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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610819770.8 (22)申请日 2016.09.13 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 陈争菊 王世强 (74)专利代理机构 北京万象新悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11360 代理人 李稚婷 (51)Int.Cl. A61K 31/708(2006.01) A61P 9/04(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (54)发明名称 次黄嘌呤核苷酸在制。
2、备心肌力增强制剂中 的用途 (57)摘要 本发明公开了次黄嘌呤核苷酸在制备心肌 力增强制剂中的用途。 本发明通过实验发现， 在 食品中作为鲜味剂的次黄嘌呤核苷酸能有效增 强心肌细胞或整体心脏的收缩力， 从而可以作为 一种心肌力增强剂， 成为心力衰竭、 心肌炎、 心梗 等心肌力减弱疾病的治疗成分。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 106420790 A 2017.02.22 CN 106420790 A 1.次黄嘌呤核苷酸在制备心肌力增强剂中的用途。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述心肌力增强剂是用于防治心肌力减弱疾 病的药物。 3.如权利要求2所述的用途， 其特征在。
3、于， 所述心肌力减弱疾病是心力衰竭、 心肌炎和/ 或心梗。 4.一种用于增强心肌力的药物制剂， 包含次黄嘌呤核苷酸作为活性成分， 以及药学上 可接受的辅剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106420790 A 2 次黄嘌呤核苷酸在制备心肌力增强制剂中的用途 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 涉及核苷酸的药物用途， 特别涉及次黄嘌呤核苷酸在制备 增强心肌力的药物制剂中的应用。 背景技术 0002 目前关于次黄嘌呤核苷酸(IMP)的用途， 主要集中在动物与食品科学。 次黄嘌呤核 苷酸又名肌苷酸， 通常作为一种鲜味剂， 用于增加或评价肉类食物的鲜味程度。 0003 19世纪中叶。
4、， 德国的Liebig博士从牛肉汤中分离出肌苷酸； 1913年， 日本的小玉新 太郎证实肌苷酸及其盐类具有鲜味； 1960年利用微生物发酵方法生产肌苷酸和鸟苷酸等核 苷酸类食品增味剂取得成功， 使食品增味剂的生产发展到一个新的水平。 0004 肌苷酸自被发现以来， 国外学者从食品科学、 生物化学、 生理和营养学等角度对其 进行了广泛的研究， 研究结果主要有如下几方面： 己确定肉品中肌苷酸主要来源于A T P的 降解； 影响肌苷酸稳定性的因素主要是温度、 pH和酶的作用； 不同种类的动物肌苷酸的含量 有较大差异； 确定了肌苷酸的化学性质及在食品中的安全性； 确定了肌苷酸与谷氨酸型鲜 味剂的协同作。
5、用及对食品风味的影响； 生理学研究发现， 肌苷酸在口腔的敏感位置主要是 舌后部， 舌咽神经起主要作用， 但对其神经刺激在体内的转导机制有待研究； 在食品工业 中， 已经将肌苷酸作为鲜味增强剂使用。 发明内容 0005 本发明的目的在于探索次黄嘌呤核苷酸在医药领域的新用途， 具体研究其对于心 肌细胞的作用， 以及作为心肌力增强剂的应用。 0006 本发明研究发现， 次黄嘌呤核苷酸(IMP)具有增强心脏正性肌力并不引起心律失 常的的作用， 并通过实验证实了这个作用的机制。 0007 本发明通过采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测IMP对大鼠心肌细胞功能的影 响， 结果显示IMP能增强心肌细胞。
