技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及土槿乙酸及其衍生物HPB在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
背景技术
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因未明的慢性疾病，病灶多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。临床上以腹泻、腹痛、粘液脓血便、里急后重为主要症状，并可发生严重的局部(肠道本身)与远处(全身性)并发症。主要病理特点为弥漫的组织反应，包括溃疡形成、隐窝脓肿、小血管炎症、杯状细胞减少以及各种类型炎细胞浸润等非持异性表现。UC在欧美国家多见于20～40岁的青壮年，发病率为50～100/10万，近年来，随着生活水平的提高，饮食结构、生活方式的改变，在我国发病率也呈逐年上升的趋势，年发病率为2～20/10万，患病率为50～100/10万。由于该病自然病程长、易反复发作，严重影响患者生活质量，且长期患者中有5～10％发生癌变，临床上至今尚无有效治疗措施，已成为消化系统疾病中的难点，日益受到关注，并被世界卫生组织列为现代难治病之一。
UC主要采用药物治疗，目的是控制急性发作，维持缓解病情，减少复发，但迄今仍缺乏能够特异性治愈UC的有效药物。目前常规治疗药物有氨基水杨酸类和糖皮质激素类。这些药物均存在疗效欠佳(尤其是对中重度UC)、起效慢、疗程长、停药后易复发和长期使用有不良反应发生等缺点。近年来,生物疗法如抗TNF-α抗体、干扰素等也被用来治疗UC，但同样存在长期应用副作用大，或效果不肯定，或价格昂贵而限制其临床应用。因此，研制疗效显著、安全性高、副作用小、用于预防和治疗UC的新型药物己成为全世界研究的热点。
鉴于西药治疗UC的诸多缺点，而中草药在疾病尤其是慢性难治性顽疾的治疗上有着独特的疗效，而且经过数千年临床检验。因此，从传统中草药中筛选具有活性的新化合物或已知结构的天然化合物的新用途已成为新药开发的主要途径之一。
UC属于中医“痢疾”、“泄泻”、“腹痛”等病症范畴，脾气虚弱、脾肾阳虚为病之根，寒湿停滞、湿热蕴结、瘀血阻滞为病之标，导致滑泄不止。故在中药的辩证方药上使用健脾益气、温补脾肾、清肠祛湿、活血化癖、行气导滞的中药可取得较好疗效。然而，常用治疗UC的中药都是数种药物组成的复方，不易进行药物质量控制。因此，以单味中草药或其有效组分为基础，将其开发成为安全、有效、可控的现代中药/天然药物具有重要价值。
松科植物金钱松(Pseudolarix kaempferi Gord)是中国特有植物，其根皮或近根树皮土槿皮(又叫土荆皮、荆树皮、金钱松皮)为《中华人民共和国药典》收载的常用中药，最早见于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》第六卷木部记载：“汪连任采药书，罗汉松一名金钱松，又名金松，其皮治一切血，杀虫瘴癣，合芦荟香油调擦”。土槿皮入肺、脾经，具有杀虫、止痒的功效。其有效成分包括土槿甲酸、土槿乙酸(pseudolaric acid B，PB)、土槿丙酸等，其中土槿乙酸是主要成分，分子式为C23H28O8(化学学报，1982，40，447)。药理研究表明，土槿乙酸具有抗肿瘤、抗生育、抗血管生成、抗真菌等多种药理学作用。
但迄今关于土槿乙酸及其衍生物HPB在制备预防和治疗UC药物中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供土槿乙酸在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供土槿乙酸衍生物7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸(简称HPB)在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供含土槿乙酸的药物制剂在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供含7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸的药物制剂在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
土槿乙酸在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用。
