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1、10申请公布号CN104138371A43申请公布日20141112CN104138371A21申请号201410359357922申请日20140725A61K31/353200601A61P31/1420060171申请人武汉胜达康生物科技有限公司地址430075湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号72发明人吴建国徐德邬开朗刘倩瑛刘映乐潭秋萍刘芳74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人余晓雪王敏锋54发明名称EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用57摘要本发明涉及医药新用途技术领域，具体公开了一种EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中。
2、的应用。本发明证实了EGCG棕榈酸酯在体外对丙型肝炎病毒感染细胞试验中具有良好的抗病毒作用，能够预防和治疗丙型肝炎病毒的感染，其作用效果与阳性对照药IFN1相当，揭示该药物有开发成抗丙型肝炎病毒药物的前景。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图2页10申请公布号CN104138371ACN104138371A1/1页21EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的EGCG棕榈酸酯为结构式如下的单取代EGCG棕榈酸酯权利要求书CN104138371A。
3、1/7页3EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用技术领域0001本发明涉及医药新用途技术领域，更具体涉及一种EGCG表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用。背景技术0002丙型肝炎病毒是在1974年首次被发现的，而后在1989年被命名。丙型肝炎主要是由丙型肝炎病毒经血液传播而形成的病毒性传染病，根据世界卫生组织的统计，在全世界范围内已经有130170万患者。每100个感染者中有7585的病人会发展成慢性感染，6070会演变成慢性疾病，520的患者会引发肝硬化甚至肝细胞癌变HCC、死亡。由此可见，丙型肝炎对患者的健康和生命危害极大，已成。
4、为严重的社会和公共卫生问题。0003丙型肝炎病毒HEPATITISCVIRUS，简称HCV是一种属于黄病毒科家族的带有包膜的RNA病毒，包含一条长为9600个碱基的正义单链RNA基因组。其中5和3非编码区NCR分别有319341BP，和2755BP，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5非编码区下游紧接一开放的阅读框ORF，其中基因组排列顺序为5CE1E2P7NS2NS3NS4NS53，能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白和两种糖蛋白，P7编码一种膜内在蛋白，。
5、其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2、NS3、NS4A、NS5A和NS5B，非结构蛋白与病毒的生活周期相关。其中NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，参与HCV基因组复制。0004HCV主要有两大传播途径，包括血液传播和垂直传播。血液传播是丙肝病毒最主要的传播方式，主要是通过献血员和血液制品进行传播。垂直传播指的是丙肝病毒的母婴垂直传播，携带丙肝病毒的女性在分娩过程中容易将丙肝病毒传染给婴儿。目前针对HCV尚无有效的预防疫苗，治疗手段主要是靠长效干扰素联合病毒唑，所以对于HCV的治疗药物的开发是很有必要的。0005茶多酚是茶叶中的一类活性成分，茶多酚又以儿茶素类为主，表没。
6、食子儿茶素没食子酸酯EGCG是儿茶素中含量最高的组分，占茶多酚总量的2759。EGCG具有非常强的抗氧化活性，在抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤等方面都有出色的表现。然而，EGCG的脂溶性和水溶性都较差，无法稳定地存在于人体内,很难用于抗病毒实验和制备抗病毒药物。0006表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸后简称EGCG棕榈酸酯是通过EGCG与棕榈酰氯的酯化来制备的脂溶性化合物，其抗氧化活性已被证实。EGCG棕榈酸酯在保留了EGCG的强抗氧化活性的同时还能作为脂类被小肠吸收，最终到达肝脏，解决了EGCG具有的脂溶性差、在人体内不稳定以及生物利用度低等问题。这使。
7、得EGCG棕榈酸酯具有更好的应用前景，有望进一步开发成治疗抗肝炎病毒的药物。0007已有研究报告表明EGCG棕榈酸酯在预防或治疗感冒病毒、腺病毒、艾滋病毒、乙说明书CN104138371A2/7页4型肝炎病毒等方面都有一定的作用。没有提及其对丙型肝炎病毒感染后的治疗效果。故本发明是针对其新药用价值的发现，为丙型肝炎病毒HCV的预防和治疗提供了一种新的有效药物。发明内容0008针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是在于提供了一种EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用，该药物是一种纯天然化合物的酯修饰物，具有无毒无副作用，在体内稳定等优势，并且有明显的预防和治疗作用，可外涂。
8、、口服等多种给药方式，使用方便。该物质为非核苷类化合物，兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦和副作用，同时不会诱发病毒突变。本发明从细胞和分子层面对EGCG棕榈酸酯抗HCV病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成抗HCV病毒的有效药物而应用于临床的前景。0009为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案0010通过CCK8细胞活性检测与REALTIME荧光定量PCR试验，对前期筛选的有效药物的给药剂量及有效性做出分析。同时采用体外细胞模型HUH7细胞，从直接杀病毒、抑制病毒的吸附与入侵、抑制病毒的复制、影响病毒出。
