申请公布号CN104137857ACN104137857A1/1页21有松材。
3、线虫杀害作用的凤仙花制备方法其特征在于鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和，切碎成小块，榨汁直接应用；鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和，用热水及冷水提取物及残渣；鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和，经单一有机溶剂、两种或两种以上混合溶剂或体积百分比浓度为2080的该有机溶剂与水的混合物等溶剂提取物及残渣；干凤仙花粉新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和经烘晒得到干花，干花经粉碎成细粉；凤仙花粉包含花、茎、。
4、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，经石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣。2根据权利1所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于所说的凤仙花是新鲜花及经烘晒所得干花，均包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和。3根据权利1所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于所说的溶剂是石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、。
5、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣。4根据权利1至3所述的凤仙花杀害松材线虫物质的制备方法，其特征在于新鲜凤仙花及经烘晒所得干花各部位直接应用，或经过有机溶剂提取物及残渣直接应用或制成乳油、微乳剂、可湿性粉剂等各种制剂，用于松材线虫的杀灭。权利要求书CN104137857A1/4页3一种用于松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法技术领域0001本发明涉及植物源农药技术领域，特别涉及对松材线虫有杀害作用的凤仙花的制备方法。背景技术0002凤仙花（IMPATIENSBALSAMINAL）凤仙花科BALSAMINACEAE凤仙花属IMPATIENS。
6、一年生草本植物（别名透骨草、指甲花、小桃红、凤仙草、旱珍珠等）。凤仙花属共有植物900余种，全球均有分布。凤仙花（IMPATIENSBALSAMINAL）作为观赏植物国内外均有种植，也是该属植物的常见品种，其全草及花、茎、叶、果皮、种子、根在民间有悠久的药用历史，被广泛用于治疗腰胁痛、蛇咬伤、鹅掌风、手足癣病、灰指甲、甲沟炎、风湿性关节炎、痈疖疮疔、胎衣不下、溃疡日久不愈和经闭腹痛等，2010年版中国药典收载其种子急性子作为药用部位。凤仙花的化学成分主要有黄酮、萘醌、香豆素、有机酸、花青素和甾醇类。现代药理研究表明凤仙花具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗过敏、止痒、镇痛和抑制WNT信号通道等活性13。。
7、但未见有关制备农药的资料报道和产品，利用凤仙花适应性强，耐旱耐瘠薄，生长迅速，养护管理粗放的优势，大力开发相关农药产品，不仅可提高产品的附加值，而且还可以控制松材线虫的危害而减免经济损失。0003松树是丘陵山区和风景名胜区的主要造林绿化树种，1982年，江苏省因松材线虫（BURSAPHELENCHUSXYLOPHILUS）病死亡松树仅265株，而到2002年秋普查时，全省因松材线虫病危害而死亡松树达47万株；由此可见松材线虫病传播很快，危害非常重。它既具有一般病虫害的普遍性，更具有自身的特殊性。松材线虫病发生早期，只危害黑松，现在已对马尾松普遍产生危害，目前病死树中马尾松约占42，海岸松、黄松。
8、、白皮松、湿地松也受害死亡。病害发生初期，主要分布于人为活动频繁区域，现已向林区深处扩展。一是蔓延速度惊人，以江苏省为例，短短19年，疫区已由南京东郊极小的危害区域迅速扩展蔓延到20个县区；二是早期以疫区为中心逐步向四周扩散为主，后期在以疫区为中心向四周扩散的同时，出现大跨度、长距离、跳越式的扩散，外围疫点相继增多。虽然采取了化学防治，实施飞防、注干和释放天敌等综合治理措施，松材线虫病发生面积仍占全省松林面积的147，特别是重点保护区、风景区。多年实践说明，松材线虫病防治关键在“预防”，疫情发生时能有效杀死，寻找高效杀死松材线虫的药物已迫在眉睫。0004秀丽隐杆线虫（CAENORHABDITI。
9、SELEGANS）属于线形动物门、线虫纲动物，是近年来用于环境评价及毒理学研究的经典模式生物，生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，对人、动物和植物没有危害，非寄生，安全性高，且标本便宜，在实验室中容易掌控。它能感知气味和味道，对光线、温度有反应。生命周期短（个体从一个受精卵发育成可以产卵的成虫只需3天左右），可进行多评价终点评价（如存活率、生殖、寿命、运动行为、代谢等），具有极其丰富的遗传与发育研究背景，对于环境胁迫的应激反应十分敏感，环境胁迫会改变它们的生殖速度、生命周期以及其他发育特性。无论是利用胚胎发育来检测毒物的毒性试验，还是在分子生物学水平对毒物进行分析，秀丽线虫都是比。
10、较可靠而有效的说明书CN104137857A2/4页4模式生物。秀丽线虫是国内外研究的模式生物中最为简单、遗传与发育背景了解最清楚的物种之一。松材线虫与秀丽隐杆线虫具有相似的发育周期及生活习性,氨基酸序列的一致性为85，根据多序列比对结果，及用MEGA40软件NEIGHORJOINING法构建的系统进化树进行分析，同其它的植物寄生虫相比，松材线虫与秀丽隐杆线虫的亲缘关系比较近，本发明从秀丽隐杆线虫生存率的下降、运动行为的下降、繁殖能力的降低等多个方面，说明凤仙花可以用于松材线虫的预防及杀灭。0005参考文献1鞠培俊,孔德云,李晓波凤仙花化学成分及药理作用研究进展J沈阳药科大学学报,2007,2。
11、453203242苏秀芳,蓝金凤仙花的化学成分及药理活性研究进展J南宁师范高等专科学校学报,2010,27313153胡喜兰,朱慧,刘存瑞，屠鹏飞等凤仙花的化学成分研究J中成药,2003,2510833834发明内容0006本发明的目的是提供有松材线虫杀害作用的凤仙花的制备方法。本方法操作简单，大大降低了松材线虫的防治成本。0007有松材线虫杀害作用的凤仙花制备方法，其特征在于1）新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和，切碎成小块，榨汁直接应用。00082）新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和。