6、的收缩而对心肌细胞钙瞬变没有显著影响。 0008 本发明通过离体心脏灌流实验， 证明了IMP对心脏心功能的影响， 说明IMP直接作 用到心脏可以增强心室收缩压力， 改善心功能。 0009 上述实验说明， 次黄嘌呤核苷酸具有增强心肌细胞或整体心脏的收缩力的作用， 可应用到心肌力增强剂的制备中。 0010 由此， 本发明提供一种用于增强心肌力的药物制剂， 包含次黄嘌呤核苷酸作为活 性成分。 可以将次黄嘌呤核苷酸和药学上可接受的辅剂制成各种形式的药物制剂。 0011 所述 “药学上可接受的辅剂” 包括药学上可接受的载体、 赋形剂、 稀释剂等， 它们与 活性成分次黄嘌呤核苷酸相容。 运用药学上可接受的。
7、辅剂制备药物制剂对本领域普通技术 人员来说是公知的。 本发明的药物制剂包含次黄嘌呤核苷酸作为活性成分， 将次黄嘌呤核 苷酸和药学上可接受的辅剂组合在一起， 配制成各种制剂， 优选为固体制剂和液体制剂。 本 发明的制剂可以为单位剂量形式， 如片剂、 胶囊(包括持续释放或延迟释释放形式)、 栓剂、 说 明 书 1/3 页 3 CN 106420790 A 3 丸剂、 粉剂、 膏剂、 混悬剂、 颗粒剂、 酊剂、 糖浆剂、 乳液剂、 悬浮液、 针剂等各种剂型以及各种 缓释剂型， 从而适合各种给药形式， 例如口服、 非肠道注射、 粘膜、 肌肉、 静脉内、 皮下、 眼内、 皮内或经过皮肤等的给药形式。 0。
8、012 综上， 本发明发现次黄嘌呤核苷酸可以作为一种心肌力增强剂， 它能有效增强心 肌细胞或整体心脏的收缩力， 从而可能成为心力衰竭、 心肌炎、 心梗等心肌力减弱疾病的治 疗成分。 附图说明 0013 图1显示了实施例1采用IonOptix单细胞动缘探测系统同步检测IMP对大鼠心肌细 胞收缩及钙瞬变的结果。 0014 图2显示了实施例2中灌流IMP导致的左心室发展压(LVDP)以及dP/dt(左心室收缩 压每分上升速度)的变化， 说明灌流IMP使离体心脏的收缩功能增强。 具体实施方式 0015 下面通过实施例对本发明做进一步说明， 但不以任何方式限制本发明的范围。 0016 实施例1、 IMP。
9、增强心肌细胞收缩实验 0017 采用IonOptix单细胞动缘检测系统检测细胞功能。 0018 (一)大鼠心肌细胞的分离 0019 台式液： 130mM NaCl， 5.4mM KCl， 0.5mM MgCl2， 25mM Hepes， 0.33mM NaH2PO4， 22mM Glucose， 用NaOH调节pH至7.35。 台式液预先充氧气30分钟以上并在灌流过程中持续充氧。 0020 酶液1： 台式液35mL， 8.75 L CaCl2(0.2M)， II型胶原酶25mg， XIV型蛋白酶3mg； 0021 酶液2： 10mL酶液1， 7.5 L CaCl2(0.2M)； 0022 酶液。
10、3： 15mL酶液1， 50 L CaCl2(0.2M)， BSA 40mg； 0023 复钙液： 台式液20mL， 100 L CaCl2(0.2M)， BSA 40mg。 0024 大鼠用20乌来糖溶液麻醉(1mL/100g)， 待动物麻醉后， 打开胸腔， 取出心脏。 待 心脏在冷冻台式液中排除残留血液后， 将主动脉插入langendoff灌流管前端针头， 并用细 线结扎。 使用循环水浴系统维持灌流液恒温37， 灌流速度为3mL/min。 先用无钙台式液灌 流液将心脏内部血液排除后， 再用酶液1灌流。 用酶液2灌流循环大约15分钟， 待心脏变软时 将左心室剪下(不要心房及右心室)并在37酶。
11、液3中剪碎。 剪碎的心肌组织和酶液3混悬后 在离心机上以500rpm的速度离心1分钟， 去除酶液， 用复钙液重悬细胞沉淀。 组织碎渣继续 与酶液3混悬后500rpm离心1分钟， 去酶液， 用复钙液重悬细胞沉淀， 重复3次， 至碎渣没有细 胞为止。 将几次重悬细胞的收集液合并， 静置30分钟使细胞沉淀， 吸掉上清， 加入适量复钙 液重悬细胞即可用于后续实验。 0025 (二)采用IonOptix单细胞动缘探测系统(IonOptix公司， 美国)同步检测心肌细胞 收缩及钙瞬变(Ca2+transient)。 0026 将Fura-2/AM(终浓度2 g/mL)与心肌细胞室温避光孵育30min， 采。