含土槿乙酸的药物制剂在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用，所述含土槿乙酸的药物制剂是土槿乙酸与药学可接受的辅料制备的片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、胶囊剂、口服液或注射剂。
含7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸的药物制剂在制备防治溃疡性结肠炎药物中的应用，所述含7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸的药物制剂是7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸与药学可接受的辅料制备的片剂、丸剂、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、胶囊剂、口服液或注射剂。
所述溃疡性结肠炎为急性溃疡性结肠炎或慢性溃疡性结肠炎。
本发明的优点：
本发明采用类似人类急性、慢性UC的小鼠模型进行了动物实验，证实了本发明土槿乙酸及其衍生物HPB均可使UC小鼠体重恢复、疾病活动指数明显降低，结肠粘膜组织病理损伤显著改善，TNF-α、IL-1β等促炎因子含量降低，说明土槿乙酸及其衍生物HPB具有预防和治疗UC的作用，可以用于研制预防和治疗UC的药物。
附图说明
图1为以土槿乙酸(PB)为原料合成土槿乙酸衍生物(HPB)的合成路线。
图2为土槿乙酸及HPB预防性给药对急性UC小鼠体重增长的影响。
图3为土槿乙酸及HPB治疗性给药对急性UC小鼠体重增长的影响。
图4为土槿乙酸及HPB预防性给药对急性UC小鼠结肠长度和重量的影响。
图5为土槿乙酸及HPB治疗性给药对急性UC小鼠结肠长度和重量的影响。
图6为土槿乙酸及HPB预防性给药对急性UC小鼠结肠病理形态的影响。
图7为土槿乙酸及HPB治疗性给药对急性UC小鼠结肠病理形态的影响。
图8为土槿乙酸及HPB对急性UC小鼠血清TNF-α的影响。
图9为土槿乙酸及HPB对急性UC小鼠血清IL-1β的影响。
图10为土槿乙酸及HPB预防性给药对慢性UC小鼠体质量变化的影响。
图11为土槿乙酸及HPB治疗性给药对慢性UC小鼠体质量变化的影响。
图12为土槿乙酸及HPB对慢性UC小鼠血清TNF-α的影响。
图13为土槿乙酸及HPB对慢性UC小鼠血清IL-1β的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
为了更好地理解本发明的实质,以下将用药理试验及其结果来说明其新的医药用途。
氢化还原方法将PB 3个双键全部还原(图1)，得到7，8，13，14，15，16-六氢化土槿乙酸(Hexahydropseudolaric acid B,HPB)，合成条件：10％Pd/C,H2,P.3.2×105-3.7×105Pa,T.25℃。经HPLC鉴定纯度＞98％。
本发明的土槿乙酸及其衍生物HPB的制备可以参照ZL200910069812.0(土槿乙酸及其衍生物在制备免疫抑制剂中的应用)的方法制备。
除非另行定义，文中所用专业术语与本领域研究人员所熟悉的意义相同。
实施例1：土槿乙酸及其衍生物HPB对小鼠急性UC的预防和治疗作用
1.1实验材料：
1.1.1实验动物：清洁级8-9周龄C57BL/6小鼠，购自北京维通利华动物实验技术有限公司(动物合格证号：SCXK-2012-001)。动物购回22℃士1℃饲养，自由进食饮水。
1.1.2试剂：葡聚糖硫酸钠(DSS)相对分子量36000～50000(美国Sigma-Aldrich公司)，土槿乙酸及HPB(本室合成)，阳性对照药：强的松(PDN，天津天药药业股份有限公司)，其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3主要仪器：冰冻切片机CM7500(Leica，德国)；Model 680自动酶标仪(Bio-Rad，美国)；光学显微镜D5200(Nikan，日本)。
1.2实验方法：
1.2.1建立动物模型：C57BL/6小鼠100只，雌雄各半，适应性喂养1周。
1.2.2分组及给药方法：
预防急性UC实验(预防性给药是指，于造模前一天开始灌胃给药，至实验结束)，随机分为5组，每组10只，即正常对照组，UC模型组，土槿乙酸预防组，HPB预防组，PDN阳性对照组，上述药物土槿乙酸、HPB及PDN剂量均为5mg/kg。正常组自由饮水，常规喂养，模型组给予3％DSS水溶液，连续7天，并且按0.1mL/10g体重灌服生理盐水。各给药组于DSS造模前1天按0.1mL/10g体重灌服相应药液。