12、，用热水及冷水提取的提取物及残渣。00093）新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个、三个、四个、五个、六个部位的总和，经单一有机溶剂、两种或两种以上混合溶剂或体积百分比浓度为2080的该有机溶剂与水的混合物等溶剂提取物及残渣。00104）凤仙花粉新鲜凤仙花包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和经烘晒得到干花，干花经粉碎成细粉。00115）凤仙花粉包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，经石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇。
13、、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣。0012本发明中，所说的凤仙花是新鲜花及经烘晒所得干花，均包含花、茎、叶片、果皮、种子、根中一个及两个或两个以上部位的总和，榨汁直接应用。所说的溶剂是石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、苯、甲苯、乙醚、氯仿、四氯化碳、二氯甲烷、醋酸乙酯、丙酮、丁酮、异丙醇、正丙醇、正丁醇、不同浓度的乙醇、甲醇、水等单一溶剂及两种或两种以上混合溶剂提取的提取物及残渣，直接应用或制成乳油、微乳剂、可湿性粉剂等各种制剂，用于以松线虫杀害为目的药物。0013本发明以新鲜凤仙花或凤仙花干花为原料，经适当处理或提取，对秀丽隐杆线虫急性暴露后的身体弯曲、头部摆动、生存率。
14、、生殖率等均有显著影响，且与浓度存在依存关说明书CN104137857A3/4页5系，表明凤仙花有一定的线虫杀害作用。0014附图说明附图1凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生存率的影响附图2凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响附图3凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响附图4凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生殖率的影响具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。本发明所用缩略语具有本领域技术人员通常所理解和熟知的含义。0015实施例1一、样品制备新鲜的凤仙花的茎经冷冻干燥，称取冻干样品50G，粉碎，过40目筛，加入55乙醇300ML室温进行渗漏提。
15、取，渗漏液经新华滤纸过滤，滤液用旋转蒸发仪于45减压蒸去乙醇，粗提物冷冻干燥，得率为1862，20储存备用。0016二、秀丽隐杆线虫实验野生型秀丽隐杆线虫CELEGANSBRISTOLN2，处于同一发育时期的L1期（同步化24H）线虫随机加入12孔板（每孔含50条虫子），以KMEDIUM为培养液，加入大肠杆菌ECOLIOP50为食物，经不同浓度的凤仙花茎提取物及空白对照暴露48小时（20培养）。凤仙花茎提取物用DMSO溶解成母液，稀释成实验浓度，DMSO终浓度均为05。空白对照组05DMSO，均置于4冰箱避光保存。采用体视显微镜观察，丢失的线虫、因爬到培养皿壁而死亡的线虫以及虫袋应从统计数据中。
16、排除；实验均重复3次，采用SPSS160软件进行如下测定指标的单因素方差分析。00171凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生存率的影响凤仙花茎提取物为01MG/ML时，生存率为9967，与空白对照组比较没有差异；凤仙花茎提取物为10MG/ML时，生存率为990，与空白对照组比较有差异（P005）；凤仙花茎提取物为50MG/ML、100MG/ML时，生存率分别为928、875，与空白对照组比较均有显著差异（P001），见附图1。00182凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响身体弯曲频率，将已发育为成虫的线虫挑到一个不含有OP50的NGM培养基上，记录下20S内身体弯曲的次数，假定沿着咽泵的方。
17、向为Y轴，那么线虫爬行过程中身体沿着相应X轴方向上的1次改变定义为1个身体弯曲；凤仙花茎提取物为01MG/ML时，身体弯曲下降了332，与空白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为10MG/ML时，身体弯曲下降了440，与空白对照组比较有差异（P005）；凤仙花茎提取物为50MG/ML、100MG/ML时，身体弯曲分别下降了1847、3333，与空白对照组比较均有显著差异（P001），见附图2。00193凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫头部摆动的影响头部摆动频率，将已发育为成虫的线虫挑入NGM（不含有OP50）培养基中，经过1MIN的恢复，向其身体滴一滴蒸馏水，记录线虫在1MIN内头部摆动的次数，当身体。
18、弯曲达到体长说明书CN104137857A4/4页6的一半作为1次头部摆动；凤仙花茎提取物为01MG/ML时，头部摆动下降了181，与空白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为10MG/ML时，头部摆动下降了268，与空白对照组比较有差异（P005）；凤仙花茎提取物为50MG/ML、100MG/ML时，头部摆动分别下降了1638、3055，与空白对照组比较均有显著差异（P001），见附图3。00204凤仙花茎提取物对秀丽隐杆线虫生殖率的影响生殖率即后代数目，指一条线虫在整个产卵期的所有卵数；凤仙花茎提取物为01MG/ML时，子代数目下降了106，与空白对照组没有差异；凤仙花茎提取物为10MG/ML时，子代数目下降了216，与空白对照组比较有差异（P005）；凤仙花茎提取物为50MG/ML、100MG/ML时，子代数目分别下降了871、1560，与空白对照组比较均有显著差异（P001），见附图4。说明书CN104137857A1/2页7图1图2说明书附图CN104137857A2/2页8图3图4说明书附图CN104137857A。