12、用双激发荧光光 电倍增系统(IonOptix， 美国)检测荧光信号。 75W紫外氙光灯发射的光通过340nm或380nm的 滤光片到达0.5Hz刺激下收缩的心肌细胞， 细胞内与游离Ca2+结合的荧光物质被激发， 其发 射光在510nm处被检测并通过光电倍增管记录。 细胞相继迅速被340nm和380nm激发光照射 说 明 书 2/3 页 4 CN 106420790 A 4 并交替扫描， 细胞内游离Ca2+浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率所反映。 0027 取孵育Fura-2/AM的适量(一般30 l)心肌细胞悬液置于倒置显微镜(Olympus)载 物台上的细胞灌流小室内， 以含氧台氏液灌。
13、流(1mL/min)， 0.5Hz、 5ms波宽的电场刺激， 场刺 激由灌流小室底部两侧镶嵌的铂电极产生， 细胞收缩影像通过40物镜传输到IonOptix的 MyoCam照相系统并呈现在监视器上。 心肌细胞肌小节(sarcomere)收缩幅度和收缩/舒张速 度等指标由计算机自动实时采集并记录。 细胞进入灌流小室后， 立即下沉并与小室底部很 快粘附， 灌流液在常规速度不能将其冲走。 选取长杆状、 细胞边缘折光性好， 横纹清晰， 细胞 膜上无空泡的心室肌细胞进行实验观察。 给药前细胞收缩幅度恒定至少5min以上。 系统记 录的结果如图1所示， 实验中所用的IMP的浓度为10-4M。 0028 统计。
14、时以未给药前细胞肌小节收缩幅度值为基础值， 加药后， 系统记录到细胞收 缩的幅度值与基础值比较所得的值来反应加药后对心肌细胞的影响， 如图1所示。 从图1可 以看出， IMP灌流后心肌细胞的收缩幅度增强。 0029 实施例2、 离体心脏灌流检测IMP对心脏心功能的影响 0030 Krebs-Henseleit(K-H)灌流液： NaCl 118.0mmol/L、 KCI 4.7mmol/L、 KH2PO4 1.2mmol/L、 MgSO47H2O 1.2mmol/L、 CaCl2 2.5mmol/L、 NaHCO3 2.5mmol/L、 Glucose 11.1mmol/L。 0031 大鼠用。
15、20乌来糖溶液麻醉(0.5mL/100g)， 待动物麻醉后， 舍下静脉注射肝素， 打 开胸腔， 迅速取出心脏置于4的Krebs-Henseleit(K-H)灌流液中， 轻轻挤压心脏， 排空心 脏内残留的血液， 立即将主动脉固定于langendorff灌流装置的插管上， 经三通管开关接K- H灌流液， 灌流液以95O2和5CO2充分饱和、 灌流压力约70mmHg， 灌流温度为37左右。 从 左心耳插入尖端带有水囊的导管， 调节水囊充水程度， 使心脏的前负荷在10mmHg以内， 通过 压力传感器接MedLab生物信号釆集处理系统记录左心室内压力曲线， 采集各心功能指标。 0032 首先用Krebs。
16、-Henseleit(K-H)灌流液灌流心脏至少10min， 待心脏稳定收缩舒张 后， 通过三通管开关调节灌流IMP， 同时检测心功能变化， 结果如图2所示， 可以看出Krebs- Henseleit(K-H)灌流液灌流后， 离体心脏心室收缩舒张压力变化平稳， 如图2中A段所示， 灌 流IMP后， 离体心脏心室收缩最大压力增强， 如图2中B段所示； 心脏每分钟收缩压变化(dP/ dt部分)也增强， 说明心脏灌流IMP后， 心脏收缩能力增强， 心功能改善。 说 明 书 3/3 页 5 CN 106420790 A 5 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 6 CN 106420790 A 6 。