9、膜等方面研究药物的抗病毒机制。0011研究结果表明EGCG棕榈酸酯在细胞水平上对HCV病毒具有良好的预防病毒感染和抗病毒作用，并且具有一定的抗感染作用，同时在临床上用于抗病毒抗肿瘤有很好的应用基础，表明该药物可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发。从而为临床上丙型肝炎病毒HCV性疾病的治疗提供一种安全有效、毒副作用小的脂溶性药物。为其进一步开发应用奠定了良好的基础。0012相对于目前其他抗HCV病毒药物而言，本发明具有以下优点和效果00131、EGCG棕榈酸酯在较大浓度范围内没有细胞毒性。00142、EGCG棕榈酸酯能够提高细胞对病毒感染的预防作用。00153、EGCG棕榈酸酯能够降低病毒在。
10、细胞中的复制效率，对病毒感染有治疗作用。00164、EGCG棕榈酸酯来源于绿茶中的主要成分，资源广泛，提取和制备相对简单。00175、具有结果稳定，毒副作用小等优点。00186、既有治疗作用，也有预防作用。00197、可口服或外用给药，使用方便。附图说明0020图1为实施例3中用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对HCV病毒预防作用的反应中非结构蛋白NS5B的MRNA水平上表达量的影响。0021图2为实施例3中用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染活性的抑制作用的反应中非结构蛋白NS5B的MRNA水平上表达量的影响。0022图3为实施例3中用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对H。
11、CV病毒感染的治疗作用的反应中非结构蛋白NS5B的MRNA水平上表达量的影响。说明书CN104138371A3/7页5具体实施方式0023下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明请求保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如SAMBROOK等人，分子克隆，实验手册第三版NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS,2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0024以下实施例中0025所用的药物EGCG棕榈酸酯为一种结构式如下的单取代的EGCG棕榈酸酯00260027。
12、上述结构式的单取代的EGCG棕榈酸酯的制备及纯化方法可参考如下文献0028PINGCHENETAL,PURIFICATIONOFLONGCHAINFATTYACIDESTEROFEPIGALLOCATECHIN3OGALLATEBYHIGHSPEEDCOUNTERCURRENTCHROMATOGRAPHY,JOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,98220021631650029所用的HCV病毒为毒株JFH1，来自日本东京神经科学研究所。0030所用细胞HUH7来自中国典型培养物保藏中心武汉大学保藏中心，保藏编号3131C0001000700182。0031细胞培养液为DMEM高糖液。
13、体培养基货号SH3002201B，HYCLONE加入10加入后占总体积的10的胎牛血清FBS，货号10099141，GIBCO。0032细胞维持液为DMEM高糖液体培养基货号SH3002201B，HYCLONE加入2加入后占总体积的2的胎牛血清FBS，货号10099141，GIBCO。0033胰酶货号SH3004201，HYCLONE。0034CCK8试剂盒上海领潮生物科技有限公司，其中的检测液为CCK8检测液。0035荧光定量PCR试剂为BESTARQPCRMASTERMIXSYBRGREEN，货号DBI2043，DBIBIOSCIENCE。0036IFNALPHA1HUMENRECOMBI。
14、NAN干扰素1货号SII2396，SIGMA。0037EGCG棕榈酸酯储存液浓度为50MG/ML。0038实施例1EGCG棕榈酸酯对宿主细胞的毒性测，0039经2448H培养的HUH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100L1105CELL/ML，下同。置于细胞培养箱中培养1824H，使细胞生长成单层备用。将EGCG棕榈酸酯储存液DMSO配置，质量体积比为50MG/ML用细胞维持液逐倍稀释，配置成五个浓度梯度，之后再把不同浓度的药物加入弃去细胞说明书CN104138371A4/7页6培养液的细胞培养孔中，每孔100L，每个浓度重复3孔，同时设立。
15、细胞对照孔不加药，99UL培养液1ULDMSO，空白孔没有细胞，只加细胞培养液，置37，细胞培养箱内，培养48小时后，每孔加CCK8检测液10UL后继续孵育4H后，选择450NM波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式细胞存活率实验孔的OD值空白OD/对照孔的OD值空白OD100，计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。实验结果见表1。0040表1EGCG棕榈酸酯对HUH7细胞毒性试验结果004100420043实验结果表明EGCG棕榈酸酯在04G/ML50G/ML的范围对该细胞没有明显细胞毒性，在显微镜下观察细胞也没有病变发生，并且对细胞的生长还有一定的促进作。
16、用，表明药物的安全性较好由于药物为脂溶性，溶解在DMSO中，所以得到可以作用于细胞的最大药物浓度为50G/ML。0044实施例2HCV对细胞半数感染量TCID50的测定0045将培养成单层的HUH7细胞传至96孔细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养1824H。将病毒原液用细胞维持液10倍连续稀释101108。将培养成单层的HUH7各孔的培养液弃去，每孔PBS洗涤3次，各孔加入不同浓度的病毒稀释液100L，37吸附15H，吸弃病毒稀释液，各孔再补加100L维持液，每个浓度3个重复，设正常细胞对照孔不加病毒。逐日观察各孔细胞病变CPE，连续观察3天，记录CPE情况。然后通过REEDMUENCH两氏法。