治疗急性UC实验(治疗性给药是指，造模三天后给药，至实验结束)，随机分为5组，每组10只，即正常对照组，UC模型组，土槿乙酸治疗组，HPB治疗组，PDN阳性对照组，上述三组药物土槿乙酸、HPB及PDN剂量均为5mg/kg。正常组自由饮水，常规饲料喂养，模型给予3％DSS水溶液，连续7天，并且按0.1mL/10g体重灌服生理盐水。各给药组于DSS造模3天后按0.1mL/10g体重灌服相应药液。
1.2.3观察指标：
(1)饮食及体重：实验期间观察每日观察小鼠体重，计算摄食量、食物利用率、每笼饮水量，计算每日体重与前一日体重的差值(day2-1、day3-2、day4-3、day5-4、day6-5)。
(2)疾病活动指数：观察小鼠外观，测定粪便隐血，计算疾病活动指数(DAI)，评价其活动度，见表1。
表1 DAI评分标准
(3)结肠湿重、长度：实验结束前1天，禁食不禁水，小鼠眼球取血、颈椎脱臼处死，迅速剖开腹腔，取出肛门至盲肠未端的整个结肠。沿肠系膜剪开肠腔，用预冷的生理盐水冲洗肠内容物，滤纸拭干，测量结肠长度、称量重量。
1.2.4病理形态观察：取距肛门1cm处结肠，置中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片(厚度3um)，常规H&E染色，观察组织形态变化。
1.2.5血清炎症因子检测：收集各组小鼠外周血，静置2-3h，2500rpm离心15min，取上清，双抗体夹心ELISA法测定血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平。按照试剂盒说明操作，450nm波长处测定各OD值，根据标准曲线计算各样本浓度值。
1.2.6数据统计与分析：统计软件为SPSS16.0，正态分布的计量资料数据以表示，各组总体比较采用单因素方差分析(ANOVA)，采用t检验进行组间比较，P＜0.05被认为差异有统计学意义。
1.3实验结果：
1.3.1一般情况：正常组小鼠饮食正常，大便成形，毛色光滑，反应灵活，喜活动，体重呈明显增加的趋势；模型组造模后第2天开始出现少量不成形稀便，第5天可见脓血便，明显消瘦，毛色暗淡，精神萎靡，食欲減退，反应欠灵敏等症状，并一直持续到实验结束。土槿乙酸及HPB预防/治疗组均明显改善小鼠状态，体重逐渐增加，毛色渐变光滑，至实验结束时大便基本恢复正常，肛周逐渐变干净(见图2,图3)。
1.3.2疾病活动指数：急性UC的主要临床症状之一是便血，由结肠黏膜受损以及黏膜溃疡所致。本实验中，急性UC造模后对各组小鼠疾病活动指数进行评价与统计学分析，土槿乙酸及HPB预防组和治疗组均能明显对急性UC疾病活动指数(表2)。
表2土槿乙酸及HPB对急性UC疾病活动指数的影响
1.3.3结肠变化：小鼠剖腹后可见，模型组较正常组结肠明显缩短，肠壁变厚，肠腔狭窄，称重显示，结肠湿重明显增加。土槿乙酸及HPB药物治疗组能明显降低结肠湿重、增加结肠长度，表明药物能有效减轻急性UC结肠症状，具有成为防治UC的新型药物的潜能(图4，图4a为土槿乙酸及HPB预防性给药对急性UC小鼠结肠长度影响，图4b为土槿乙酸及HPB预防性给药对急性UC小鼠结肠重量影响)。土槿乙酸及HPB药物预防组亦能得到类似结果(图5，图5a为土槿乙酸及HPB治疗性给药对急性UC小鼠结肠长度影响，图5b为土槿乙酸及HPB预治疗性给药对急性UC小鼠结肠重量影响)
1.3.4病理形态变化：光镜下可见，模型组黏膜层坏死脱落，出现中重度的炎性细胞浸润和充血水肿以及弥漫性溃疡。土槿乙酸及HPB预防及治疗组均能明显保护急性UC的结肠黏膜损伤(图6,图7)。(图6中a.正常对照组，b.UC模型组，c.土槿乙酸预防组，d.HPB预防组)
(图7中a.正常对照组，b.UC模型组，c.土槿乙酸治疗药组，d.HPB治疗组)
1.3.5细胞因子的变化：本发明药物对急性UC血清TNF-α、IL-1β等促炎因子有明显的抑制作用(图8,9)。
(图8中.a.预防性给药组，b.治疗性给药组)
(图9中a.预防性给药组，b.治疗性给药组)
实施例2：土槿乙酸及其衍生物HPB对小鼠慢性UC的预防和治疗作用
2.1实验材料：同实施例1。
2.2实验方法：
2.2.1建立动物模型：同实施例1。
2.2.2分组及给药方法：
预防慢性UC实验，随机分为5组，每组10只，即正常对照组，UC模型组，土槿乙酸预防组，HPB预防组，PDN阳性对照组，上述药物土槿乙酸、HPB及PDN剂量均为5mg/kg。正常组自由饮水，常规饲料喂养，模型组给予3％DSS蒸馏水溶液，连续7天，然后给予普通饮水7天(此为一个循环)，共3个循环诱导建立慢性UC模型，并按0.1mL/10g体重灌服生理盐水。各给药组于DSS造模前1天开始灌胃给药，按0.1mL/10g体重灌服相应药液。