17、计算出病毒的细胞半数感染量，换算所得病毒滴度为412105PFU/ML。因此以下实施例中所用病毒的终浓度均为原液的105倍。0046实施例30047EGCG棕榈酸酯对HCV抗病毒作用的实验00481EGCG棕榈酸酯对HCV病毒的预防作用0049经2448H培养的HUH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1ML。置于细胞培养箱中培养1824H，使细胞生长成单层说明书CN104138371A5/7页7备用。将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物加入弃去培养液的细胞培养孔中，每孔1ML，每个浓度重。
18、复3孔，同时设立抗病毒正对照细胞孔加病毒，加IFN1至1000U/ML，加培养液，病毒对照孔不加药，加病毒，加细胞维持液和细胞对照孔不加病毒不加药，只加细胞维持液。药物孵育1H后，弃去上清，用PBS洗三次，加入用细胞维持液稀释的病毒，每孔1ML，37孵育3小时，弃去上清，用PBS洗三次，换新鲜细胞维持液，置于细胞培养箱中37，5CO2培养48H后，检测细胞中HCV的非结构蛋白NS5B的MRNA基因表达量。HCV引物根据文献中HCV在NS5B区基因序列设计PCR引物为0050NS5BF5TCGTATGATACCCGATGCT30051NS5BR5GTTTGACCCTTGCTGTTGA30052提。
19、取细胞里的总MRNA，用REALTIMEPCR检测病毒RNA的表达量，反应条件1、955分钟，为第一步1个循环；2、9510秒，5530秒，7230秒为第二步40个循环。0053将荧光定量结果中病毒对照组的基因表达量默认为1，计算出其它实验组的相对基因表达量，结果如表2。实验数据显示EGCG棕榈酸酯在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。0054表2EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染的预防过程中的基因表达量00550056实验结果表明，细胞在被EGCG棕榈酸酯提前孵育后，再被病毒感染，病毒基因表达量明显低于病毒对照组的，并且随着药物浓度的增高，对HCV感染的预防作用越为明显。根据实验数据显。
20、示EGCG棕榈酸酯在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。其效果与IFN1有可比性。说明书CN104138371A6/7页800572EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染活性的抑制作用0058经2448H培养的HUH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1ML。置于细胞培养箱中培养1824H，使细胞生长成单层备用。将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，稀释后加入细胞维持液稀释的病毒，孵育1H后，加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔1ML，每个浓度重复3孔，置于细胞培养箱中37，5CO2培养48H。同时设立抗病毒正对照。
21、细胞孔加病毒，加IFN1至1000U/ML，加细胞维持液，病毒对照孔不加药，加病毒，加细胞维持液和细胞对照孔不加病毒不加药，只加细胞维持液。置于细胞培养箱中37，5CO2培养48H后，检测细胞中HCV的非结构蛋白NS5B的MRNA基因表达量。方法同上，结果如表3。0059表3EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染活性的抑制作用中的基因表达量006000610062实验结果表明HCV病毒预先与EGCG棕榈酸酯孵育后，感染细胞的活性明显减弱，并且药物的浓度越高，MRNA的表达量越少，药物浓度在50UG/ML时，病毒MRNA的表达量低至99，是实验组的最低值，药物浓度在05UG/ML时表达量升高到2877。
22、。该数据显示EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染细胞的活性有明显的抑制作用。其效果与抗病毒药IFN1有可比性。00633EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染的治疗作用0064经2448H培养的HUH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1ML。置于细胞培养箱中培养1824H，使细胞生长成单层说明书CN104138371A7/7页9备用。将细胞维持液稀释的病毒加入弃去上清的细胞培养孔中，孵育3H后弃上清，将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，加入去上清的培养孔中，每孔1ML，每个浓度重复3孔，置于细胞培养箱中37，5CO2培养。
23、48H。同时设立抗病毒正对照细胞孔加病毒，加IFN1至1000U/ML，加细胞维持液，病毒对照孔不加药，加病毒，加细胞维持液和细胞对照孔不加病毒不加药，只加细胞维持液。48H后提取细胞的总RNA，进行荧光定量PCR反应，方法同上，结果如表4。0065实验结果表明当HCV病毒感染细胞后，EGCG棕榈酸酯对被感染细胞具有很好的治疗作用。0066表4EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染的治疗作用中的基因表达量006700680069实验结果表明当HCV病毒感染细胞后，EGCG棕榈酸酯对细胞的治疗作用也相当明显，感染细胞的基因表达量明显减少，并且在50UG/ML的浓度下，病毒MRNA的表达量只有416，是实验组的最低，且随着药物浓度的降低逐步增加。该数据显示EGCG棕榈酸酯对HCV病毒感染后的细胞具有很好的治疗作用。虽然与IFN1相比效果差一个数量级。但考虑到IFN1的用量为1000U/ML。且为一次性用药IFN1如试验设计为多次用药，效果应该与IFN1有可比性。说明书CN104138371A1/2页10图1图2说明书附图CN104138371A102/2页11图3说明书附图CN104138371A11。