治疗慢性UC实验，随机分为5组，每组10只，即正常对照组，UC模型组，土槿乙酸治疗组，HPB治疗组，PDN阳性对照组，上述药物土槿乙酸、HPB及PDN剂量均为5mg/kg。正常组自由饮水，常规饲料喂养，模型组给予3％DSS蒸馏水溶液，连续7天，然后给予普通饮水7天(此为一个循环)，重复3个循环诱导慢性UC模型。各给药组于DSS造模2周后开始灌胃给药，按0.1mL/10g体重灌服相应药液。
2.2.3观察指标：同实施例1。其中，预防性给药组体重差为每周体重与前一周体重的差值(week2-1、week3-2、week4-3、week5-4、week6-5)；治疗性给药组体重差为每周体重与前一周体重的差值(week4-3、week5-4、week6-5)。
2.2.4数据统计与分析：同实施例1。
2.3实验结果：
2.3.1一般情况：除正常组外，其余各组均有不同程度的摄食減少。第1周各组小鼠体重差异无显著性，正常组小鼠各周体重逐渐增加，模型组小鼠体重略有下降，从第2周至第6周模型组小鼠体重增长率为负增长，与正常组小鼠相比有显著性差异；各用药组小鼠体重增长率均与模型组相比有显著性差异，表明土槿乙酸及HPB能抑制DSS致慢性UC小鼠的体重下降(图10,图11)。
2.3.2疾病活动指数：造模1周后模型组多数小鼠出现大便隐血、腹泻，体重均明显下降，明显血便，3个循环之后模型组仍腹泻，个别血便，体重较前三个循环有所回升，炎症呈现慢性化进程。土槿乙酸及HPB治疗组或预防组均能减轻UC病情(表3)。
表3土槿乙酸及HPB对慢性UC疾病活动指数的影响
2.3.3病理形态变化：光镜下可见，模型组黏膜层坏死脱落，出现中重度的炎性细胞浸润和充血水肿以及弥漫性溃疡。土槿乙酸及HPB预防及治疗组均能明显保护急性UC的结肠黏膜损伤(表4)。
表4土槿乙酸及HPB对慢性UC结肠组织病理评分的影响
2.3.4细胞因子的变化：本发明药物对慢性UC血清TNF-α、IL-1β等促炎因子同样有明显的抑制作用(图12,图13)。
图12中a.预防性给药组，b.治疗性给药组
图13中a.预防性给药组，b.治疗性给药组
药效学实验结果说明，使用土槿乙酸或土槿乙酸衍生物HPB在制备预防和治疗UC的制药用途的应用上有着相当的优势，并且以往未见相关的报道。
土槿乙酸或土槿乙酸衍生物HPB，可以单独或以药物组合的形式使用。药物组合包括土槿乙酸或土槿乙酸衍生物HPB和药学可接受的辅料。
土槿乙酸或土槿乙酸衍生物HPB可根据制药领域的常规方法制成任何一种药剂学上所述的剂型，可以通过口服、舌下、吸入、经皮或经肌肉、静脉、肠外给药等方式施用于患者。
口服给药时可以制备成片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
肠外给药时可以制备成冻干粉针及注射液等。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可按受的捕料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、防腐剂、基质等。
填充剂包括：淀粉、乳糖、甘露醇、甲売素、微晶纤维素、蔗糖等；
崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；
润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；
助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗粧、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；
粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；
甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；
防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；
基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
本文使用的“预防”指的是预先给药以防止或抑制发病，本文使用的“治疗”是已出现临床症状后给药以减轻或抑制病情。因此，药物的预防性或治疗性给药都能够减轻或抑制疾病的可能性和严重性。